Artigo de método

Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

DOI:

10.3791/68405

⸱

29 de julho de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo documenta a fabricação e montagem do SPOT, uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento, nos formatos de 96 e 384 poços. Ele também detalha o processo de semeadura do SPOT, tanto manual quanto usando um manipulador de líquidos disponível comercialmente.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os organoides derivados de pacientes (PDOs) estão se tornando cada vez mais usados no campo da pesquisa do câncer para modelar tumores. Eles combinam os benefícios dos modelos in vivo e in vitro tradicionais, recapitulando a complexidade e a heterogeneidade do tecido enquanto ainda consistem em células humanas. O surgimento de modelos PDO fisiologicamente representativos gerou a necessidade de dispositivos que permitam uma análise direta do comportamento organoide. Este protocolo explica como montar e usar a Plataforma Suportada por Andaimes para Tecidos à Base de Organoides (SPOT), um dispositivo de cultura organoide tridimensional (3D) de alto rendimento. Esta plataforma elimina o menisco normalmente formado por hidrogéis semeados para permitir imagens precisas e rápidas, semelhante ao processo de imagem para culturas bidimensionais (2D). Como resultado, organoides e coculturas semeadas em SPOT podem ser facilmente visualizados usando microscopia de alto rendimento. Projetado para uso imediato, o SPOT é acessível a pesquisadores com experiência básica em cultura de tecidos e é compatível com fluxos de trabalho de semeadura manuais e automatizados. Este protocolo detalha a fabricação do SPOT nos formatos de 96 e 384 poços, incluindo instruções passo a passo para montagem, semeadura, controle de qualidade e solução de problemas. Embora a fabricação exija 3-4 h, excluindo o tempo ocioso, várias chapas podem ser produzidas simultaneamente, melhorando a escalabilidade. Ao simplificar a cultura e a análise de PDO, o SPOT fornece uma ferramenta robusta para triagem de medicamentos de alto rendimento e pesquisa translacional do câncer.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apesar dos avanços na pesquisa biomédica, o desenvolvimento de ensaios in vitro fisiologicamente relevantes continua sendo um desafio. Um ensaio ideal deve acomodar uma gama diversificada de tipos de células, formulações de tratamento, escalas de tempo, instrumentação comercial e leituras analíticas para atender às necessidades de pesquisadores em várias disciplinas. No entanto, devido à falta de ferramentas adequadas, os pesquisadores muitas vezes contam com modelos simplistas, como monocamadas 2D de linhagens celulares imortalizadas, que não conseguem recapitular a complexidade e a relevância clínica, particularmente na pesquisa do câncer 1,2. Para resolver isso, o biobanco de tumores em larga escala e a colaboração de médicos impulsionaram o desenvolvimento de modelos in vitro de alta fidelidade, como organoides tumorais derivados de pacientes (PDOs), que retêm mais perfis genéticos e terapêuticos específicos do paciente em comparação com as linhagens celulares 3,4,5. Enquanto isso, os avanços na automação laboratorial e na descoberta de medicamentos exigem plataformas que se integram perfeitamente a fluxos de trabalho de alto rendimento. Embora as plataformas existentes abordem a fidelidade biológica ou a escalabilidade, poucas foram capazes de resolver os dois desafios simultaneamente 6,7,8. O desenvolvimento de modelos automatizados e de alto rendimento que repliquem as principais características da doença é crucial para o avanço da pesquisa biomédica e a aceleração da geração de dados para aplicações translacionais.

Numerosos modelos emergentes visam enfrentar os desafios associados à cultura de tipos de células especializadas, como PDOs, com alto rendimento (Figura 1). As plataformas padrão, onde os organoides são misturados com hidrogel em placas de 96 ou 384 poços, apresentam várias limitações: (i) o alto volume de células e gel leva ao acesso inconsistente a nutrientes, (ii) a curvatura do menisco do poço cria artefatos de imagem e gradientes celulares, (iii) a semeadura de hidrogel carece de uniformidade entre lotes e pessoal, (iv) incompatibilidade com fabricação automatizada e microscopia automatizada e (v) o uso de matriz extracelular (ECM) que normalmente é uma amostra de risco macia e frágil destruição em densidades fisiológicas de tecidos ou incorporação de tipos de células contráteis 1,9. Atualmente, a maioria dos estudos de PDO baseados em placas é conduzida semeando manualmente o gel celular na placa10,11 ou um método de sobreposição de gel, onde o hidrogel é diluído com um meio menos viscoso e as células são centrifugadas no fundo do poço para colocá-las no plano óptico apropriado12,13. Ambas as abordagens falham em fornecer suporte mecânico para a cultura de longo prazo. Com base em nossas observações anteriores (dados não publicados), o hidrogel comercial misturado com células em placas de poços padrão se contrai das superfícies do poço por 9 dos 12 poços ao longo de 12 dias, enquanto o método de sobreposição de gel carece de interações fisiológicas célula-matriz. Além disso, as culturas resultantes não podem ser mantidas por longos períodos devido a limitações de espaço dentro do poço e são incompatíveis com ensaios que requerem uma alta proporção de reagente para meio celular 14,15,16. Essas barreiras práticas dificultam a adoção de modelos 3D e limitam a reprodutibilidade experimental em todo o campo.

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Figura 1: Avaliação de modelos de cultura com base na escalabilidade e relevância biológica. O posicionamento relativo de vários sistemas de cultura in vitro e in vivo ao longo da escalabilidade (eixo y), definida pelo rendimento da placa, e relevância biológica (eixo x), destacando os trade-offs entre o potencial de rendimento e a fidelidade fisiológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Motivados por esses desafios, a alta porosidade e o reforço mecânico de um andaime fino de celulose foram aproveitados para desenvolver a Plataforma Suportada por Andaimes para Tecidos à Base de Organoides (SPOT), disponível nos formatos de 96 e 384 poços. O SPOT incorpora um andaime pré-padronizado de polímero usando um método de infiltração desenvolvido anteriormente17 que corresponde ao layout da placa, permitindo a colocação precisa de gotículas de célula-gel e fornecendo suporte estrutural para a fase de hidrogel (Figura 2A). A absorção capilar no andaime guia a solução célula-gel, formando uma rede de biocompósitos reforçada mecanicamente (Figura 2B). Devido à estrutura porosa do andaime, o gel celular se infiltra e forma uma camada fina (aproximadamente 70 μm de espessura), exigindo dez vezes menos quantidade de gel celular para cobrir o fundo do poço14. A compatibilidade do SPOT com PDOs de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) também foi demonstrada avaliando seu crescimento usando ensaios metabólicos e medições baseadas em imagens. Desde o seu desenvolvimento, o SPOT demonstrou versatilidade e usabilidade significativas para pesquisadores envolvidos na cultura de organoides. Além disso, o design do SPOT acomoda escalabilidade amigável, com volumes reduzidos de reagentes e recursos de imagem aprimorados por meio de sua geometria de microgel plana e sem menisco, garantindo penetração uniforme de luz e imagens precisas de alto conteúdo14 (Figura 2C, D). O SPOT também suporta co-cultura com outros tipos de células relevantes, como fibroblastos, para recapitular melhor o microambiente tumoral18.

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Figura 2: Visão geral do dispositivo 96-SPOT e fluxo de trabalho de análise de imagem. (A) Representação esquemática da fabricação da placa SPOT: o dispositivo é montado agrupando uma placa de poço comercial sem fundo (superior), andaime com padrão de PMMA (mostrado em azul) e filme de policarbonato (abaixo) usando camadas de adesivo poliacrílico de dupla face (mostrado em amarelo). (B) Semeadura de células no poço de andaime: as células são suspensas em um hidrogel não polimerizado (mostrado em rosa) e pipetadas em cada poço onde se infiltram no andaime. O hidrogel é então deixado gelificar para encapsular as células dentro do hidrogel suportado por andaime. (C) Microscopia: o microtecido resultante pode ser visualizado usando microscopia automatizada de campo amplo. (D) Análise baseada em imagem: Imagens adquiridas de células fluorescentes (verde) suspensas em gel podem ser analisadas usando pipelines de análise de imagem padrão. Imagem de microscopia de epifluorescência representativa de células KP4 que expressam GFP em um poço de 96 SPOT. A barra de escala é de 500 μm. Este número foi modificado de14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Outra vantagem do SPOT é que o sistema pode ser integrado a um manipulador de líquidos de código aberto, facilitando a fabricação automatizada e reprodutível de culturas de DOP. Esse avanço reduz a variabilidade do usuário e oferece suporte a projetos experimentais complexos, incluindo triagem de medicamentos de alto rendimento e abordagens de medicina personalizada18. O SPOT também demonstrou ser compatível com a caracterização multiplexada baseada em célula única de fenótipos celulares em ambientes tumorais heterogêneos e a recuperação das células sob demanda do SPOT por digestão18. Esses recursos posicionam o SPOT como uma ferramenta versátil para aplicações de triagem, onde dados longitudinais de alta resolução são essenciais para avaliar a eficácia do medicamento e o comportamento celular em condições fisiologicamente relevantes14,18. Ao combinar essas inovações técnicas, o SPOT aborda limitações críticas nos sistemas tradicionais de cultura 3D.

Este protocolo fornece um guia abrangente para a fabricação de componentes SPOT, placas de montagem e métodos de semeadura para culturas organoides 3D robustas e reprodutíveis. Inclui instruções detalhadas para semeadura manual de placas usando uma micropipeta e fluxos de trabalho de semeadura automatizados com um manipulador de líquidos, que suporta formatos de 96 e 384 poços. Além disso, este protocolo descreve medidas essenciais de controle de qualidade, como verificar a distribuição uniforme do gel e a integridade do andaime, para manter altos padrões experimentais. Estratégias de solução de problemas também são fornecidas para resolver problemas comuns, como infiltração incompleta de gel, evaporação durante a semeadura e desprendimento de andaimes, equipando os pesquisadores com soluções práticas para otimizar seus fluxos de trabalho e obter resultados confiáveis.

O SPOT foi projetado para preencher as lacunas que os ensaios organoides tradicionais enfrentam, incluindo desafios relacionados à realização de ensaios e mudanças de meio, preservando a integridade do gel 10,11,12,13. O objetivo geral deste método é fabricar uma plataforma suportada por andaimes que suporte a cultura de organoides por um período de 12 dias. Além disso, este método também abrange a geração de matrizes de tecidos no SPOT por meio de semeadura manual ou assistida por manipulador de líquidos para permitir que os usuários realizem qualquer perturbação a jusante, incluindo ensaios de IC50 de drogas e triagem de moléculas pequenas.

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Protocolo

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Neste protocolo, foram utilizados como exemplo os organoides de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Esses organoides foram estabelecidos a partir de pacientes com PDAC, adquiridos do UHN Biobank no Princess Margaret Cancer Center (identificador PMLB PPTO.46 da University Health Network, Canadá) sob um protocolo em conformidade com as diretrizes do Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade de Toronto (protocolo # 36107). Por favor, veja todos os materiais, reagentes e equipamentos necessários na Tabela de Materiais.

1. Fazendo a solução de PMMA-acetona (Tempo: 20 min + ~ 8-16 h ocioso)

NOTA: A solução de polimetilmetacrilato (PMMA)-acetona é usada no SPOT para delinear poços e evitar vazamentos entre poços. O procedimento geral é dissolver o PMMA sólido em acetona. Anteriormente, a solução de PMMA-acetona foi usada para padronizar um andaime de papel semelhante para bloquear o meio e a troca gasosa para obter hipóxia em um modelo de cultura 3D diferente17. Aqui, a fórmula de PMMA-acetona é adaptada para gerar andaimes infiltrados em PMMA para fabricação de SPOT.

  1. Em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL rotulado, adicione 1,75 g de pó de PMMA. Em seguida, em uma capela de exaustão, adicione 7,84 mL de acetona e feche bem o tubo para evitar a evaporação do solvente.
  2. Se a visualização do padrão de polímero for necessária, adicione 5-10 gotas de esmalte na solução. Feche bem o tubo da centrífuga. Agite manualmente o tubo para começar a misturar o polimento com a solução de PMMA-acetona.
    NOTA: Para ser consistente em vários lotes de plotagem, dilua uma quantidade conhecida de esmalte em acetona e, em seguida, pipete esta solução como 7,84 mL de acetona.
  3. Coloque a solução de PMMA-acetona no misturador de vórtice durante a noite para garantir que a solução se dissolva. Conservar a solução de PMMA-acetona a 4 °C durante um máximo de 2 semanas, se não estiver aberta.

2. Fazendo andaimes infiltrados em PMMA

(Tempo: Para padronização de 96 PONTOS: 15 min de configuração + 6 minutos por andaime; para padronização de 384 PONTOS: 15 minutos de configuração + 10 minutos por andaime)

NOTA: A fabricação de andaimes infiltrados com PMMA para 96-/384-SPOT é realizada exclusivamente em uma bancada de trabalho (ambiente não estéril). Para fazer andaimes 96/384-SPOT, certifique-se de que o respectivo software de plotadora de edição gráfica ou biblioteca de controle de plotadora vetorial esteja instalado. Observe que algumas subseções do procedimento se aplicam a 96-SPOT e 384-SPOT, enquanto outras são específicas para um tamanho de placa. Neste último caso, serão apresentadas as opções A (para 96-SPOT) e B (para 384-SPOT). Para o padrão (A) 96-SPOT, existem três camadas; em primeiro lugar, as linhas de escorva estabelecem um fluxo consistente da solução de PMMA-acetona; segundo, a matriz de 96 círculos; por fim, um padrão de vendedor viajante (TSP) plota os espaços entre poços. Para o padrão (B) 384-SPOT, o primeiro módulo contém linhas de escorva; segundo, a borda ao redor da placa do poço; Por fim, uma grade é plotada de forma que restem 384 regiões. Para ambos os padrões, os tamanhos dos poços podem ser controlados alterando o código-fonte, conforme demonstrado por Li et al.14.

  1. Configuração para o processo de infiltração de andaimes
    1. Deixar agitar a solução de PMMA-acetona (conservada a 4 °C) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Deixe o suporte do tubo até que a plotagem comece.
    2. Conecte a plotadora à alimentação usando o cabo de alimentação. Uma luz verde piscando indica que o dispositivo está ligado. Conecte o cabo USB da plotadora ao computador designado para plotagem.
    3. Cubra o cavalete do clipe com um pedaço de papel manteiga. Certifique-se de que toda a superfície do cavalete esteja coberta.
      1. Para orientar a plotagem de padrões 96/384-SPOT, prepare um modelo 96-/384-SPOT em uma folha de papel de impressora. Execute as etapas 2.2-2.3 usando uma caneta em vez de uma seringa e papel de impressora no lugar do papel manteiga e do filtro de chá. Quando o modelo estiver pronto, posicione-o no cavalete e cubra-o com papel manteiga. Prossiga para a etapa 2.2 e siga o protocolo para fazer andaimes 96-/384-SPOT.
    4. Prenda o papel manteiga no cavalete usando clipes de fichário (Figura 3A). Pegue uma folha de andaime (ou seja, papel de filtro de chá) e corte ao longo dos lados onde as duas camadas estão fundidas (Figura 3B).
    5. Posicione o filtro de chá cortado - chamado andaime de papel daqui em diante - no cavalete do clipe, com o lado liso (lado externo do filtro de chá) para cima. Prenda-o em três lados. Certifique-se de que o andaime de papel esteja totalmente achatado no cavalete do clipe; Não deve haver rugas na área de plotagem.
  2. Plotando o padrão 96/384-SPOT
    1. Para configurar o software de plotadora e file para 96-SPOT, siga a opção 2.2.2; para configurar o software e file para 384-SPOT, siga a opção 2.2.3.
    2. Configurando o software de plotadora e o arquivo de plotagem 96-SPOT
      1. No aplicativo de software, abra o arquivo SVG para 96-SPOT (Arquivo Suplementar 1; Figura 4A). Na barra de menus, navegue até Extensões > Controle de plotadora (Figura 4B).
      2. Quando a nova janela aparecer, ajuste as configurações para corresponder à Figura Suplementar 1. Retorne à guia Plotar da janela Extensão de controle de plotadora. Deixe isso aberto para mais tarde.
    3. Configurando a API da biblioteca de controle de plotadora vetorial e o arquivo de plotagem 384-SPOT
      1. Abra a janela do Prompt de Comando (Windows) ou Terminal (Mac). Insira o comando para iniciar o notebook de computação interativa designado. Certifique-se de que o bloco de anotações seja aberto em um navegador.
      2. Selecione o arquivo de código 384-SPOT (Arquivo Suplementar 2) para abrir. Usando uma ponta de 20G (ou ponta de 16G para o padrão 384-SPOT), aspire 1 mL de solução de PMMA-acetona com a seringa de plotagem de 3 mL (Figura 3C).
        NOTA: A válvula de controle de fluxo entre a seringa de carregamento de 10 mL e o tubo EVA deve estar aberta (paralela ao cano). Como o processo de infiltração é acionado pela gravidade, certifique-se de que a seringa de plotagem de 3 mL esteja sempre cheia entre a marcação de 0,5-1,5 mL para manter o volume de dispensação consistente durante a plotagem.
    4. Enquanto a ponta da seringa de plotagem de 3 mL ainda estiver dentro da solução de PMMA-acetona, feche a válvula de controle de fluxo entre a seringa de carregamento de 10 mL e o tubo de EVA (traga-a perpendicularmente ao cilindro).
    5. Feche rapidamente o tubo da solução de PMMA-acetona. Coloque a seringa de 3 ml no suporte da caneta. Ajuste a altura da seringa em relação ao suporte para obter o seguinte alinhamento (Figura 3D).
    6. Ajuste a posição do cavalete de clipe para que a ponta da seringa de 3 mL fique na origem do padrão plotado (ou seja, o ponto escuro no canto superior esquerdo do padrão do modelo). Levante o suporte da caneta plotter com a seringa presa a ele para deslizar o cavalete de clipe por baixo.
    7. Desconecte rapidamente a seringa de 10 mL do tubo para permitir que a pressão atmosférica exerça pressão sobre a solução de PMMA-acetona armazenada na seringa de plotagem de 3 mL. Abra a válvula de controle de fluxo.
    8. Para começar a traçar o padrão 96-SPOT, siga as etapas 2.2.9; para começar a plotar 384-SPOT, siga a etapa 2.2.10.
    9. Inicie a plotagem de 96-SPOT na plotadora designada, conforme descrito abaixo.
      1. No software, clique em Aplicar nas Extensões de controle da plotadora. A plotadora agora começará a ser executada, plotando o padrão PMMA. Nenhuma ação adicional é necessária até que a plotagem seja concluída e o suporte da caneta plotter retorne à sua posição inicial.
      2. Para pausar a plotadora durante a plotagem, pressione o pequeno botão prateado no lado esquerdo da plotadora. Em seguida, por meio da guia Extensões de controle da plotadora > Retomar no software gráfico, opte por retomar a plotagem de onde parou ou retornar o suporte da caneta à posição inicial (Figura Suplementar 1C(iii)).
    10. Inicie a plotagem de 384-SPOT na interface de computação designada, conforme descrito abaixo.
      1. Na interface, clique em Reiniciar kernel e execute novamente (seta dupla na barra de ferramentas). O código agora começará a ser executado, plotando o padrão PMMA. Nenhuma ação adicional é necessária até que o padrão seja plotado e o suporte da caneta retorne à sua posição inicial.
      2. Para pausar a plotadora durante a plotagem, pressione o botão Prata Pequena no lado esquerdo da plotadora. Mova manualmente o cabeçote de impressão totalmente para trás e para a esquerda para que ele atinja sua posição inicial. Reconecte a plotadora à energia. Ao contrário da plotagem de 96-SPOT, não há como retomar a plotagem de 384-SPOT de onde foi pausada; Substitua o andaime de papel e inicie o código desde o início.
  3. Descarregar a seringa e limpar
    1. Assim que a plotagem estiver concluída, recoloque a seringa de 10 mL no tubo. Remova a seringa de 3 mL do suporte da caneta plotter e transfira qualquer solução restante de PMMA-acetona de volta para o frasco para injetáveis ou descarte se tiver ocorrido evaporação significativa durante as etapas anteriores.
    2. Lave o cilindro da seringa de 3 ml pipetando em acetona. Deixe o sistema de seringa-tubo secar ao ar antes de devolvê-lo ao seu local de armazenamento.
    3. Solte cuidadosamente o andaime SPOT do cavalete do cavalete.
    4. Inspecione os andaimes SPOT plotados para garantir que possam ser usados para experimentos (Figura 3E, F). Consulte a Tabela 1 de solução de problemas e a Tabela 2 e a Tabela 3 de garantia e controle de qualidade para obter orientação.
    5. Armazene todos os andaimes com padrão PMMA em um saco zip-lock em local fresco e seco.

3. Corte de fita de 96/384 poços

(Tempo: para padronização de 96 pontos: 15 minutos por 5 pedaços de fita; para padronização de 384 pontos: 30 minutos por 5 pedaços de fita)

NOTA: Esta é uma das maneiras mais eficientes de cortar fitas com precisão e eficiência, especialmente para padrões de fita de 384 poços. Este método também oferece a possibilidade de gravação a laser de uma camada da fita (plástico da tampa superior) para melhorar a usabilidade durante o processo de montagem. Alternativamente, as fitas também podem ser cortadas usando cortadores de papel em um ritmo mais lento sem o processo de gravação.

  1. Abra o arquivo de corte a laser de padrão de fita de 96/384 poços (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4) e carregue o padrão de impressão codificado com três cores diferentes no software de corte a laser clicando em Plotar com as seguintes configurações na Figura Suplementar 2A.
  2. Coloque um pedaço de fita adesiva na superfície do cortador a laser e certifique-se de que a fita esteja achatada suavemente na superfície. Use fitas de papel ou pesos pesados para segurar as fitas durante o corte.
    NOTA: Certifique-se de que a fita esteja plana na superfície do cortador a laser. Qualquer solavanco pode afetar a qualidade das fitas cortadas, principalmente as fitas de 384 poços.
  3. Ajuste o local do padrão de impressão para alinhar com o local da fita com base no manual do cortador a laser.
  4. Corte as fitas de 96/384 poços usando a mesma configuração de cortador a laser, conforme mostrado na Figura Suplementar 2B. A ordem das linhas com cores específicas é importante. Corte a linha vermelha antes da linha verde. Corte o azul no final.
    Linha vermelha: modo Rast/Vest com 45% de potência do laser, 80% de velocidade, 1000 PPI e eixo Z de 0,50 mm.
    Linha verde: modo Rast/Vest com 7% de potência do laser, 100% de velocidade, 1000 PPI e eixo Z de 0,50 mm.
    Linha azul: modo Rast/Vest com 50% de potência do laser, 80% de velocidade, 1000 PPI e eixo Z de 0,50 mm.
  5. Armazene as fitas padronizadas adequadamente até a montagem SPOT.

4. Montagem 96/384-SPOT (Tempo: 1 h)

NOTA: Esta seção detalha o procedimento para montagem de dispositivos 96-/384-SPOT em um ambiente estéril, como um gabinete de biossegurança (BSC). Alternativamente, os dispositivos 96-/384-SPOT podem ser pré-montados em um ambiente não estéril e depois esterilizados por meio do processo de esterilização por gás etileno.

  1. Preparação do andaime SPOT para montagem
    1. Pegue um andaime com padrão PMMA para 96 ou 384-SPOT. Corte o excesso de papel ao redor da região azul do andaime. Deixe 5 mm de espaço em branco ao redor do perímetro da região azul. A folha resultante terá aproximadamente 760 mm x 1300 mm.
      NOTA: Não corte a linha de escorva. É útil para determinar qual lado do andaime é áspero/liso (Figura 3E, F).
    2. Para preparar um andaime de 96 pontos para montagem, siga a etapa 4.1.3. Para preparar um andaime 384-SPOT, siga a etapa 4.1.4.
    3. Realize a perfuração de espaços entre poços no andaime 96-SPOT.
      1. Coloque um pedaço de filme de polietileno (1000 mm x 1500 mm) sobre um suporte acrílico rígido (2700 mm x 2700 mm). Coloque o suporte coberto com filme de polietileno na superfície de trabalho e coloque o andaime sobre o filme de polietileno (Figura 5A).
      2. Alinhe uma borda da régua entre as duas primeiras linhas de modo que o traçado ao longo dessa borda não trace um poço.
      3. Coloque a roda de rastreamento contra a régua na parte inferior do andaime. Role a roda de rastreamento para cima até o topo do andaime, usando a régua para guiar o caminho da lâmina. Repita isso para todos os espaços entre linhas no andaime (ou seja, 7x).
      4. Repita as etapas 4.1.3.2 e 4.1.3.3 para todos os outros espaços entre colunas, começando com o espaço entre as duas primeiras colunas.
    4. Não realize perfuração de espaços entre poços no andaime 384-SPOT seguindo as etapas abaixo.
      1. Não perfure os espaços entre poços do andaime 384-SPOT. Prossiga diretamente para a etapa 4.2.
  2. Esterilização de materiais SPOT e equipamentos de montagem
    1. Coloque o andaime impresso, duas fitas de 96 poços (ou fitas de 384 poços), placa sem fundo de 96 poços (ou placa sem fundo de 384 poços), tampa de placa de 96 poços (ou tampa de placa de 384 poços), filme de policarbonato, placa de polidimetilsiloxano (PDMS), saco plástico resselável, pinça e faca de precisão no BSC, UV por 20 min de um lado (Figura 5B).
    2. Vire todos os materiais e equipamentos de montagem para o outro lado e UV por mais 20 min.
  3. Fixação do andaime à primeira fita de 96/384 poços
    1. Coloque o andaime com o lado áspero para cima (Figura 3F) na laje PDMS, de modo que as linhas corram horizontalmente. Use a linha de escorva para determinar qual lado é áspero (a linha de escorva alinhada à direita indica o lado áspero para cima).
    2. Alise o andaime na laje PDMS de forma que não haja rugas ou bolhas no andaime (ou embaixo). Remova a camada protetora do lado não gravado da fita dupla face. Aperte levemente o meio da fita e alinhe as duas colunas do meio da fita com o andaime.
    3. Uma vez alinhado, pressione o meio da fita para baixo. Alise a fita no andaime, começando do meio e movendo-se para fora.
      NOTA: Um andaime alinhado incorretamente terá um padrão óbvio de PMMA sobreposto na região de semeadura do poço.
    4. Use a pinça para remover cuidadosamente o andaime da laje PDMS e armazene a laje para futuras fabricações.
  4. Fixação do andaime à segunda fita de 96/384 poços
    1. Coloque o andaime na bancada. Vire o andaime de forma que o lado liso (lado sem fita adesiva) fique voltado para cima.
    2. Remova a camada protetora intermediária do lado gravado da segunda fita. Certifique-se de que as duas colunas intermediárias da fita estejam expostas. Se o design de fita não gravada for usado, remova completamente a camada protetora de um lado.
    3. Aperte levemente o meio da fita e alinhe as duas colunas do meio da fita com o andaime.
    4. Assim que a fita estiver alinhada ao andaime, pressione o meio da fita para baixo. Se o desenho da fita gravada for usado, remova as outras duas camadas protetoras adjacentes à seção intermediária exposta da fita. Alise a fita no andaime, começando do meio e movendo-se para fora.
  5. Fixação do andaime à placa sem fundo
    1. Remova a camada protetora da fita do lado áspero do andaime. Se estiver usando o design de fita gravada, remova apenas a camada protetora do meio.
    2. Alinhe o andaime com a parte inferior da placa sem fundo (com uma tampa). Uma vez alinhado, pressione o meio do andaime na parte inferior da placa. Se estiver usando o desenho gravado, remova as camadas protetoras adjacentes ao meio exposto. Alise o andaime na placa do meio para fora.
  6. Fixação do andaime ao filme de policarbonato
    1. Usando uma pinça, afrouxe cuidadosamente a camada protetora do filme de policarbonato. Uma vez solto, retire lentamente a camada protetora do filme. Não crie recortes no filme, pois isso afetará suas propriedades ópticas para imagens de microscopia.
    2. Repita a etapa 4.6.1 com o outro lado do filme de policarbonato. Depois que ambas as camadas protetoras forem removidas, coloque o filme de lado na bancada.
    3. Remova a camada protetora da fita presa ao fundo da placa. Pressione o filme de policarbonato no andaime, começando do meio para fora.
    4. Pressione firmemente o filme de policarbonato no fundo da placa de modo que todos os poços obtenham uma borda bem pronunciada.
    5. Usando uma faca de precisão, corte cuidadosamente o excesso de material do fundo da placa.
      NOTA: Preste atenção extra para não cortar a placa ou qualquer um dos poços. Se a faca não cortar facilmente, verifique se ela está cortando a placa.
  7. Armazenamento de 96/384-SPOT após a montagem
    1. Depois de montar totalmente o 96-SPOT, coloque-o em um saco plástico transparente que possa ser fechado novamente. Traga a bolsa para fora do BSC.
    2. Coloque um suporte acrílico rígido na parte inferior da placa. Prenda o suporte de acrílico na placa nos cantos opostos (Figura 5C). Mantenha clamped por pelo menos 30 minutos em cada canto antes de usar.
    3. Guarde o prato em um espaço limpo e seco até o uso.

5. Semeadura 96/384-SPOT (Tempo: 2 h 45 min)

NOTA: Esta seção detalha o procedimento para semear dispositivos 96-/384-SPOT para criar microtecidos 3D uniformes. O processo de semeadura envolve a dispensação cuidadosa de um volume de gel celular definido (por exemplo, 5 μL para 96-SPOT ou 2 μL para 384-SPOT) no andaime SPOT pré-montado. Para garantir uma infiltração uniforme e distribuição do gel, a gotícula célula-gel é guiada ao longo da estrutura porosa do andaime através da absorção capilar. Esta etapa pode ser realizada manualmente usando uma micropipeta ou automatizada com manuseio de líquidos. Após a semeadura, as placas são incubadas a 37 °C para permitir a polimerização em gel e o encapsulamento celular.

  1. Preparação da placa 96/384-SPOT
    1. Solte o 96-/384-SPOT e remova o suporte de acrílico da parte inferior.
    2. Em um BSC, remova o SPOT do saco plástico. Ligue o UV para esterilizar o interior da placa e cubra por 20 minutos antes de fechar a tampa e virar para o fundo da placa por mais 20 minutos de tratamento UV.
    3. Pipetar 70 μL de PBS em cada espaço entre poços da placa 96-SPOT. Não pipete PBS para a placa 384-SPOT. Refrigerar a placa a 4 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes da sementeira.
  2. Preparação de células
    1. Separe as células de frascos de cultura ou organoides de cúpulas de gel com base no manuseio recomendado e conte a quantidade de células usando o hemocitômetro de acordo com as instruções do fabricante. Observe a densidade celular da suspensão celular (ou seja, número de células por mL) para calcular o volume de suspensão celular necessário para as etapas 5.4.1 a 5.4.2 com base na densidade de semeadura desejada.
  3. Preparação de gel
    1. Seguindo as instruções de preparação do hidrogel otimizadas anteriormente 17,19,20,21, crie o hidrogel dispensando 1 mL de 3 mg/mL de colágeno bovino tipo 1 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: Os componentes e a mistura resultante devem ser mantidos no gelo durante toda a duração da preparação.
    2. Dispense 125 μL de meio essencial mínimo concentrado (MEM) 10x no colágeno bovino. Pipete lentamente para cima e para baixo para misturar até que a mistura mude de rosa para amarelo.
    3. Dispense 8 μL de bicarbonato de sódio 0,8 M na mistura de colágeno bovino. Pipete lentamente para cima e para baixo para misturar até que a mistura fique rosa pálido. Use a solução misturada dentro de 30 minutos após a preparação para garantir uma gelificação consistente em vários experimentos.
      NOTA: Se a mistura permanecer amarela, titular a solução a pH 7 adicionando 0,8 M em alíquotas de 0,5 μL até obter uma cor rosa pálido. OPCIONAL: Seguindo o mesmo procedimento, o gel pode ser preparado para culturas que requerem maior concentração de colágeno. Para a cultura de organoides, use a mistura de hidrogel caracterizada por Landon-Brace et al.17.
  4. Suspensão de células em gel
    1. Dispense o volume de suspensão celular necessário para a densidade célula-gel alvo em um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 300 x g por 5 min.
    2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em gel (o volume varia de acordo com a concentração alvo)
  5. Semeando a placa 96-/384-SPOT manualmente
    1. Coloque a placa 96-/384-SPOT em uma bolsa de gelo congelada. Para propagar o 96-SPOT, siga as etapas 5.5.2. Para propagar 384-SPOT, siga as etapas 5.5.3.
    2. Semeando manualmente o 96-SPOT
      1. Pré-revestir uma ponta de pipeta de 10 μL com a mistura de gel celular. Aspire 5 μL de gel usando uma pipeta de 20 μL e ejete para a primeira parada até formar uma gotícula na ponta. Toque a gota no meio de um poço.
        NOTA: Ejetar o gel pressionando a pipeta até a segunda parada pode introduzir bolhas de ar. Todos os poços devem ser semeados dentro de 5 min para uma gelificação consistente entre os poços.
      2. Após a semeadura de todos os poços desejados, cubra a placa e incube a 37 °C por 45 min de acordo com as instruções do fabricante para polimerizar o gel. Dispense 200 μL de meio em cada poço semeado e incube por no mínimo 1 hora ininterrupta antes de qualquer imagem ou perturbação necessária.
    3. Semeando manualmente o 384-SPOT
      1. Pré-revestir uma ponta de pipeta de 10 μL com a mistura de gel celular. Aspire 2 μL de gel usando uma pipeta de 10 μL e ejete até a primeira parada até que uma gotícula se forme na ponta.
        NOTA: Uma pipeta multicanal de 10 μL é fortemente recomendada.
      2. Toque a gota no meio de um poço. Após a semeadura de todos os poços desejados, cubra a placa e incube a 37 °C por 45 min de acordo com as instruções do fabricante para polimerizar o gel.
      3. Dispense 60 μL de meio em cada poço semeado e incube por no mínimo 1 h ininterrupta antes de qualquer imagem ou perturbação necessária.
    4. Semeando 96/384-SPOT usando um manipulador de líquidos
      1. Durante a preparação da mistura célula-gel, ligue o manipulador de líquidos e seu módulo de filtro HEPA no máximo. Pulverize cuidadosamente etanol a 70% dentro do manipulador de líquidos e limpe-o com toalhas de papel embebidas em etanol.
      2. Carregue o protocolo de semeadura 96-SPOT ou 384-SPOT (Arquivo Suplementar 5 ou Arquivo Suplementar 6) antes de realizar a calibração do cabeçote da pipeta. Instale os módulos de temperatura nos slots 1 e 4 (Figura 6A).
      3. Para fins de calibração, use caixas designadas de pontas de filtro P20 e P200. Carregue-os nos slots 5 e 6, respectivamente (Figura 6B). Calibre o cabeçote da pipeta com base nos prompts exibidos no software. Após a calibração, mude para a caixa de pontas de filtro estéreis P20 e P200 para semear nos slots 5 e 6. Pulverize novamente a superfície com etanol 70% e feche a porta até a semeadura.
        NOTA: É essencial calibrar as pontas para a parte superior da placa 96-/384-SPOT com precisão. Recomenda-se o uso de fita de vedação de placa para ajudar a visualizar o eixo z das pontas em relação ao topo da placa. A posição ideal é quando as pontas do cabeçote multicanal tocam a fita de vedação da placa e criam um pequeno amassado.
    5. Ligue os dois módulos de temperatura e ajuste-os para 4 °C enquanto as células estão na última etapa de centrifugação durante a preparação da mistura célula-gel. Após a conclusão da etapa 5.4, carregue a quantidade desejada de mistura célula-gel em cada tubo dos tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 mL dentro do BSC.
      NOTA: O volume mínimo de mistura célula-gel a ser carregado em cada tubo é: 96-SPOT: 5 μL multiplicado pelo número de colunas que precisavam ser semeadas mais o volume morto; 384-SPOT: 2 vezes 2 μL multiplicado pelo número de colunas que precisaram ser semeadas vezes e, em seguida, mais o volume morto. Recomenda-se que o volume morto seja de cerca de 10 a 20 μL por tubo para evitar bolhas e colunas incompletas no final.
    6. Feche os tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 mL usando as tampas planas de 8 tiras antes de transferir a mistura de célula-gel para fora do BSC no gelo.
    7. Carregue a placa SPOT pré-resfriada no módulo de temperatura no slot 4 com o bloco de formato de placa de fundo plano (Figura 6B).
    8. Carregue os tubos de PCR de 8 tiras de 0.2 mL com mistura de célula-gel no módulo de temperatura no slot 3 com o bloco de formato de 96 poços.
    9. Abra as tampas planas e a tampa da placa SPOT e guarde-as dentro do manipulador de líquidos, mas longe das ranhuras usadas. Abra a tampa da caixa de pontas do filtro P20 e P200.
    10. Execute o protocolo. Após a semeadura de todos os poços desejados, cubra a placa e incube a 37 °C por 45 min de acordo com as instruções do fabricante para polimerizar o gel.
    11. Dispense 200 μL ou 60 μL (96-/384-SPOT) de meio em cada poço semeado e incube por um mínimo de 1 h ininterruptamente antes de qualquer imagem ou perturbação necessária.

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Resultados

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O padrão PMMA do andaime de papel serve como uma barreira física para evitar a troca de conteúdo entre os poços. Esse projeto é fundamental para garantir que os poços adjacentes permaneçam química e biologicamente isolados, evitando a difusão não intencional de meios, drogas, fatores secretados ou mesmo células14. A incorporação do PMMA permite uma compartimentalização precisa, tornando o SPOT uma plataforma confiável para triagem de alto rendimento e estudos de co-cultura, onde a contaminação cru...

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Discussão

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Neste protocolo, é fornecido um guia detalhado para a fabricação e uso de SPOT de 96 e 384 poços, abrangendo montagem, manual e semeadura de gel celular assistida por manipulador de líquidos. Ao contrário dos sistemas tradicionais de tampão de hidrogel, o SPOT elimina artefatos relacionados ao menisco, facilitando a imagem não destrutiva e in situ de organoides, conforme descrito anteriormente 14,16,22.

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a ajuda de Jennifer Lam na aquisição de imagens. A Figura 1, a Figura 2 e a Figura 7A foram criadas com BioRender.com. Este trabalho foi apoiado pela concessão Discovery do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) (concessão #RGPIN-2021-03488) para APM; o programa Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions para APM; as Bolsas de Pós-Graduação do NSERC Canadá - Programa de Doutorado para RC; o Prêmio Peterborough KM Hunter Charitable Foundation para RC; a bolsa CRAFT do Conselho Nacional de Pesquisa (NRC) concedida à NTL; o NSERC CREATE TOeP para N.T.L.; o Prêmio de Pesquisa de Estudantes de Graduação do NSERC para Z. K.; e o Prêmio de Excelência da Universidade de Toronto para CMT

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos PCR de 0,2mL (tiras de 8) Sarstedt72.985.002
Tubo de centrífuga de 1,5 mLFroggaBioLMCT1.7B
1000-μ L ponteiras de pipetaEclipse4-1019-260-000
Pipetas sorológicas de 10 mLFroggaBio394010
Seringa de 10 mLBD, Canadá302995
10x Meio essencial mínimo (MEM 10x)Gibco11430030
Prato de 150 mmCorning430599
Ponteiras dispensadoras de calibre 16 com conexão Luer lockMcMaster-Carr, Illinois, EUANº 6699A2
20µ L racks de pontas de filtroOpentrons999-00099
200µ L racks de pontas de filtroOpentrons999-00081
200-μ L ponteiras de pipetaEclipse4-1030-260-000
Pontas de distribuição de calibre 20 com conexão Luer lockMcMaster-Carr, Illinois, EUANº 6699A4
Placa de poço sem fundo de 384 poços (preta)Greiner82051-544
Seringa de 3 mL BD, Canadá309657
Tubo de centrífuga cônico de polipropileno de 50 mLVWRCA21008-940
Tubo de centrífuga cônico de polipropileno de 50 mLVWRCA21008-940
Placa de poço sem fundo de 96 poços (preta)Greiner82050-714
AcetonaFisher CientíficoA18-1
Balança analíticaN/AN/A
Extensão AxiDraw para Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)N/AN/A
API Python do AxiDraw (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) N/AN/A
Máquina de Escrita e Desenho Pessoal de Alto Desempenho AxiDraw V3Cientistas Loucos do Mal, EUAN/A
Colágeno bovino (PureCol 3 mg/ml)BioMatrix Avançado5005
Linhagem celular de escolhaN/AN/A
Cavalete de clipe (incluído no pacote AxiDraw V3)Cientistas Loucos do Mal, EUAN/A
Meios de cultura de escolhaN/AN/A
Fita de proteção contra retenção de sujeira3M6851 PN36851
Fita adesiva poliacrílica dupla face (800 mm x 1200 mm)Pesquisa de adesivos, ARcare90106NB
Soro fetal bovino (FBS)Gibco12483-020
Filtros de chá Finum XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburgo, Alemanha420.69.00
Tampas planas para tubos de PCR de 0,2 mL (tiras de 8)Sarstedt65.989.002
Grampos de mola de plástico para serviço pesadoPONTO DE REFERÊNCIA1024-554
Módulo HEPA - Modelo 110-130V 60HzOpentrons999-00109
Bolsa de gelo (congelada, 1400 mm x 1800 mm)N/AN/A
Software InkscapeN/AN/A
Cortador a laserSistema de laser universalVLS3.75
Tubo de acetato de etil vinil (EVA) em miniatura de diâmetro externo de 0,07 polegadasMcMaster-Carr, Illinois, EUA1883T3
Pipeta eletrônica multicanal P20 (Gen2)Opentrons999-00005
Pipeta eletrônica multicanal P300 (Gen2)Opentrons999-00006
EsmalteSally HansenSBS-006861Opcional, para pigmentação de tinta PMMA
Opentrons OT-2Opentrons999-00111
Pipeta P1000GilsonFA10006M
Pipeta P200 de 8 canaisGilsonF144072
Pipeta P200GilsonFA10005M
Toalhas de papelN/AN/A
ParafilmeBemis Company, Inc.52859-079
Papel pergaminho   N/AN/A
Pipetas PasteurVWR14672-380
Penicilina-estreptomicina (P/S)Sigma-AldrichPág. 4333
Poli (metacrilato de metila) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Filme de policarbonato (760 mm x 1300 mm)McMaster-Carr85585K102
Monómero de polidimetilsiloxano e reticulador (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Adesivos Ellsworth4019862
Faca de precisãoN/AN/A
Suporte acrílico rígido (tamanho instalado no fundo da placa do poço)McMaster-Carr8560K239
Suporte de papelão rígidoN/AN/A
RéguaN/AN/A
TesouraN/AN/A
Bicarbonato de sódio (0,8M em água destilada)Sigma-AldrichS6014
Plataforma de temperatura com blocos de alumínio (Gen2)Opentrons999-00097
Roda de rastreamento HEEPDD (Amazon)B07YQWB284
Fita transparente N/AN/A
Azul de tripanoGibco15250-061
TripsinaGibco25200-056
PinçasN/AN/A
Misturador de vórtice N/AN/A

Referências

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  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

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