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Artigo de método

Estabelecimento de um sistema de co-cultura de organoides tumorais colorretais derivados de pacientes e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs)

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DOI:

10.3791/68346

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27 de junho de 2025

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1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um método para criar um modelo organoide de câncer colorretal derivado do paciente (CCR) co-cultivado com linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para estudar suas interações e potencial terapêutico. Este modelo fornece uma plataforma pré-clínica para explorar as respostas imunes no microambiente tumoral e prever a eficácia da terapia baseada em TIL para o tratamento personalizado do CCR.

Resumo

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro câncer mais comum em todo o mundo. Os linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) foram identificados como um importante marcador prognóstico no CCR. A aplicação terapêutica dos TILs já mostrou resultados promissores no melanoma e no câncer do colo do útero. No entanto, seu uso na terapia do CCR permanece em fase exploratória. Um modelo in vitro adequado para avaliar a eficácia do TIL não está disponível no momento, dificultando novos avanços neste campo. Os modelos organoides derivados do paciente (PDO), que retêm de perto as características do tecido tumoral original e refletem a heterogeneidade entre os pacientes, fornecem uma excelente plataforma para estudar a interação entre CRC e TILs. Neste estudo, é descrito um método para estabelecer um modelo organoide de CCR derivado do paciente a partir de tecido tumoral recém-ressecado, seguido de isolamento e expansão de TILs. Este sistema permite a co-cultura de organoides CRC e TILs, permitindo a avaliação da citotoxicidade mediada por TIL e respostas imunes. Ao analisar a eficácia da eliminação de TIL em organoides, os resultados potenciais da imunoterapia baseada em TIL para tratamento personalizado de CRC podem ser previstos. Além disso, a engenharia adicional de TILs pode aumentar sua eficácia antitumoral, oferecendo uma estratégia promissora para o desenvolvimento de terapias celulares mais eficazes. Este modelo de co-cultura PDO-TIL fornece uma ferramenta poderosa para avaliação pré-clínica de terapias TIL e estratégias de tratamento personalizadas em CCR.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é um dos cânceres mais prevalentes e letais em todo o mundo, representando um grande desafio de saúde pública1. Apesar dos avanços nas modalidades de tratamento, incluindo cirurgia, quimioterapia e imunoterapia, o prognóstico para pacientes com CCR, especialmente aqueles com doença metastática, permanece ruim. O microambiente tumoral (TME) desempenha um papel vital na formação da progressão do câncer e nas respostas ao tratamento, com os linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) emergindo como um componente-chave que influencia a resposta imune contra o câncer2. Os TILs, uma população diversificada de células imunes encontradas em tumores, foram identificados como marcadores prognósticos significativos no CCR, com altos níveis de infiltração de TIL frequentemente associados a melhores resultados clínicos3. Estudos recentes também destacaram o potencial terapêutico dos TILs em outros tipos de câncer, como melanoma4 e câncer cervical5, onde a imunoterapia baseada em TIL mostrou eficácia promissora.

No entanto, apesar do sucesso dos TILs em alguns tipos de câncer, sua aplicação no CCR continua sendo uma área de investigação em andamento. A complexidade e heterogeneidade do CCR, juntamente com o microambiente tumoral imunossupressor, apresentam desafios para a imunoterapia eficaz baseada em TIL6. Os tumores de CCR geralmente exibem um TME altamente imunossupressor7, caracterizado pela presença de células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) e macrófagos associados a tumores (TAMs), todos os quais inibem ativamente a função TIL. Além disso, as células CRC freqüentemente expressam moléculas de checkpoint imunológico, como PD-L1, que podem dificultar ainda mais a morte mediada por TIL8. Além disso, a heterogeneidade genética dos tumores de CCR, juntamente com um estroma imunossupressor, complica a capacidade dos TILs de direcionar e eliminar efetivamente as células tumorais, tornando mais difícil alcançar o mesmo nível de sucesso observado no melanoma e no câncer do colo do útero9. Uma lacuna crítica na pesquisa atual é a falta de modelos in vitro adequados que possam simular com precisão as interações entre CRC e TILs. Tais modelos são essenciais para avaliar o potencial dos TILs na terapia do CCR e otimizar sua aplicação para estratégias de tratamento personalizadas.

Os organoides derivados de pacientes (PDOs) surgiram como uma ferramenta poderosa para modelar cânceres humanos10. Essas culturas 3D, derivadas de tecidos tumorais de pacientes, imitam de perto as características histológicas e genéticas dos tumores originais, fornecendo uma representação mais precisa da biologia do tumor em comparação com as linhagens celulares 2D tradicionais. Os modelos PDO também mantêm a heterogeneidade entre os pacientes, tornando-os ideais para abordagens de medicina personalizada11. No CCR, as PDOs têm sido usadas para triagem de drogas e estudo da biologia tumoral12, mas seu uso na avaliação de respostas imunes - particularmente no contexto de TILs - permanece limitado. O projeto de um modelo de co-cultura de células imunes a PDO deve equilibrar a complexidade do microambiente com a controlabilidade experimental. Embora componentes como macrófagos e células dendríticas possam melhorar a biomimética, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) tornaram-se a escolha principal devido à sua acessibilidade. No entanto, as PBMCs têm uma baixa proporção de células T específicas do tumor, e as subpopulações de monócitos podem interferir na estabilidade microambiental13. Em contraste, os TILs enriquecem naturalmente os clones reativos ao tumor e carregam um fenótipo de exaustão in situ, tornando-os um modelo superior para analisar com precisão os mecanismos de evasão imunológica no câncer colorretal.

O objetivo deste estudo é desenvolver uma nova plataforma in vitro para avaliar as respostas antitumorais mediadas por TIL no CCR, estabelecendo um sistema de cocultura de PDOs e TILs de CCR. Este modelo permite a avaliação direta da citotoxicidade TIL contra CRC PDOs e análise das respostas imunes dentro de um contexto específico do paciente. A utilização desse sistema pode fornecer insights mais profundos sobre o potencial das imunoterapias baseadas em TIL para CRC e apoiar a exploração de estratégias para aumentar a eficácia do TIL por meio de abordagens de engenharia. Os métodos anteriores eram limitados pelo pequeno número de TILs14. Na maioria dos casos, os PBMCs foram primeiro co-cultivados com PDOs por duas semanas, após o que os TILs específicos do tumor puderam ser expandidos a partir dos PBMCs e, em seguida, co-cultivados com PDOs para observar os efeitos citotóxicos15. No entanto, essa abordagem também sofre com o tempo de modelagem estendido e o baixo rendimento geral. Em contraste, o método descrito permite o isolamento e estabelecimento de PDOs e TILs a partir de amostras menores de tecido tumoral, que podem então ser co-cultivadas diretamente. Essa abordagem pode oferecer maior conveniência em termos de metodologia e eficiência. Em última análise, este sistema visa fornecer uma ferramenta poderosa para a avaliação pré-clínica das terapias TIL, abrindo caminho para estratégias de tratamento personalizadas que podem melhorar os resultados para pacientes com CCR.

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Protocolo

Todos os experimentos envolvendo materiais derivados de humanos foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e foram aprovados antecipadamente pelo Comitê de Ética do Hospital Zhongshan afiliado à Universidade de Dalian (números de aprovação: KY2023-206-1). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes que forneceram amostras clínicas para este estudo. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Os critérios de inclusão incluíram tecido de câncer colorretal primário confirmado patologicamente, tamanho de amostra suficiente (≥1 cm3), sem história de terapia neoadjuvante (quimiorradiação ou terapia direcionada) e consentimento informado assinado. Os critérios de exclusão incluíram amostra de baixa qualidade com necrose ou fibrose superior a 50%, presença de infecção grave concomitante ou doença autoimune, história de outras malignidades e recusa do paciente em participar.

1. Preparação do reagente de cultura celular

  1. Meio de cultura para DOP CRC: Preparar o meio completo de PDOs CRC de acordo com a composição descrita na Tabela 1.
  2. Meio completo (CM) para TILs16: Suplementar RPMI1640 meio com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, HEPES, 2-mercaptoetanol e 3000 UI/mL de IL-2.
  3. Meio de expansão (EM) dos TILs: Suplemente RPMI1640 meio com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, HEPES e 600 UI/mL de IL-2.
  4. AdDMEM++++: Suplemento de DMEM Avançado com 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de HEPES, 1% de glutamina e 5 mM de Y-27632.
  5. Tampão de digestão do CCR: Adicione 50 μL de colagenase tipo IV e 10 μL de solução de penicilina-estreptomicina-anfotericina B ao AdDMEM++++.
  6. Solução de lavagem de tecidos: Adicione 2% de penicilina-estreptomicina ao PBS.

2. Processamento de tecidos derivados do paciente

  1. Ressecção o tecido tumoral primário do câncer colorretal (a ser realizado por cirurgiões experientes). Após a coleta, divida o tecido em duas partes. Coloque uma parte do AdDMEM++++ em uma caixa de gelo e transporte-a para o laboratório para dissociação e cultura de células tumorais. Colocar a outra parte em paraformaldeído a 4% para análise histopatológica17.
  2. Descongele o Matrigel lentamente em uma geladeira a 4 °C. Pré-aqueça o tampão de lise eritrocitária à temperatura ambiente. Prepare tesouras de tecido, pinças, meio AdDMEM++++ e tampão de digestão CRC.
  3. Transfira o tecido para uma placa de Petri e enxágue três vezes com 5 mL de PBS. Substitua por um novo prato e enxágue três vezes com 5 mL de tampão de lavagem de lenços para minimizar a contaminação.
  4. Pique o tecido com uma tesoura, transfira-o para o tampão de digestão e incube em banho-maria a 37 °C por 30 min até a dissociação completa.
  5. Corte o tecido com uma tesoura de tecido e transfira-o para a solução de digestão do tecido. Digerir o tecido em banho-maria a 37 °C e monitorizar até que a dissociação do tecido esteja completa.
  6. Adicione um volume igual de AdDMEM++++ para neutralizar a digestão. Centrifugar a 380 × g durante 5 min a 25 °C.
  7. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta. Observe o número de eritrócitos no pellet. Adicione 1-3 ml de lisado de eritrócitos e incube durante 10 min a 25 °C.
    1. Encerre a lise com um volume igual de AdDMEM++++. Centrifugue a 380 × g durante 5 min a cerca de 25 °C.
  8. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender o sedimento celular num volume adequado de AdDMEM++++.
  9. Quantifique células viáveis usando a exclusão de azul de tripano para obter uma suspensão unicelular de tecido tumoral.

3. Estabelecimento do modelo DOP e cultura TILs

  1. Divida a suspensão unicelular do tecido tumoral em duas porções: use uma para o estabelecimento do modelo PDO e a outra para a cultura de TILs.
  2. Após a contagem de células, misture 80.000 células por poço da suspensão celular com Matrigel na proporção de 1:1 para o estabelecimento do modelo PDO.
  3. Ressuspenda a suspensão celular restante em CM em uma placa de 24 poços a uma concentração de 1 × 106 células / mL para cultura de TILs.
  4. Observe diariamente. Tire fotografias para registrar o status de PDOs e TILs. Troque o meio a cada 2 dias.

4. Purificação e expansão de TILs

  1. Cultive TILs por 10-20 dias antes da purificação.
  2. Colete TILs em um tubo de centrífuga. Enxágue a placa do poço com meio fresco e colete todas as células restantes da placa do poço.
  3. Centrifugue a 125 × g durante 5 min a cerca de 25 °C.
  4. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta. Lave com 2 mL de PBS e centrifugue novamente a 125 × g por 5 min a aproximadamente 25 °C.
  5. Execute a contagem de células.
  6. Use esferas magnéticas CD3 + para classificação para isolar células T CD3 + 18.
  7. Incubar o anticorpo com a suspensão celular a 4 °C durante 10-15 min.
  8. Incubar os grânulos magnéticos com a suspensão de células de anticorpos a 4 °C durante 10-15 min.
  9. Coloque a coluna de classificação no ímã de classificação. Adicione a suspensão de células à coluna e permita que apenas as células positivas marcadas com esferas magnéticas sejam retidas na coluna de classificação.
  10. Remova a coluna de classificação do campo magnético. Adicionar solução tampão para eluir as células positivas retidas na coluna. Ressuspenda as células em 2 mL de PBS e centrifugue a 195 × g por 5 min a aproximadamente 25 ° C.
  11. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta. Ressuspenda as células em uma placa de 12 poços com meio EM fresco a uma concentração de 1 × 106 células / mL. Adicionar 5 μg/ml de anticorpo CD3. Passe as células para novos frascos de cultura a cada 3 dias.

5. Histologia e caracterização IHQ de PDOs

  1. Aspirar o meio de cultura depois de os organoides terem atingido um tamanho de 50 μm.
  2. Fixe as esferas organoides diretamente em paraformaldeído a 4%. Aspire os organoides, centrifugue a 195 × g por 5 min a aproximadamente 25 ° C, embebia em agarose a 2%, deixe curar e transfira para paraformaldeído a 4% para fixação durante a noite.
  3. No dia seguinte, realize a desidratação gradiente. Prepare blocos de cera, corte cortes de 4 μm, reidratar usando um gradiente e realizar coloração imuno-histoquímica usando anticorpos CK7, CK20, Ki-67 e CDX-2.

6. Caracterização de FI de TILs

  1. Purifique os TILs, cultive-os até que um número adequado seja atingido e extraia uma porção para caracterização.
  2. Caracterize as células em suspensão usando o método de descamação. Ajuste a velocidade de rotação do flaker para 343 × g por 4 min a aproximadamente 25 °C.
  3. Conte e semeie as células a 1 × 104 por lâmina.
  4. Fixar as células firmemente às lâminas por centrifugação.
  5. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 min e lave três vezes com PBS.
  6. Incubar com solução de bloqueio (PBS contendo 2% de FBS) por 1 h.
  7. Incubar com anticorpos primários (CD45, CD3, EpCAM) por 1 h à temperatura ambiente. Lave três vezes com PBS.
  8. Preparar e incubar com o anticorpo secundário de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante durante 1 h à temperatura ambiente. Lave três vezes com PBS.
    NOTA: Preste atenção à homologia de anticorpos.
  9. Incubar com DAPI durante 15 min a cerca de 25 °C.
  10. Observe as células coradas sob um microscópio de fluorescência.

7. Sistema de co-cultura de DOP e TILs

  1. Adicione IFN-γ ao meio organoide para melhorar a apresentação do antígeno. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h15.
  2. Dilua o anticorpo anti-CD28 com PBS. Cubra uma placa de 96 poços adicionando 50 μL da solução de anticorpos a cada poço. Selar a placa com película de vedação e incubar a 4 °C durante 24 h.
  3. Após 24 h, dissocie os organoides em células únicas usando TrypLE. Conte as células e lave duas vezes com PBS.
  4. Colete os TILs emparelhados, conte as células e lave duas vezes com PBS.
  5. Inocular organoides a 1 × 104 células por poço e inocular TILs a 1 × 105 células por poço para obter uma proporção efetor-alvo (E:T) de 10:1 para co-cultura.
  6. Realizar co-cultura em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 3000 U/mL de IL-2 e 20 μg/mL de anticorpo bloqueador de anti-PD-1. Incubar por 3 dias e capturar imagens para observação e documentação.
    NOTA: Configure organoides sem TILs como um grupo de controle.

8. Ensaio funcional de TILs por citometria de fluxo

  1. Coletar as DOP e TILs no final do período de co-cultura.
  2. Lave as células duas vezes com PBS por centrifugação a 300 × g por 5 min de cada vez. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
  3. Prepare o coquetel de anticorpos contendo CD3-FITC, CD4-APC/Cianina7, CD8-APC, CD107a-PE-Cianina7, CD279-PE e 7-AAD.
  4. Ressuspenda as células em 100 μL do coquetel de anticorpos e incube em temperatura ambiente por 20 min, protegidas da luz.
  5. Adicione 1 mL de PBS para lavar as células. Centrifugar a 300 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante com uma pipeta.
  6. Ressuspenda as células em 500 μL de PBS.
  7. Realize a análise de citometria de fluxo. Consulte a Figura Suplementar 1 para obter a estratégia de análise detalhada.

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Resultados

Estabelecimento e caracterização de PDOs de CRC
Amostras tumorais foram obtidas de pacientes com CCR. O tecido tumoral de CCR recém-ressecado foi usado para estabelecer PDOs e TILs, que foram posteriormente empregados em experimentos de co-cultura PDO-TIL (Figura 1).

figure-results-1
Figura 1: Esqu...

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Discussão

Este estudo utiliza tecido de CCR derivado de pacientes para obter células tumorais e TILs, a partir das quais as PDOs são estabelecidas e as TILs são expandidas. A interação entre esses dois componentes é então investigada por meio de um sistema de co-cultura.

Em estudos anteriores, os TILs foram extraídos usando instrumentação complexa19 ou diretamente de suspensões de tecido tumoral20. No entanto, esses método...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [82172822]; Programa de Apoio à Inovação de Talentos de Alto Nível do Departamento de Ciência e Tecnologia de Dalian [2021RD02]; Plano Conjunto do Programa Provincial de Ciência e Tecnologia de Liaoning [2024JH2/102600067]; Projeto de Cooperação Internacional em Ciência e Tecnologia da Província de Liaoning [2024JH2/101900006].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM/F-12 avançadoGibco12634028
2-Mercaptoetanolsigma63689
4% de paraformaldeídoBBIE672002-0100
7-AADBiolenda420403
A83-01Tocris2939
Suplemento B27Gibco17504-44
CD107a-PE-Cianina7Biolenda328618
CD279-PEBiolenda329906
Anticorpo Monoclonal CD3 (OKT3)Invitrogen14-0037-82
CD3-FITCBiolenda300406
CD45 (Domínio Intracelular) (D9M8I) CST13917S
CD4-APC/Cianina7Biolenda300518
CD8-APCBiolenda344722
CDX-2MXBRMA-0631
CK20MXBKit-0025
CK7MXBModelo-0021
Dylight 488, IgG anti-coelho de cabraAbbkineA23220
Dylight 549, IgG anti-rato de cabraAbbkineA23310
FEGPeprotechAF-100-15
EpCAMCST36746T
Soro fetal bovino (FBS)CellmaxSA211.02
FGF 10Peprotech100-26
Gastrina (Humana)Tocris3006
GlutaMax 100xGibco35050-061
HepesSigmaH4034
HEPESSigmaH4034
Kit de separação de células CD3+ humanas (RUO)RWDK1201-10
Proteína recombinante IFN-gama humanaPeproTech300-02-20UG
Ki-67CST9449S
MatrigelCorning354234
N-acetilcisteínaSigmaRolamento A9165
NicotinamidaSigmaN0636
Nivolumabe (anti-PD-1)VendedorA2002 
Penicilina/estreptomicinaSigmaV900929
penicilina-estreptomicinaNCM BiotecnologiaC100C5
PrimocinInvivogenFormiga-pm-1
Tampão de lise de hemáciasTermo-invitrogênio00-4300-54
IL-2 humana recombinante (sem portadora)Biolenda589104
RPMI 1640Gibco
SB202190VendedorS1077
Mancha azul de tripano 0,4%Termo-invitrogênioT10282
Anticorpo anti-CD28 humano purificado Ultra-LEAFBiolenda302934
Anticorpo anti-CD3 humano purificado Ultra-LEAFBiolenda317325
Y-27632VendedorS1049

Referências

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