Esta é a primeira parte de um protocolo abrangente de amostragem de Xenopus . Os tecidos amostrados são o ventrículo cardíaco, tronco arterial, lobo esquerdo do fígado, vesícula biliar, pulmão, pâncreas, baço, laringe, esôfago, estômago, intestinos, testículos, corpos adiposos, oviduto, rins pareados, plexo ciático, pele, timo e olho inteiro.
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Artigo de método
Técnicas eficientes para amostragem abrangente de tecidos acessíveis em Xenopus adultos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Xenopus tem sido um organismo modelo fundamental para investigar o desenvolvimento e doenças de vertebrados, oferecendo insights profundos sobre processos celulares e função gênica. Apesar da riqueza de informações sobre o Xenopus embrionário, ainda há uma lacuna significativa nos métodos padronizados para amostragem de tecidos adultos, especialmente para abordagens modernas como a proteômica quantitativa. Este estudo apresenta um protocolo abrangente para amostragem rápida, precisa e eficiente de múltiplos tecidos em Xenopus adulto. O protocolo aborda os desafios associados às sutis diferenças anatômicas em comparação com outros anuros, garantindo a reprodutibilidade mesmo para aqueles com experiência limitada em dissecação de rãs. Este protocolo é otimizado para análises bioquímicas de alta qualidade, priorizando o frescor da amostra. Estamos facilitando a coleta rápida de até 18 tecidos em uma hora. Além disso, os métodos se aplicam a condições perfundidas e não perfundidas, proporcionando flexibilidade para uma variedade de necessidades experimentais. Este trabalho não apenas preenche uma lacuna metodológica crítica para Xenopus laevis e tropicalis , mas também serve como um recurso valioso para pesquisadores que adaptam técnicas a modelos de anfíbios semelhantes, aumentando assim o escopo e a confiabilidade de estudos biológicos e evolutivos comparativos.
Introdução
Xenopus oferece vantagens únicas sobre camundongos, peixes-zebra e outros organismos modelo para estudar doenças humanas, particularmente em contextos de desenvolvimento e evolução. Seu desenvolvimento embrionário externo e embriões grandes e facilmente manipuláveis permitem observação em tempo real e intervenções experimentais (por exemplo, enxerto de tecido, edição de genes) que são desafiadoras em camundongos, que se desenvolvem internamente e requerem procedimentos invasivos. Além disso, o coração de três câmaras e os membros tetrápodes de Xeopus fornecem uma ponte evolutiva mais direta para estudar defeitos congênitos1, regeneração de membros2 e desenvolvimento cardíaco3. Ao contrário dos camundongos, os girinos de Xenopus podem regenerar membros e órgãos, modelando processos regenerativos ausentes em mamíferos, enquanto seu estágio de vida aquática permite o estudo não invasivo de impactos ambientais ou de toxinas. Combinado com reprodução mais rápida, custos mais baixos e menos restrições éticas, o Xenopus é superior para estudos mecanicistas de alto rendimento de organogênese e respostas ao estresse que são difíceis de replicar em sistemas de mamíferos.
Este artigo tem como objetivo oferecer uma orientação clara para a amostragem precisa e reprodutível de órgãos de tecidos adultos de Xenopus, como está disponível para girinos de Xenopus 4. Embora uma "dissecção digital"5 e "micro-CT"6 de Xenopus adulto estejam disponíveis, a obtenção de amostragem consistente de órgãos e tecidos em Xenopus adulto permanece difícil sem as instruções detalhadas fornecidas para outros modelos adultos, como camundongos 7,8,9.
Embora um guia de amostra para seis tecidos cruciais esteja disponível10, nenhum guia de dissecção e amostragem específico e extenso para Xenopus está disponível atualmente. Existe um guia abrangente de dissecação para Rana sp.11 e vários manuais de dissecação em sala de aula estão disponíveis para outros anuros12, No entanto, para indivíduos inexperientes em técnicas de amostragem ou anatomia de anfíbios, as diferenças sutis entre Xenopus e outros anuros tornam os recursos existentes inadequados para amostragem de tecido consistente e replicável.
Este guia foi desenvolvido para priorizar o frescor do tecido para proteômica e imunoquímica. Para um usuário experiente, todos os tecidos podem ser coletados de um indivíduo em menos de uma hora. Recomenda-se que, se um usuário não tiver experiência, ele tente este protocolo em espécimes que foram sacrificados por outros motivos antes de sacrificar qualquer animal que seja mais difícil de substituir.
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Protocolo
Todos os experimentos foram aprovados e realizados de acordo com as regras e regulamentos da Harvard Medical School IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais IS 00001365_3). Se o protocolo de perfusão13 for seguido antes da amostragem, pule para a etapa 2.3.
1. Preparação (sem perfusão)
- Certifique-se de que a instituição de pesquisa aprovou a técnica de eutanásia descrita neste protocolo.
- Preparar uma solução de 5 g/L de MS-222 (metanossulfonato de tricaína) e 5 g/L de bicarbonato de sódio (ver Tabela de Materiais). Verifique o pH para garantir que esteja ≥7.
NOTA: O volume deve ser maior que o volume necessário para cobrir completamente os animais que estão sendo sacrificados. - Realizar a eutanásia primária colocando o Xenopus na solução MS-222 (a partir do passo 1.2), mantendo o animal submerso por um total de 1 h14.
- Coloque a superfície de dissecção (bandeja ou folha de espuma) inclinada dentro de um recipiente secundário ou organize-a de outra forma para facilitar a drenagem do sangue.
- Uma vez que a rã esteja na solução por 1 h, a eutanásia primária foi concluída. Remova o sapo e verifique a perda de resposta à dor realizando uma pitada no pé.
- Registre a idade (se conhecida), sexo e estado de saúde do animal que está sendo amostrado, bem como se ele foi perfundido. Pesar o Xenopus e fazer as medições adicionais necessárias antes da amostragem.
- Coloque o sapo de costas e prenda os membros anteriores proximais ao corpo (Figura 1A).
- Com uma tesoura de dissecção, cortou a pele, subiu pela linha média e depois lateralmente, fazendo dois retalhos.
- Identifique a linha alba (Figura 1B). Use uma pinça para agarrar a linha alba e puxe-a para longe da cavidade celômica. Use cuidadosamente uma tesoura para cortar em direção à cabeça, através da musculatura. Faça duas abas fora da parede da cavidade e corte ou prenda todas as abas fora do caminho.
- Identifique o coração, que ainda deve estar batendo. Se o coração não for facilmente acessível, use uma tesoura de dissecação para reduzir os ossos coracóides (Figura 1B).
NOTA: Se o coração parou de bater antes da amostragem, o frescor da amostra foi comprometido. - Se desejar, complete o protocolo de perfusão rápida9.
2. Amostragem
NOTA: Se o animal foi perfundido, pule para a etapa 2.3. Todas as margens devem ser de aproximadamente 25 mm. Fórceps e tesouras devem ser limpos ou substituídos entre as amostras. Todos os tecidos devem ser amostrados dentro de 1 h após a eutanásia, para máxima frescura.
- Usando uma pipeta de transferência, enxágue a cavidade celômica com PBS resfriado ou 0,7x PBS15 para limpar o sangue e manter a visibilidade.
- Identifique o pericárdio fino (Figura 2A) e puxe-o com uma pinça de tecido. Usando a ponta da tesoura de iridectomia, perfure-a suavemente, tomando cuidado para não cortar os tecidos subjacentes. Retire o pericárdio das três câmaras do coração (Figura 2B).
- Apare as aurículas cortando-as onde encontram o ventrículo e o tronco arterial.
- Use uma pinça para agarrar o ventrículo pelo ápice e corte-o abaixo de onde ele encontra o tronco arterial, deixando uma margem (Figura 2C).
- Inspecione visualmente o ventrículo sob ampliação para garantir que nenhum tecido indesejado esteja preso.
NOTA: O centro do ventrículo pode incluir tecido valvar espiral de cor clara; isso pode ser mantido. Em animais não perfundidos, a remoção do ventrículo pode ser qualificada como eutanásia secundária (também chamada de anestesia terminal). - Imediatamente após a amostragem, enxágue as amostras de tecido em PBS resfriado ou PBS 0,7x, dependendo das necessidades experimentais15.
NOTA: Em animais perfundidos, espera-se que todos os tecidos, exceto o fígado, sejam enxaguados de forma limpa. Se não for esse o caso, uma nota deve ser feita. Em tecidos não perfundidos, todos os meios de enxágue estarão saturados com sangue. As etapas 2.5 a 2.6 devem ser seguidas após a amostragem de cada tecido. - Observe que o tronco arterial se bifurca em dois troncos aórticos (também chamados de aortas laterais) e que cada um se divide em três arcos arteriais (Figura 2D). Puxe o tronco arterial esticado e corte os troncos aórticos imediatamente após onde esses arcos se dividem.
- Observe os três lobos do fígado (Figura 3A). Segure a borda do lobo esquerdo (à direita do espectador) e levante-a suavemente para que os ductos hepáticos e císticos fiquem visíveis. Faça uma amostra dos 2/3 inferiores do lóbulo, abaixo desses acessórios (Figura 3B).
- Identifique a vesícula biliar, que pode variar drasticamente em cor. Segure a vesícula biliar, puxe-a para longe do lobo direito do fígado e corte sua fixação (Figura 3C). Se não estourar, rompa-o com uma tesoura de iridectomia.
- Segure o ápice do pulmão e puxe-o esticado. Observe a textura dos alvéolos e determine onde essa textura termina e o brônquio começa. Corte nesta margem (Figura 3D). Se o pulmão estiver fundido ao peritônio, retire-o cuidadosamente.
- Identifique o ovário, que está envolto em uma camada de peritônio visceral chamada epitélio germinativo. Mova suavemente os lóbulos até que estejam em seus respectivos lados para tornar a área de fixação visível (Figura 4A); Esses anexos são diretamente ventrais ao rim emparelhado. Com a ajuda de uma tesoura, remova os ovários o mais próximo possível dos rins, sem danificá-los (Figura 4B). Durante esse processo, se os oócitos vazarem, faça uma amostra deles e depois enxágue-os.
NOTA: A remoção do ovário é útil para obter melhor acesso aos tecidos de uma rã fêmea. - Inspecione o lobo anterior (também chamado de lobo mediano) do fígado e observe como ele se conecta ao estômago e ao duodeno através do mesentério (Figura 3A e Figura 4C). Corte o mesentério e o ligamento hepatoduodenal usando uma tesoura de iridectomia. A massa carnuda restante é o pâncreas e o ducto colédoco.
- Corte a conexão do pâncreas e do ducto colédoco ao lobo anterior do fígado, deixando uma margem. Segure o estômago com uma pinça dentada e uma extremidade do pâncreas com uma pinça de tecido. Sob ampliação, separe suavemente o pâncreas do estômago (Figura 4D).
- Se o pâncreas não sair limpo, retire o tecido pancreático restante. Como alternativa, descole o pâncreas metodicamente usando tesouras de iridectomia e pinças de tecido.
NOTA: Além do ducto colédoco, espera-se que alguns mesentérios e o ducto pancreático sejam incluídos nesta amostra.
- Se o pâncreas não sair limpo, retire o tecido pancreático restante. Como alternativa, descole o pâncreas metodicamente usando tesouras de iridectomia e pinças de tecido.
- Identifique o baço e faça uma amostra cortando sua fixação ao peritônio (Figura 4E).
- Remova e descarte os tecidos hepáticos restantes.
- Remova o outro pulmão e o brônquio restante onde eles se ligam à laringe. Agarrando a laringe por sua extremidade inferior, comece a levantá-la para fora da cavidade, cortando os anexos claros à medida que se tornam aparentes.
- À medida que a laringe é levantada, sua fixação ao esôfago se torna perceptível. Descasque e corte cuidadosamente o tecido esofágico da laringe usando uma tesoura de iridectomia curva (Figura 5A). Em seguida, puxe a laringe para baixo e corte-a para longe da cavidade bucal. Corte todos os acessórios transparentes que se tornarem aparentes.
- Observe a curvatura do estômago, que o diferencia do esôfago, bem como a restrição pilórica que diferencia o estômago dos intestinos (Figura 5B). Corte o canal alimentar imediatamente anterior à curvatura do estômago, separando-o do esôfago.
- Abra a boca e identifique a abertura compartilhada das trompas de Eustáquio em seu teto16. Com a boca aberta, puxe o esôfago para observar sua fixação (Figura 5C). Levante o esôfago para fora da cavidade, cortando os anexos claros ao longo do caminho. Separe o esôfago da cavidade bucal imediatamente abaixo da abertura de Eustáquio.
- Segure o estômago e corte-o onde encontra o duodeno, na restrição pilórica (Figura 5A, B).
- Estique os dois pontos e corte-os o mais próximo possível da cloaca (Figura 5D). Puxe os intestinos para fora, cortando quaisquer anexos peritoneais claros.
- Se o sapo for macho, identifique os testículos e remova um usando uma tesoura de iridectomia, tomando cuidado para não danificar o rim subjacente (Figura 6A).
- Separe os corpos gordurosos para que fiquem de lado; A área sobre o rim, onde o corpo gorduroso se conecta ao peritônio, será visível. Segure a base de qualquer corpo gorduroso e use uma tesoura para cortá-la do peritônio, deixando uma margem (Figura 6B).
- Identifique e remova a bexiga urinária, cortando o mais próximo possível da cloaca (Figura 6C).
- Se a rã for fêmea ou tiver um oviduto vestigial distinto, segure a extremidade inferior do oviduto, puxe-a para longe da cloaca e corte-a o mais próximo possível da cloaca (Figura 6D). Puxe o oviduto para fora da cavidade celômica, cortando quaisquer inserções peritoneais à medida que se tornam aparentes (Figura 6E).
- Remova e descarte os corpos adiposos e testículos restantes ou oviduto.
- Use uma pinça para agarrar os rins em sua base inferior e observe que eles estão cobertos pelo peritônio claro (retroperitoneal)17. Corte o peritônio na base do rim (Figura 7A) e, em seguida, retire os rins da cavidade celômica (Figura 7B), usando uma tesoura para cortar o peritônio conforme necessário.
- Sob ampliação, corte o excesso de peritônio e qualquer corpo adiposo restante, ovário ou tecido testicular.
- Observe o feixe de nervos periféricos que liga o terminal da coluna vertebral a cada perna; Este é o plexo ciático. Segure o feixe de nervos com uma pinça e corte-os onde eles saem da cavidade celômica (Figura 7C). Levante o feixe para fora da cavidade e corte-o onde os nervos saem da coluna vertebral (Figura 7D).
- Remova os pinos do animal, vire-o em seu ventrum e prenda novamente os membros do animal. Selecione o membro posterior para amostrar e fixe o pé desse membro.
- Remova um retalho de pele em forma de amêndoa sobre o gastrocnêmio / tibiofíbula (Figura 8A, B).
- Segure a pele do dorso e corte lateralmente para que haja um corte contínuo ao redor da barriga do animal (Figura 8C).
- Remova os pinos, prenda as pernas em uma das mãos e segure a pele dorsal anterior com uma pinça dentada. Esfole o animal puxando a pele dorsal para cima sobre a cabeça e os braços, usando força (Figura 8D).
- Identifique a massa gordurosa que cobre a articulação da mandíbula, corte a margem posterior da massa de onde ela está fundida aos tecidos musculares rosados e, em seguida, use uma tesoura de iridectomia para cortá-la do osso subjacente (Figura 9A). Dependendo da idade e maturidade do animal, um aglomerado de melanóforos se tornará aparente (Figura 9B). Apare a massa para que nenhuma fixação muscular ou cartilagem seja fixada.
- Repine o animal e selecione um olho. Insira uma tesoura de iridectomia curva na órbita ao redor da curvatura do olho (Figura 9C). Corte suavemente ao redor do olho, cortando os anexos musculares.
- Deslize a tesoura mais fundo na órbita e desconecte o nervo óptico, atrás do olho. Use essas tesouras para desalojar o olho para fora da órbita e, em seguida, reduzir ainda mais as inserções musculares.
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Resultados
Seguindo todas as etapas deste protocolo, o ventrículo cardíaco, o tronco arterial, o lobo do fígado esquerdo, a vesícula biliar, o pulmão, o pâncreas, o baço, a laringe, o esôfago, o estômago, os intestinos, os testículos, os corpos adiposos, o oviduto, os rins pareados, o plexo ciático, a pele, o timo e todo o olho foram excisados de forma limpa dentro de uma hora após a eutanásia (ver Figura 1, Figura 2, Figura 3...
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Discussão
O protocolo aqui apresentado foi projetado para fornecer flexibilidade para usuários em vários níveis de experiência, garantindo a coleta de tecidos essenciais de maneira oportuna e eficiente. Novos usuários são aconselhados a seguir cada etapa do protocolo, conforme descrito, para garantir a coleta sistemática de tecidos. Usuários mais experientes, no entanto, podem optar por pular certas etapas e coletar amostras apenas dos tecidos de que precisam. Por exemplo, o acesso ao baço, locali...
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela ODO31956 de concessão OD R24 do NIH. Também gostaríamos de agradecer a Samantha Jalbert e Jill Ralston por sua assistência e apoio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 5x Lupa com Luz LED e Suporte | amazon.com | B08QJ6J8P1 | luz não deve produzir calor |
| Pipetas de Transferência Descartáveis | VWR | 414004-036 | |
| Pinça de Dissecação de Ponta Fina | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Tesoura de dissecação pione afiado, reto 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Bandeja de Dissecção | Fisher Scientific | 14-370-284 | folhas de isopor são uma alternativa aceitável |
| Recipiente de eutanásia | US Plastic | Item 2860 | recipientes opacos alternativos aceitáveis |
| Tampa de recipiente de eutanásia | US Plastic | Item Tesoura de Iridectomia 3047 | |
| 6" | VWR | 470018-938 | tesouras de íris são uma alternativa aceitável |
| MS-222: Síncaína (anteriormente tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| 5.5 in., Aço Inoxidável | Fisher Scientific | S08100 | |
| Bicarbonato de Sódio, Pó, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Pinça de amostra, Pinos em T serrilhados | VWR | 82027-442 | |
| para dissecar | Fisher Scinetific | S99385 |
Referências
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Reimpressões e permissões
