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Artigo de método

Um pipeline de mistura para gerar unidades taxonômicas operacionais moleculares (MOTUs) entre besouros ribeirinhos e aquáticos

914 vistas

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DOI:

10.3791/68323

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11 de julho de 2025

 ,  , 
1Ateneo Biodiversity Research Laboratory, Department of Biology, School of Science and Engineering, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University, 2Ateneo Institute of Sustainability, Ateneo de Manila University, 3Ateneo School of Medicine and Public Health, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University

Neste artigo

Resumo

O protocolo aqui apresentado visa orientar os usuários sobre o processamento baseado em computador de sequências gênicas da subunidade I (COI) do citocromo c oxidase geradas a partir de besouros, de modo que a hipótese de agrupamento de espécies denominada unidades taxonômicas operacionais moleculares (MOTUs) possa ser gerada a partir do DNA.

Resumo

O declínio da biodiversidade está ocorrendo a taxas inimagináveis, mas o monitoramento da biodiversidade é dificultado por uma infinidade de fatores, incluindo o inventário incompleto da diversidade de linha de base e a diminuição da população de taxonomistas qualificados. Preencher esse impedimento no inventário de espécies de "táxons escuros", ou grupos hiperdiversos frequentemente pouco estudados em taxonomia, é particularmente crucial nos trópicos que enfrentam pressões ambientais intransponíveis. Embora a alfataxonomia baseada em morfologia continue sendo o padrão-ouro na identificação de espécies, os métodos baseados em DNA têm mostrado um tremendo potencial na aceleração do delineamento e descoberta de espécies. Aqui, descrevemos um pipeline de mistura para gerar unidades taxonômicas operacionais moleculares (MOTUs) envolvendo seis abordagens de delimitação de espécies moleculares implementadas em dois gêneros de besouros altamente discretos, a saber, Byrrhinus Motschulsky, 1858 da família Limnichidae e Anacaena Thomson, 1859 da família Hydrophilidae, das Filipinas. Como este protocolo se concentra no processamento de códigos de barras de DNA e dado que esses dados genéticos podem ser obtidos por sequenciamento ou download de bancos de dados online, o ponto de partida para o protocolo descrito aqui são as sequências de DNA. Dados os códigos de barras COI, o pipeline utiliza uma combinação de três abordagens de delimitação de espécies moleculares baseadas em limiar, ou seja, TaxonDNA, K2P e ASAP, que usam alinhamento de sequência como dados de entrada. Além disso, o pipeline prossegue com três abordagens baseadas em coalescência, ou seja, PTP-ML, PTP-BI e mPTP, que requerem um arquivo de árvore como dados de entrada. Algumas abordagens envolvem o uso de servidores web, enquanto outras utilizam software local. Com a seleção dos métodos algorítmicos apresentados, os MOTUs podem ser identificados, seja por consenso ou por maioria. Notavelmente, este oleoduto delineou espécies de besouros quase conspícuas das Filipinas, mesmo aquelas documentadas na mesma localidade ou em localidades adjacentes.

Introdução

Com as taxas sem precedentes de declínio global de espécies em vários táxons 1,2,3,4, o ímpeto para criar um inventário abrangente da biodiversidade, que inclui espécies anteriormente desconhecidas e não descritas, torna-se uma corrida contra o tempo 2,5. Por um lado, a conservação da biodiversidade só faz sentido à luz do conhecimento taxonômico adequado 6,7. Assim, a identificação da biodiversidade no nível das espécies é necessária, uma vez que espécies intimamente relacionadas, mas diferentes, podem ter nichos fundamentais únicos8.

Na sistemática de besouros, a alfa-taxonomia ou taxonomia tradicional é o padrão-ouro na identificação de espécies semelhante à maioria, senão a todos, os grupos de animais9. Essa abordagem se baseia em caracteres morfológicos para classificar organismos em taxonomia mais alta e fornecer identificação no nível de espécie10,11. Em muitos casos, a identificação em nível de família12 ou mesmo de gênero13 pode ser feita usando apenas características morfológicas externas, como forma corporal e adaptações especializadas. Enquanto isso, a identificação em nível de espécie em besouros geralmente é feita por meio da comparação dos detalhes estruturais do edeago ou da genitália masculina 14,15,16.

Apesar da ampla aceitação dessa alfa-taxonomia baseada na morfologia, essa abordagem para a descoberta de espécies é dificultada por vários "impedimentos taxonômicos" 6 , 17 , 18 , especialmente entre os invertebrados19 . Na sistemática de besouros, a identificação e / ou descoberta de espécies usando alfa-taxonomia enfrenta os desafios de ter um número limitado de taxonomistas qualificados20,21, de descrições anteriores breves e pouco informativas22 e de problemas logísticos relacionados ao acesso à literatura e espécimes-tipo23.

Isso é ainda mais exacerbado quando o táxon em questão é enigmático ou altamente imperceptível. Espécies crípticas referem-se ao conjunto de espécies de um mesmo gênero, ou mesmo de gêneros diferentes, que não podem ser facilmente delineadas por morfologia comparativa, dadas as sutis diferenças fenéticas interespecíficas24. Alguns táxons crípticos, considerados 'táxons escuros'25,26,27, também sofrem por serem hiperdiversos, mas muito pouco estudados. Infelizmente, isso não é incomum em besouros ribeirinhos e aquáticos 8,28. A falha em abordar o delineamento de espécies entre táxons escuros crípticos ameaça a biodiversidade, pois uma medida de conservação única é dada a organismos de nichos e requisitos ecológicos potencialmente diferentes 8,29.

Dados esses desafios, a 'taxonomia integrativa'23, ou a abordagem de acoplar a taxonomia alfa com outra linha de evidência, ganhou força como meio de erigir novas espécies nas últimas duas décadas 30,31,32. Uma dessas linhas de evidência usadas em estudos taxonômicos integrativos em besouros 33,34,35,36,37,38,39 e outras ordens de insetos 40,41,42,43,44,45 é a sequência de DNA. Em particular, o gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade I (COI) está sendo usado para codificar um conjunto diversificado de animais devido à sua natureza moderadamente conservadora 46,47,48. Enquanto sua extremidade 5 'de 658 pb de comprimento (COI-5 '), também conhecida como 'fragmento de código de barras' ou 'fragmento de Folmer', foi proposta como a sequência 'diagnóstica'49, o COI-3 ′ de 723 pb de comprimento também está sendo usado devido a um conjunto robusto de primers para a extremidade 3 '50,51,52.

Enquanto o código de barras de DNA usando COI foi concebido para identificação em nível de espécie, ele é limitado por um repositório de sequências a priori 53, como GenBank54 e BOLD55, as abordagens de delimitação de espécies moleculares estabelecem limites de espécies usando apenas as sequências de DNA fornecidas sem repositório de pré-requisitos56. Existem duas classes de abordagens de delimitação de espécies moleculares com base no arquivo de entrada. Primeiro, usando o alinhamento de sequência como entrada, as abordagens baseadas em limites usam valores de corte para determinar a divergência entre e dentro das espécies 48,57,58. Como métodos baseados em distância, essas abordagens dependem de uma distância intraespecífica máxima observada de 3% para insetos, que está sendo chamada de 'lacuna de código de barras' 51 , 59 . Algumas das abordagens baseadas em limites são SpeciesIdentifier implementado no TaxonDNA60, distância genética via Kimura 2-parameter (K2P)61 e Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP)62.

Em segundo lugar, usando a árvore como arquivo de entrada, as abordagens baseadas em coalescência identificam os limites das espécies e classificam linhagens independentes, determinando a mudança na taxa de ramificação da linhagem 63,64,66. Muitas vezes contando com o conceito de espécie filogenética67, as abordagens baseadas em coalescência incluem processos de árvore de Poisson (PTP) 68 e sua variação, PTP69 de taxa múltipla. Em qualquer caso, os clusters formados pelas abordagens de delimitação de espécies moleculares são coletivamente referidos como unidades taxonômicas operacionais moleculares (MOTUs).

Aqui, apresentamos métodos para um pipeline de mistura para gerar MOTUs envolvendo três abordagens baseadas em limites e três abordagens baseadas em coalescência (Figura 1). O pipeline é testado em dois conjuntos de dados, a saber: (1) sequências COI-3 ′ dos besouros ribeirinhos Byrrhinus Motschulsky, 1858, que é composto por duas espécies publicadas35 previamente erguidas usando taxonomia integrativa e sequências adicionais de espécies não descritas, e (2) sequências COI-5 ′ de besouros Anacaena Thomson, 1859, que é composto por sequências de duas espécies publicadas70 previamente erguido usando alfa-taxonomia e sequências adicionais de espécies não descritas.

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Figura 1: Fluxograma do pipeline de mistura para geração de MOTUs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Os materiais de partida para esse pipeline de mistura são sequências de DNA, que podem ser baixadas de repositórios online (por exemplo, BOLD, GenBank) ou geradas a partir do sequenciamento Sanger71. A Tabela 1 e a Tabela 2 listam os números de acesso para os conjuntos de dados cujos resultados representativos são apresentados neste artigo.

1. Etapa preparatória para abordagens baseadas em limiares: alinhamento de sequências

  1. Sequências de carga em MEGA X72.
    NOTA: O MEGA X pode ser baixado do https://www.megasoftware.net/
    1. Clique em Alinhar para abrir um menu suspenso. Clique em Editar/Construir alinhamento e selecione Criar um novo alinhamento. Clique em OK para confirmar esta seleção. Selecione DNA como o tipo de dados para alinhamento.
    2. Passe o mouse sobre a guia Editar e selecione Inserir sequência do arquivo. Navegue até o diretório com as sequências e selecione-as para serem carregadas no MEGA.
  2. Alinhe as sequências clicando em Alinhamento e, em seguida, em Alinhar por ClustalW73. Continue com as configurações padrão e clique em OK.
  3. Edite manualmente as sequências cortando ambas as extremidades e limpando quaisquer inserções ou exclusões.
    1. Para excluir inserções, clique nas bases e/ou posições inseridas e pressione Delete no teclado.
    2. Para corrigir exclusões, clique na posição que deveria ter sido excluída, conforme indicado por "-". Exclua o "-" e digite a base pretendida.
    3. Encontre a posição mais antiga em que todas as sequências têm um caractere. Clique na caixa em branco no cabeçalho da linha da posição à esquerda da posição determinada e arraste até que as posições excedentes de todas as sequências até o final inicial sejam selecionadas. Pressione Delete para cortar.
    4. Repita a etapa 1.3.3 procurando a última posição em que todas as sequências têm um caractere. Clique na caixa em branco na linha de cabeçalho da posição à direita da posição determinada, arraste até que as posições excedentes para todas as sequências até que a extremidade do terminal sejam selecionadas. Pressione Excluir.
      NOTA: A Figura 2A mostra um bom alinhamento das sequências de DNA. O conjunto de dados final é uma matriz de sequências de igual comprimento; portanto, o comprimento da sequência não é um fator que afeta os resultados do estudo. As sequências de referência servem como base para o comprimento final da matriz de alinhamento.
  4. Traduza a sequência para verificar se há códons de parada, dado que COI é uma sequência codificadora de proteína.
    1. Selecione todas as sequências e clique na guia Sequências de proteínas traduzidas .
    2. Quando solicitado, verifique o código genético como Mitocôndrial Invertebrado. Se o código genético for diferente, clique em Não e um menu aparecerá permitindo marcar a caixa para Código genético mitocondrial de invertebrados .
    3. Se os códons de parada, conforme indicado por asteriscos no corpo do alinhamento, estiverem presentes em uma coluna inteira, clique em Sequências de DNA e exclua a primeira posição de todas as sequências.
    4. Repita a etapa anterior se os códons de parada ainda estiverem presentes em qualquer sequência.
    5. Se os códons de parada ainda estiverem presentes, restaure as posições excluídas anteriormente. Selecione todas as sequências, passe o mouse sobre a guia Dados e clique em Inverter.
    6. Repita a etapa 1.4.1. Se os códons de parada ainda estiverem presentes, repita as etapas 1.4.3 e 1.4.4.
      NOTA: A Figura 2B mostra um bom alinhamento de códons.
  5. Clique em Sequências de DNA e salve o alinhamento da sequência em .mas/x. Exporte a sequência para outros tipos de arquivo pertinentes, como arquivo .meg e arquivo .fasta.
    NOTA: Certas abordagens de delimitação de espécies moleculares funcionam melhor sem o grupo externo. Assim, uma possível consideração é gerar uma cópia do arquivo de alinhamento sem o grupo externo.

figure-protocol-1
Figura 2: Alinhamento de sequência no MEGA X. (A) Alinhamento final da sequência de DNA limpo manualmente e (B) alinhamento da sequência de proteínas traduzido do conjunto de dados Byrrhinus sem inserções, deleções e lacunas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Delimitação pelo módulo Taxon DNA no Identificador de Espécies 1.8

NOTA: O identificador de espécie pode ser baixado de https://taxondna.sourceforge.net/

  1. Abra o TaxonDNA. Clique em Importar e, em seguida, clique em FASTA. Carregue o alinhamento no formato .fasta.
  2. Clique em Módulos e clique em Cluster. Defina o limite como 3%. Em seguida, marque Gerar informações sobre o cluster individual (Figura 3).
  3. Clique em Criar clusters agora!. Salve os resultados fazendo uma captura de tela.

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Figura 3: TaxonDNA na janela Species Identifier 1.8 mostrando o limite de 3% identificado pelo usuário para delimitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Delimitação por Kimura 2-parameter (K2P) em MEGA X

  1. No MEGA, abra o arquivo .meg clicando em Arquivo e, em seguida, em Abrir um arquivo/sessão. Clique em Distância e, em seguida, clique em Calcular distâncias em pares. Confirme o arquivo .meg para delimitação.
  2. Passe o mouse sobre a caixa amarela ao lado de Modelo/Método e clique na seta que aparece à direita da caixa.
  3. Selecione Modelo de 2 parâmetros Kimura no menu suspenso. Clique em Ok para executar o programa. Abra a janela de saída de dados (Figura 4).
  4. Clique em Arquivo e, em seguida, em Exportar/Imprimir Distâncias.
  5. Abra o menu suspenso ao lado de Formato de saída e selecione XL: Pasta de trabalho do Microsoft Excel. Em Casas decimais, escolha 4.
  6. Salve a planilha resultante no Microsoft Excel. Use a Formatação condicional para destacar aqueles com uma distância inferior a 0,03 (ou 3%).
    OBSERVAÇÃO: Ao contrário das outras abordagens discutidas neste artigo, o K2P não fornece imediatamente o clustering porque ele depende do limite identificado pelo usuário. Este pipeline está trabalhando com a suposição de que o limite seja de 3%, o que significa que qualquer par de sequências cuja distância genética seja inferior a 3% pertence ao mesmo cluster molecular.

figure-protocol-3
Figura 4: Janela resultante no MEGA X mostrando os resultados do parâmetro Kimura-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Delimitação por Montar Espécies por Particionamento Automático (ASAP)

  1. Vá para o servidor web o mais rápido possível: https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
  2. Carregue o alinhamento clicando na caixa laranja rotulada Escolha um arquivo... e selecionando o arquivo .fasta. Como alternativa, arraste o arquivo .fasta para a caixa laranja. Role para baixo e clique em Ir.
  3. Para baixar o clustering, clique na lista para a linha com a pontuação ASAP mais baixa e a classificação p-val mais alta (Figura 5).
    NOTA: A saída do resultado é um arquivo .txt, que apresenta subconjuntos dos aglomerados moleculares.

figure-protocol-4
Figura 5: Janela resultante no ASAP mostrando as possíveis delimitações. O primeiro resultado (caixa azul) é aceito devido à pontuação mais baixa do ASAP (caixa vermelha) e à classificação P-val mais alta (caixa amarela). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Etapa preparatória para abordagens baseadas em coalescência: estimativa de árvores

  1. Abra o arquivo .meg clicando em Dados e, em seguida, em Abrir um arquivo/sessão. Teste o modelo de substituição mais adequado.
    1. Clique em Modelos e encontre Melhores Modelos de DNA/Proteína (ML). Confirme o arquivo .meg para análise.
    2. Clique em Ok no menu Preferências de Análise (Figura 6A). Anote o melhor modelo usando o menor valor BIC e AICc (Figura 6B).
      NOTA: Este é geralmente o primeiro na lista de modelos na janela resultante. Consulte os nomes completos dos nomes de modelo abreviados na parte inferior da janela resultante.
  2. Gere a árvore.
    1. Clique em Filogenia e, em seguida, em Construir/Testar Árvore de Máxima Verossimilhança.
    2. Use o modelo de substituição de nucleotídeos de melhor ajuste. Faça isso clicando na caixa amarela ao lado de Modelo/Método. Selecione o modelo no menu suspenso.
    3. Se o modelo de substituição de nucleotídeos mais adequado tiver '+G' ou '+I' ou ambos, clique na caixa ao lado de Taxas entre sites e selecione os parâmetros (G, I, G + I) no menu suspenso (Figura 6C).
    4. Em Teste de Filogenia, clique na caixa ao lado de Teste de Filogenia e selecione Método Bootstrap no menu suspenso. Clique na caixa ao lado de "Não. de Replicações de Bootstrap" e digite 1000 (Figura 6C). Clique em Ok para executar a análise.
  3. Quando uma janela for aberta contendo a árvore resultante (Figura 6D), salve a sessão da árvore como .mts/x. Salve a saída como arquivo .nwk. Salve também a árvore como .png arquivo de imagem.

figure-protocol-5
Figura 6: Estimativa de árvore no MEGA X como uma etapa preparatória para abordagens baseadas em coalescência. (A) Configuração para determinar o modelo de substituição de nucleotídeos mais adequado. (B) Para o conjunto de dados de Byrrhinus , o modelo mais adequado é GTR + I devido aos valores mais baixos de BIC e AICc (caixa vermelha). (C) Na execução da árvore de máxima verossimilhança, GTR (caixa amarela) + I (caixa azul) foram definidos como parâmetros. (D) A árvore ML bruta resultante a ser usada nas análises subsequentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Delimitação por Processos de Árvore de Poisson (PTP)

NOTA: As etapas abaixo produzirão os resultados de PTP-ML e PTP-BI.

  1. Vá para o servidor web PTP: https://species.h-its.org/ptp/
  2. Carregue um arquivo newick clicando em Escolher arquivo. Em Minha árvore é, selecione Enraizado (Figura 7A).
  3. Insira os parâmetros para a análise. Em No. Gerações MCMC, insira 100000. Em Desbaste, insira 100. Em Burn-in, insira 0.1. Em Semente, insira 123.
  4. Insira o grupo externo digitando o nome das pontas na caixa em Nomes de táxons do grupo externo (se houver). As instruções para formatar a entrada estão à direita da caixa de entrada.
  5. Insira o endereço de e-mail no campo correspondente e clique em Enviar. Na janela de resultados de delimitação de espécies PTP, clique aqui para abrir a janela de resultados.
  6. Na solução Máxima verossimilhança, baixe os resultados do PTP-ML clicando em Baixar resultados de delimitação (Figura 7B).
  7. Na solução com suporte Bayesiano, baixe os resultados do PTP-BI clicando em Baixar resultados de delimitação.
    NOTA: Os resultados indicariam grupos de sequências em partições. Estes serão rotulados como espécies numeradas seguidas por um valor de suporte, em que 1.000 é o ideal.

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Figura 7: Delimitação de espécies moleculares por processos de árvore de Poisson. (A) Janelas mostrando os parâmetros de entrada. (B) Janela resultante no servidor web PTP, com link contendo resultados de delimitação (caixa vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Delimitação por Processos de Árvore de Poisson Multi-taxa (mPTP)

  1. Vá para o servidor web mPTP: https://mptp.h-its.org/#/tree
  2. Carregue o arquivo newick arrastando-o para o retângulo cinza ou clicando no retângulo. Depois que os dados forem carregados na mesma página, clique em Prosseguir para a seleção do grupo externo (Figura 8A).
  3. Na página de especificação do grupo externo , selecione o grupo externo clicando na caixa ao lado dos rótulos dos táxons dos espécimes do grupo externo. Clique na opção Cortar grupo externo na parte inferior da sequência. Clique em Seleção de modelo.
  4. Clique em MPTP e, em seguida, clique em Opções de visualização. Na página Opções de visualização , aceite as configurações padrão.
    NOTA: Como alternativa, o tamanho total da imagem pode ser ajustado inserindo um valor (em px) em largura SVG. A fonte e o espaçamento do texto podem ser ajustados inserindo os tamanhos desejados (em px) em Tamanho da fonte SVG, Espaço entre as pontas, Margem esquerda, Margem direita, Margem superior e Margem inferior.
  5. Clique em Detalhes de contato. Insira o endereço de e-mail para referência futura dos resultados (opcional).
  6. Clique em Visão geral. Certifique-se de revisar o número de entradas de táxons e os grupos externos selecionados.
  7. Clique em Enviar. Clique com o botão direito do mouse nos arquivos em Arquivos para download (Figura 8B) e selecione Salvar como... para salvar os resultados.
    NOTA: O arquivo de texto de saída indicará o número total de espécies delimitadas no início dos resultados. Em seguida, apresentará quais sequências se enquadram em cada um dos clusters. Esses clusters e sequências correspondentes são organizados de forma semelhante à árvore gerada no arquivo .svg. O arquivo SVG mPTP exibirá o agrupamento das sequências. Os clusters são apresentados por grupos de sequências conectadas por galhos vermelhos ao longo da árvore. Cada conjunto isolado de ramos vermelhos indica um MOTU singular.

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Figura 8: Delimitação de espécies moleculares por processos de árvore de Poisson multi-taxa. (A) Janelas mostrando as informações de leitura de mPTP sobre a árvore carregada. (B) Janela resultante no servidor web mPTP, com link contendo resultados de delimitação (caixa vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Geração MOTU

  1. Abra a árvore usando um programa de edição de fotos ou usando o PowerPoint.
  2. Crie uma barra para representar os resultados de cada abordagem de delimitação de espécies moleculares (consulte a Figura 9 e a Figura 10 para amostras). Certifique-se de que qualquer barra única esteja alinhada com as sequências que inclui em seu cluster molecular.
  3. Determine o MOTU por uma dessas duas abordagens74
    1. Se todas as abordagens gerarem resultados idênticos para um determinado cluster molecular, erija o cluster molecular como um MOTU por consenso.
    2. Se a maioria das abordagens gerar resultados idênticos para um determinado aglomerado molecular, erija o aglomerado molecular como um MOTU por maioria.

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Resultados

Este artigo implementou um pipeline de mistura de delimitação de espécies moleculares, que inclui TaxonDNA, K2P, ASAP, duas variações de PTP e mPTP, para besouros aquáticos e ribeirinhos. O resultado de cada uma das seis abordagens é referido como 'clusters moleculares', enquanto o resumo é referido como 'unidades taxonômicas operacionais moleculares' ou MOTUs75.

O pipeline de mistura foi testado em dois conjuntos de dados. O primeiro conjunto de dados (Tabela 1...

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Discussão

Embora as sequências de DNA, especialmente COI49, possam ser comparadas com sequências de referência 22,53,78 em repositórios públicos online 54,55,79,80 para um sistema de bioidentificação46, tal abordagem é limitada pel...

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Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Bureau de Pesca e Recursos Aquáticos (BFAR) e às unidades do governo local em questão por nos concederem consentimento prévio informado para realizar a amostragem de biodiversidade. Agradecemos ao Dr. Hendrik Freitag pela orientação sobre o trabalho taxonômico. Também agradecemos aos revisores e editores por seus comentários úteis e construtivos. Por fim, expressamos nossa maior gratidão ao University Research Council Big Project Grant (URC 2022-09) e ao Open Access Publication Grant da Ateneo de Manila University, ao SC Johnson Student Research and Development Fund for Environmental Leadership do Ateneo Research Institute of Science and Engineering e ao LinnéSys: Systematics Research Fund da Linnean Society of London e à Systematics Association por financiar este estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
O MAIS RÁPIDO POSSÍVEL Explorador de partehttps://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
ComputadorQualquer unidade de processamento
MEGA X MEGA Softwarehttps://www.megasoftware.net/
Servidor web mPTPhttps://mptp.h-its.org/#/tree
Servidor web PTPInstituto de Estudos Teóricos de Heidelberg (HITS)https://species.h-its.org/ptp/
Identificador de Espécie   https://taxondna.sourceforge.net/

Referências

  1. Ceballos, G., Ehrlich, P. R. Mammal population losses and the extinction crisis. Science. 296 (5569), 904-907 (2002).
  2. Dirzo, R., et al. Defaunation in the Anthropocene. Science. 345 (6195), 401-406 (2014).
  3. Cardoso, P., et al. Scientists' warning to humanity on insect extinctions. Biol Conserv. 242, 108426(2020).
  4. Wagner, D. L., Grames, E. M., Forister, M. L., Berenbaum, M. R., Stopak, D. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (2), 1-10 (2021).
  5. Steffen, W., Crutzen, P. J., McNeill, J. R. Welcome to the Anthropocene. Ambio. 36 (8), 614-621 (2007).
  6. de Carvalho, M. R., et al. Taxonomic impediment or impediment to taxonomy? A commentary on systematics and the cybertaxonomic-automation paradigm. Evol Biol. 34 (3-4), 140-143 (2007).
  7. Satler, J. D., Carstens, B. C., Hedin, M. Multilocus species delimitation in a complex of morphologically conserved trapdoor spiders (Mygalomorphae, Antrodiaetidae, Aliatypus). Syst Biol. 62 (6), 805-823 (2013).
  8. Arribas, P., Andújar, C., Sánchez-Fernández, D., Abellán, P., Millán, A. Integrative taxonomy and conservation of cryptic beetles in the Mediterranean region (Hydrophilidae). Zool Scr. 42 (2), 182-200 (2013).
  9. Baker, K., et al. Carpooling with ecologists, geographers and taxonomists: Perceptions from conducting environmental research in tropical regions. Biodivers Conserv. 28 (4), 975-981 (2019).
  10. Tan, D. S. H., Ang, Y., Lim, G. S., Bin Ismail, M. R., Meier, R. From "cryptic species" to integrative taxonomy: An iterative process involving DNA sequences, morphology, and behaviour leads to the resurrection of Sepsis pyrrhosoma (Sepsidae: Diptera). Zool Scr. 39 (1), 51-61 (2010).
  11. Tan, M. K., Storozhenko, S. Y., Hwang, W. S., Meier, R. Integrative taxonomy reveals two sympatric species of the genus Eucriotettix Hebard, 1930 (Orthoptera: Tetrigidae). Zootaxa. 4268 (3), 377-394 (2017).
  12. Yule, C. M. Freshwater invertebrates. Freshwater Invertebrates of the Malaysian Region. , 23-31 (2004).
  13. Komarek, A., Jäch, M. A., Ji, L. Hydrophilidae: I. Check list and key to Palearctic and Oriental genera of aquatic Hydrophilidae (Coleoptera). Water Beetles of China. 3, 383-395 (2003).
  14. Rudoy, A., Ribera, I. The macroevolution of size and complexity in insect male genitalia. PeerJ. 4, e1882(2016).
  15. Rudoy, A., Beutel, R. G., Ribera, I. Evolution of the male genitalia in the genus Limnebius Leach, 1815 (Coleoptera, Hydraenidae). Zool J Linn Soc. 178, 97-127 (2016).
  16. Shapiro, A. The lock-and-key hypothesis: Evolutionary and biosystematic interpretation of insect genitalia. Annu Rev Entomol. 34 (1), 231-245 (1989).
  17. Scotland, R., Hughes, C., Bailey, D., Wortley, A. The big machine and the much-maligned taxonomist. Syst Biodivers. 1 (2), 139-143 (2003).
  18. Vinarski, M. V. Roots of the taxonomic impediment: Is the "integrativeness" a remedy. Integr Zool. 15 (1), 2-15 (2020).
  19. Cardoso, P., Erwin, T. L., Borges, P. A. V., New, T. R. The seven impediments in invertebrate conservation and how to overcome them. Biol Conserv. 144 (11), 2647-2655 (2011).
  20. Engel, M. S., et al. The taxonomic impediment: A shortage of taxonomists, not the lack of technical approaches. Zool J Linn Soc. XX, 1-7 (2021).
  21. Tancoigne, E., Dubois, A. Cladistics taxonomy: No decline, but inertia. Cladistics. , 1-4 (2013).
  22. Riedel, A., Sagata, K., Suhardjono, Y. R., Tänzler, R., Balke, M. Integrative taxonomy on the fast track: Towards more sustainability in biodiversity research. Front Zool. 10 (15), 1-9 (2013).
  23. Dayrat, B. Towards integrative taxonomy. Biol J Linn Soc. 85 (3), 407-415 (2005).
  24. Bickford, D., et al. Cryptic species as a window on diversity and conservation. Trends Ecol Evol. 22 (3), 148-155 (2007).
  25. Page, R. D. M. DNA barcoding and taxonomy: Dark taxa and dark texts. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1702), 20150334(2016).
  26. Morinière, J., et al. A DNA barcode library for 5,200 German flies and midges (Insecta: Diptera) and its implications for metabarcoding-based biomonitoring. Mol Ecol Resour. 19 (4), 900-928 (2019).
  27. Hartop, E., Srivathsan, A., Ronquist, F., Meier, R. Towards large-scale integrative taxonomy (LIT): Resolving the data conundrum for dark taxa. Syst Biol. 71 (6), 1404-1422 (2022).
  28. Fossen, E. I., Ekrem, T., Nilsson, A. N., Bergsten, J. Species delimitation in northern European water scavenger beetles of the genus Hydrobius (Coleoptera, Hydrophilidae). ZooKeys. 564, 71-120 (2016).
  29. Bálint, M., et al. Cryptic biodiversity loss linked to global climate change. Nat Clim Change. 1 (6), 313-318 (2011).
  30. Padial, J. M., De La Riva, I. A response to recent proposals for integrative taxonomy. Biol J Linn Soc. 101 (3), 747-756 (2010).
  31. Andújar, C., Arribas, P., Ruiz, C., Serrano, J., Gómez-Zurita, J. Integration of conflict into integrative taxonomy: Fitting hybridization in species delimitation of Mesocarabus (Coleoptera: Carabidae). Mol Ecol. 23 (17), 4344-4361 (2014).
  32. Schlick-Steiner, B. C., et al. Integrative taxonomy: A multisource approach to exploring biodiversity. Annu Rev Entomol. 55 (1), 421-438 (2010).
  33. Stüben, P. E., Astrin, J. J. Integrative taxonomy, phylogeny, and new species of the weevil genus Onyxacalles Stüben (Coleoptera: Curculionidae: Cryptorhynchinae). Psyche (Lond). 2012, 1-22 (2012).
  34. Hawlitschek, O., et al. Pleistocene climate change promoted rapid diversification of aquatic invertebrates in Southeast Australia. BMC Evol Biol. 12 (142), 1-15 (2012).
  35. Delocado, E. D., Freitag, H. Two new species of Byrrhinus Motschulsky, 1858 (Coleoptera, Limnichidae, Limnichinae) from Negros, Philippines. ZooKeys. 1070, 51-72 (2021).
  36. De Vera, G. C. M., Sia, J. I. L., Freitag, H., Delocado, E. D. The first new species of Leptelmis Sharp, 1888 (Coleoptera, Elmidae) from the Philippines in the last 50 years. Tijdschr Entomol. 166 (2-3), 175-186 (2023).
  37. Seno, C. B. N., Delocado, E. D., Freitag, H. Three new species of Ancyronyx Erichson, 1847 (Coleoptera, Elmidae) from Mindanao, Philippines. Tijdschr Entomol. 72, 61-80 (2022).
  38. López-López, A., Hudson, P., Galián, J. Islands in the desert: Species delimitation and evolutionary history of Pseudotetracha tiger beetles (Coleoptera: Cicindelidae: Megacephalini) from Australian salt lakes. Mol Phylogenet Evol. 101, 279-285 (2016).
  39. Ibarra, J. W. B., Bantiding, F. J. A., Delocado, E. D. First Georissidae (Coleoptera) from the Philippines with description of two new species of Georissus Latreille, 1809. Tijdschr Entomol. , 45-58 (2025).
  40. Boonsoong, B., Sartori, M. Review and integrative taxonomy of the genus Prosopistoma Latreille, 1833 (Ephemeroptera, Prosopistomatidae) in Thailand, with description of a new species. ZooKeys. 825, 123-144 (2019).
  41. Wang, Y., Nansen, C., Zhang, Y. Integrative insect taxonomy based on morphology, mitochondrial DNA, and hyperspectral reflectance profiling. Zool J Linn Soc. 177 (2), 378-394 (2016).
  42. Schutze, M. K., et al. One and the same: Integrative taxonomic evidence that Bactrocera invadens (Diptera: Tephritidae) is the same species as the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Syst Entomol. 40 (2), 472-486 (2015).
  43. Schär, S., et al. Integrative biodiversity inventory of ants from a Sicilian archipelago reveals high diversity on young volcanic islands (Hymenoptera: Formicidae). Org Divers Evol. 20, 405-416 (2020).
  44. Ševčík, J., et al. Integrative taxonomy of Central European Planetella (Diptera: Cecidomyiidae) indicates high species diversity, intraspecific variation and low host specificity. Acta Entomol Musei Natl Pragae. 63 (2), 413-450 (2023).
  45. Mengual, X., Ståhls, G., Vujić, A., Marcos-García, M. Á Integrative taxonomy of Iberian Merodon species (Diptera, Syrphidae). Zootaxa. 1377, 1-26 (2006).
  46. Hebert, P. D. N., et al. Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc B Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  47. Hebert, P. D. N., et al. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14812-14817 (2004).
  48. Hebert, P. D. N., Gregory, T. R. The promise of DNA barcoding for taxonomy. Syst Biol. 54 (5), 852-859 (2005).
  49. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., DeWaard, J. R. Barcoding animal life: Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc Lond B. 270 (Suppl), S96-S99 (2003).
  50. Simon, C., et al. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann Entomol Soc Am. 87 (6), 651-701 (1994).
  51. Hendrich, L., et al. Mitochondrial Cox1 sequence data reliably uncover patterns of insect diversity but suffer from high lineage-idiosyncratic error rates. PLoS ONE. 5 (12), e14448(2010).
  52. Balke, M., et al. Suggestions for a molecular biodiversity assessment of Southeast Asian freshwater invertebrates: Lessons from the megadiverse beetles (Coleoptera). J Limnol. 72 (Suppl 2), 61-68 (2013).
  53. Virgilio, M., et al. Comparative performances of DNA barcoding across insect orders. BMC Bioinformatics. 11, 206(2010).
  54. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Res. 41 (D1), 36-42 (2013).
  55. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. BOLD: The barcode of life data system. Mol Ecol Notes. 7, 355-364 (2007).
  56. Pons, J., et al. Sequence-based species delimitation for the DNA taxonomy of undescribed insects. Syst Biol. 55 (4), 595-609 (2006).
  57. Puillandre, N., et al. automatic barcode gap discovery for primary species delimitation. Mol Ecol. 21 (8), 1864-1877 (2012).
  58. Fontaneto, D., Flot, J. F., Tang, C. Q. Guidelines for DNA taxonomy, with a focus on the meiofauna. Mar Biodivers. 45 (3), 433-451 (2015).
  59. Balke, M., et al. New Guinea highland origin of a widespread arthropod supertramp. Proc R Soc B Biol Sci. 276 (1666), 2359-2367 (2009).
  60. Meier, R., et al. DNA barcoding and taxonomy in Diptera: A tale of high intraspecific variability and low identification success. Syst Biol. 55 (5), 715-728 (2006).
  61. Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol. 16 (2), 111-120 (1980).
  62. Puillandre, N., Brouillet, S., Achaz, G. ASAP: Assemble species by automatic partitioning. Mol Ecol Resour. 21 (2), 609-620 (2021).
  63. Wiens, J. J., Penkrot, T. A. Delimiting species using DNA and morphological variation and discordant species limits in spiny lizards (Sceloporus). Syst Biol. 51 (1), 69-91 (2002).
  64. Fujisawa, T., Barraclough, T. G. Delimiting species using single-locus data and the generalized mixed Yule coalescent approach: A revised method and evaluation on simulated data sets. Syst Biol. 62 (5), 707-724 (2013).
  65. Yang, Z., Rannala, B. Unguided species delimitation using DNA sequence data from multiple loci. Mol Biol Evol. 31 (12), 3125-3135 (2014).
  66. Leaché, A. D., Fujita, M. K. Bayesian species delimitation in West African forest geckos (Hemidactylus fasciatus). Proc R Soc B Biol Sci. 277 (1697), 3071-3077 (2010).
  67. Luo, A., et al. Comparison of methods for molecular species delimitation across a range of speciation scenarios. Syst Biol. 67 (5), 830-846 (2018).
  68. Zhang, J., et al. A general species delimitation method with applications to phylogenetic placements. Bioinformatics. 29 (22), 2869-2876 (2013).
  69. Kapli, P., et al. Multi-rate Poisson tree processes for single-locus species delimitation under maximum likelihood and Markov chain Monte Carlo. Bioinformatics. 33 (11), 1630-1638 (2017).
  70. Sanchez, E. G. S., Delocado, E. D., Freitag, H. Two new species of Anacaena Thomson, 1859 (Coleoptera, Hydrophilidae) from the Philippines. ZooKeys. 1112, 11-25 (2022).
  71. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  72. Kumar, S., et al. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 35 (6), 1547-1549 (2018).
  73. Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994).
  74. Pentinsaari, M., Vos, R., Mutanen, M. Algorithmic single-locus species delimitation: Effects of sampling effort, variation and nonmonophyly in four methods and 1870 species of beetles. Mol Ecol Resour. 17 (3), 393-404 (2017).
  75. Galimberti, A., et al. Integrated operational taxonomic units (IOTUs) in echolocating bats: A bridge between molecular and traditional taxonomy. PLoS ONE. 7 (6), e40122(2012).
  76. Kundrata, R., Jäch, M. A., Bocak, L. Molecular phylogeny of the Byrrhoidea-Buprestoidea complex (Coleoptera, Elateriformia). Zool Scr. 46 (2), 150-164 (2017).
  77. Komarek, A., Freitag, H. Taxonomic revision of Agraphydrus Règimbart, 1903 V. Philippine species and their first DNA barcodes. Koleopt Rundsch. 90, 201-242 (2020).
  78. Tautz, D., et al. A plea for DNA taxonomy. Trends Ecol Evol. 18 (2), 70-74 (2003).
  79. Altschul, S. F., et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  80. Porter, T., Hajibabaei, M. Over 2.5 million COI sequences in GenBank and growing. bioRxiv. , 353904(2018).
  81. Gómez, R. A., Reddell, J., Will, K., Moore, W. Up high and down low: Molecular systematics and insight into the diversification of the ground beetle genus Rhadine LeConte. Mol Phylogenet Evol. 98, 161-175 (2016).
  82. Kodada, J., et al. Ancyronyx clisteri, a new spider riffle beetle species from Borneo, redescription of A. sarawacensis Jäch including a description of the larva and new distribution data for A. procerus Jäch using DNA barcodes (Coleoptera, Elmidae). ZooKeys. 912, 25-64 (2020).
  83. Hajibabaei, M., Janzen, D. H., Burns, J. M., Hallwachs, W., Hebert, P. D. N. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (4), 968-971 (2006).
  84. Yeo, D., Srivathsan, A., Meier, R. Longer is not always better: Optimizing barcode length for large-scale species discovery and identification. Syst Biol. 69 (5), 999-1015 (2020).
  85. Sabordo, M. R., Delocado, E., Freitag, H. Two new species of the genus Ancyronyx Erichson, 1847 from the island of Negros, Philippines (Insecta, Coleoptera, Elmidae). Tijdschr Entomol. 163 (1), 13-30 (2020).
  86. Astrin, J. J., et al. Exploring diversity in cryptorhynchine weevils (Coleoptera) using distance-, character- and tree-based species delineation. Mol Phylogenet Evol. 63 (1), 1-14 (2012).
  87. Pritchard, J. K., Stephens, M., Donnelly, P. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics. 155, 945-959 (2000).
  88. Huelsenbeck, J. P., Andolfatto, P., Huelsenbeck, E. T. Structurama: Bayesian inference of population structure. Evol Bioinform. 7, 55-59 (2011).
  89. Hausdorf, B., Hennig, C. Species delimitation using dominant and codominant multilocus markers. Syst Biol. 59 (5), 491-503 (2010).
  90. Fujita, M. K., et al. Coalescent-based species delimitation in an integrative taxonomy. Trends Ecol Evol. 27 (9), 480-488 (2012).
  91. Monaghan, M. T., et al. Accelerated species inventory on Madagascar using coalescent-based models of species delineation. Syst Biol. 58 (3), 298-311 (2009).
  92. Yang, Z., Rannala, B. Bayesian species delimitation using multilocus sequence data. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (20), 9264-9269 (2010).
  93. Ence, D. D., Carstens, B. C. SpedeSTEM: A rapid and accurate method for species delimitation. Mol Ecol Resour. 11 (3), 473-480 (2011).
  94. de Queiroz, K. Species concepts and species delimitation. Syst Biol. 56 (6), 879-886 (2007).
  95. Blair, C., Bryson, R. W. Cryptic diversity and discordance in single-locus species delimitation methods within horned lizards (Phrynosomatidae: Phrynosoma). Mol Ecol Resour. 17 (6), 1168-1182 (2017).
  96. Dellicour, S., Flot, J. F. Delimiting species-poor data sets using single molecular markers: A study of barcode gaps, haplowebs and GMYC. Syst Biol. 64 (6), 900-908 (2015).
  97. Dellicour, S., Flot, J. F. The hitchhiker's guide to single-locus species delimitation. Mol Ecol Resour. 18 (6), 1234-1246 (2018).
  98. Liu, L., et al. Estimating phylogenetic trees from genome-scale data. Ann N Y Acad Sci. 1360 (1), 36-53 (2015).
  99. Lim, G. S., Balke, M., Meier, R. Determining species boundaries in a world full of rarity: Singletons, species delimitation methods. Syst Biol. 61 (1), 165-169 (2012).
  100. Zhou, Z., et al. molecular species delimitation based on COI-5P barcode sequences revealed high cryptic/undescribed diversity for Chinese katydids (Orthoptera: Tettigoniidae). BMC Evol Biol. 19 (1), (2019).
  101. Toussaint, E. F. A., et al. Comparative molecular species delimitation in the charismatic Nawab butterflies (Nymphalidae, Charaxinae, Polyura). Mol Phylogenet Evol. 91, 194-209 (2015).
  102. Carstens, B. C., Dewey, T. A. Species delimitation using a combined coalescent and information-theoretic approach: An example from North American Myotis bats. Syst Biol. 59 (4), 400-414 (2010).
  103. Esselstyn, J. A., et al. Single-locus species delimitation: A test of the mixed Yule-coalescent model, with an empirical application to Philippine round-leaf bats. Proc R Soc Lond B. 279 (1743), 3678-3686 (2012).
  104. Stech, M., et al. Molecular species delimitation in the Racomitrium canescens complex (Grimmiaceae) and implications for DNA barcoding of species complexes in mosses. PLoS One. 8 (1), e53134(2013).
  105. Kekkonen, M., Hebert, P. D. N. DNA barcode-based delineation of putative species: Efficient start for taxonomic workflows. Mol Ecol Resour. 14 (4), 706-715 (2014).
  106. Meier, R., et al. "Dark taxonomy": A new protocol for overcoming the taxonomic impediments for dark taxa and broadening the taxon base for biodiversity assessment. Cladistics. 41, 223-238 (2025).
  107. Ebach, M. C., Holdrege, C. DNA barcoding is no substitute for taxonomy. Nature. 434, 697(2005).
  108. Ebach, M. C., Holdrege, C. More taxonomy, not DNA barcoding. BioScience. 55 (10), 822-823 (2005).
  109. Mora, C., et al. How many species are there on Earth and in the ocean. PLoS Biol. 9 (8), e1001127(2011).
  110. Stork, N. E. How many species of insects and other terrestrial arthropods are there on Earth. Annu Rev Entomol. 63, 31-45 (2018).
  111. Scheffers, B. R., et al. What we know and don't know about Earth's missing biodiversity. Trends Ecol Evol. 27 (9), 501-510 (2012).
  112. Carbayo, F., Marques, A. C. The cost of describing the entire animal kingdom. Trends Ecol Evol. 26 (4), 153-154 (2011).
  113. Walsh, J. C., et al. Trends and biases in the listing and recovery planning for threatened species: An Australian case study. Oryx. 47 (1), 134-143 (2013).
  114. Carrizo, S. F., et al. Freshwater megafauna: Flagships for freshwater biodiversity under threat. BioScience. 67 (10), 919-927 (2017).

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