Este artigo apresenta um protocolo para a entrega precisa guiada por ultrassom de células-tronco vasculares à parede do vaso aórtico. A técnica atinge efetivamente a parede do vaso e promove o reparo vascular em aneurismas e dissecções da aorta.
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Artigo de método
Entrega de células-tronco guiadas por ultrassom de precisão para reparo vascular em doenças da aorta
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aneurismas da aorta e ruptura de dissecções são emergências cardiovasculares com risco de vida. A prevenção precoce e o controle da progressão da doença são essenciais para melhorar os resultados dos pacientes. As células-tronco vasculares desempenham um papel crucial no reparo de lesões vasculares em várias doenças vasculares. No entanto, as terapias de injeção intravascular de células-tronco encontram desafios para garantir o enxerto eficiente de células-tronco exógenas dentro da parede vascular.
Para explorar uma abordagem mais eficaz e minimamente invasiva para a entrega de células-tronco em doenças da aorta, desenvolvemos uma tecnologia de entrega de células-tronco direcionadas com precisão guiada por ultrassom. Especificamente, a técnica utilizou um sistema de ultrassom Doppler colorido de animais pequenos de ultra-alta resolução para localizar com precisão a parede vascular da aorta ascendente em modelos de camundongos com doença aórtica. Posteriormente, 1 × 10 células-tronco vasculares marcadas com6 mCherry misturadas em 25 μL de Matrigel foram injetadas usando uma agulha de 29 G. A progressão da doença foi monitorada por ultrassonografia de pequenos animais. Finalmente, a aorta foi colhida e analisada usando imagens 3D com um microscópio de folha de luz para rastrear células-tronco vasculares injetadas.
Os resultados acima demonstram que as células-tronco vasculares injetadas foram entregues com precisão à parede vascular da aorta ascendente com o mínimo de invasividade, promovendo efetivamente o reparo vascular em aneurismas e dissecções da aorta. Essa tecnologia de entrega de células-tronco guiada por ultrassom oferece um método promissor e minimamente invasivo para transplante de células-tronco, controlando potencialmente a progressão de aneurismas e dissecções da aorta e outras doenças cardiovasculares relacionadas em clínicas no futuro.
Introdução
Os aneurismas e dissecções da aorta (DAA) são doenças cardiovasculares comuns e altamente letais, tipicamente caracterizadas por início insidioso e rápida progressão. A incidência de DAA varia de 1,3% a 8%, com uma estimativa de 150.000 a 200.000 mortes em todo o mundo a cada ano 1,2. Devido ao início agudo e aos sintomas clínicos sutis, muitos pacientes estão em estado crítico no momento do diagnóstico, perdendo a janela ideal para o tratamento. Embora os tratamentos farmacológicos, como bloqueadores β-adrenérgicos e bloqueadores dos receptores da angiotensina, possam retardar a expansão do aneurisma até certo ponto, essas terapias fornecem principalmente alívio sintomático e não demonstraram prevenir efetivamente o início ou a progressão do AAD3.
Atualmente, o manejo clínico depende principalmente de intervenções cirúrgicas, incluindo reconstrução da raiz da aorta, substituição da aorta ascendente, cirurgia de Bentall e correção endovascular de aneurismas da aorta 4,5. No entanto, para pacientes com DAA genética, particularmente aqueles que ainda não atingiram as indicações cirúrgicas, faltam tratamentos etiológicos eficazes e as abordagens farmacológicas lutam para controlar a progressão da doença a longo prazo. Em pacientes com síndrome de Marfan (MFS), embora o tratamento médico possa retardar a dilatação da aorta, estudos indicam que alguns indivíduos experimentam uma taxa mais rápida de expansão aórtica e enfrentam um risco maior de dissecção da aorta5. Portanto, fornecer intervenções eficazes para esses pacientes, que ainda não atendem aos critérios cirúrgicos, continua sendo um desafio clínico significativo. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais direcionadas tornou-se uma questão fundamental que precisa ser abordada no tratamento das doenças da aorta.
A patogênese da DAA envolve principalmente apoptose extensa de células musculares lisas (SMCs) e afinamento da média, levando à fragilidade estrutural da parede aórtica. Especificamente, a perda progressiva de SMCs aórticos é uma marca registrada da AAD, manifestada por apoptose de SMCs, degradação da matriz extracelular (MEC), infiltração de células imunes e aumento do estresse oxidativo2. As células-tronco vasculares são um tipo de célula-tronco adulta que reside na parede do vaso, capaz de se diferenciar em SMCs ou células endoteliais. Em condições fisiológicas normais, as células-tronco permanecem quiescentes, mas em condições patológicas, elas se tornam ativadas, sofrendo auto-renovação e diferenciação para contribuir para o reparo tecidual6. Estudos recentes têm enfatizado o papel crítico das células-tronco da parede vascular na lesão vascular, particularmente no remodelamento de enxertos venosos, aterosclerose, reestenose, hipertensão e em doenças ou condições patológicas como a DAA 7,8,9,10,11,12,13.
Embora as tecnologias existentes para entrega de células-tronco - como injeção local específica de tecido e infusão intravenosa sistêmica - sejam relativamente avançadas, a entrega de células-tronco à parede aórtica apresenta desafios significativos14,15. O rápido fluxo sanguíneo na aorta, juntamente com a contração dinâmica e o relaxamento da parede vascular, dificulta a entrega eficiente de células e garante a sobrevivência a longo prazo das células transplantadas no tecido vascular.
Neste estudo, descrevemos uma nova técnica de injeção de epimembrana de parede de vaso fechado que permite a entrega minimamente invasiva e direcionada com precisão de células-tronco da parede vascular sob orientação de ultrassom. Essa abordagem oferece a vantagem de ser de fácil execução, sem a necessidade de toracotomia ou laparotomia, e evita as complicações associadas. Também permite maior flexibilidade durante o processo de injeção, permitindo a concentração direcionada de células-tronco na área desejada, minimizando as respostas imunológicas e outros efeitos colaterais. Além disso, os avanços na tecnologia de limpeza óptica de tecidos agora permitem imagens de resolução subcelular de todo o corpo de camundongos, oferecendo amplas aplicações na reconstrução tridimensional de alta resolução de estruturas teciduais, investigação de mecanismos patológicos, modelagem de doenças e triagem de drogas. Quando combinada com a microscopia de folha de luz, essa tecnologia fornece imagens 3D com alta resolução espacial16. Usando essa abordagem, podemos rastrear as células-tronco vasculares injetadas e observar sua capacidade migratória. Assim, a entrega de células-tronco guiadas por ultrassom representa um método minimamente invasivo promissor para transplante de células-tronco.
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais são conduzidos de acordo com os regulamentos do Comitê de Pesquisa Animal da Capital Medical University e são aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética da Capital Medical University.
1. Preparação de células-tronco vasculares injetadas
NOTA: Para verificar o estado pós-injeção e os efeitos das células-tronco vasculares, as células Sca1 + são isoladas usando seleção de esferas imunomagnéticas conforme descrito anteriormente17 , 18 , 19 , transfectadas com um lentivírus carregando o repórter mCherry para observação subsequente da localização e distribuição celular e, em seguida, cultivadas. Células de passagens 5 ou anteriores com boas condições de crescimento e expressão de Sca1+ marcada com mCherry são usadas para experimentos subsequentes20.
- Colha a aorta de camundongos C57BL / 6J de 6-8 semanas de idade, separe o tecido adventício ao microscópio e pique a aproximadamente 0,5 mm. Aplique gelatina a 0,04% no fundo do frasco de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO5 5% 2 para promover a fixação e proliferação celular. Após 20 min, aspirar a gelatina e colocar o tecido picado no fundo do frasco de cultura17,21, com o fundo virado para cima durante 2-3 h. Depois que o tecido estiver firmemente preso ao fundo do frasco de cultura, coloque o fundo do frasco de cultura para baixo, adicione meio de cultura ao frasco e incube a 37 ° C em uma incubadora de CO5 2 a 5%.
- Após 3 h, remova o frasco de cultura e adicione meio DMEM contendo 20% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de LIF, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
- Após 3 dias, uma vez que as células tenham migrado do tecido e atingido 80%-90% de confluência, adicione 0,05% de tripsina e subcultive-as na proporção de 1:3.
- Para a passagem 3, substitua o meio por DMEM contendo 15% de soro fetal bovino; para a passagem 5, substitua o meio por DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (outros componentes permanecem inalterados).
- Digerir as células vasculares adventícias e incubá-las no gelo com microesferas anti-Sca1+ . Adicione a suspensão de células em uma coluna equipada com um sistema de classificação de células magnéticas e colete-as18. Use células com boas condições de crescimento das passagens 5 ou anteriores para experimentos subsequentes.
NOTA: Para garantir a vitalidade celular, recomenda-se que as células para injeção in vivo tenham uma viabilidade de ≥90% , conforme determinado pela coloração com azul de tripano. - Uma hora antes da injeção, adicione tripsina a 0,05% às células, conte-as usando um hemocitômetro e remova o sobrenadante centrifugando em temperatura ambiente a 200 × g por 5 min.
- Ressuspenda as células em Matrigel (pré-descongeladas a 4 ° C) a uma concentração de 4 × 107 células / mL como um transportador para transplante de células-tronco, para imitar o ambiente de crescimento in vivo. Agite suavemente a mistura e mantenha-a no gelo até que esteja pronta para a injeção.
2. Preparo pré-operatório de camundongos
- Sujeitar os camundongos a jejum de 12 h antes da injeção sem restringir a água.
- Limpe bem a câmara de indução de anestesia e a plataforma de ultrassom com etanol a 75%.
- Aplique pomada para os olhos e coloque o camundongo na câmara de indução anestésica, com fluxo de oxigênio ajustado para 1 L/min e concentração de isoflurano ajustada para 2-3%. Espere até que o reflexo da dor desapareça, indicando anestesia bem-sucedida e, em seguida, remova cuidadosamente o mouse da câmara.
- Coloque o nariz e a boca do camundongo sob uma máscara de anestesia e ajuste a concentração de isoflurano para 1,5-2%. Posicione o mouse dorsalmente em uma plataforma de 37 ° C para maximizar a exposição abdominal.
- Aplique gel condutor nos quatro eletrodos da plataforma e use fita adesiva para fixar as quatro patas do camundongo aos eletrodos para monitorar o estado fisiológico.
NOTA: O operador usa luvas estéreis, máscara, touca cirúrgica e avental cirúrgico estéril. - Use um cotonete estéril para aplicar creme depilatório no local da injeção, deixe por 1 min e depois limpe suavemente com um novo cotonete. Desinfete o local da injeção usando tintura de iodo 3x.
- Cubra o local da cirurgia, prepare assepticamente uma seringa estéril e mantenha o campo estéril.
3. Injeção guiada por ultrassom de células da parede vascular
NOTA: Todos os procedimentos de ultrassom são realizados usando um sistema de imagem de ultrassom e software (consulte a Tabela de Materiais). Use sondas com frequência central de 40 MHz e agulhas de 29 G .
- Ajuste a plataforma de ultrassom em um ângulo de aproximadamente 30° em relação ao chão. Faça com que o operador fique de frente para o lado direito do animal, com a cabeça do animal voltada para a esquerda. Aplique gel ultrassônico na área depilada e desinfetada.
- Posicione a sonda no lado direito do esterno para exibir o eixo longo do arco aórtico.
- Carregar 25 μL da suspensão de 1 × 106 células estaminais da parede vascular em Matrigel na agulha 29 G. Limpe a ponta da agulha com álcool estéril antes da injeção para minimizar a implantação ectópica de células-tronco.
- Prenda a seringa que contém a suspensão celular ao aparelho de injeção guiado por ultrassom, garantindo que a direção da agulha esteja alinhada com a sonda e em um ângulo de 45° em relação à parede torácica.
- Guie lentamente a agulha de injeção para o campo de visão do ultrassom, ajuste-a ao plano focal e alinhe-a com a linha de marcação do caminho da injeção.
- À medida que a agulha se aproxima da borda da pele, use uma pinça romba para agarrar a pele e a parede abdominal e avance rapidamente a agulha pela parede torácica.
- Sob orientação de ultrassom, direcione a agulha para a região adventícia entre a artéria inominada e o arco aórtico. Remova suavemente a seringa para cima e para baixo para confirmar a posição da agulha.
- Pressione a seringa para injetar a suspensão celular na área alvo.
- Retire a agulha de injeção lentamente e desinfete o local da punção de acordo com os procedimentos padrão.
NOTA: Após procedimentos cirúrgicos, os camundongos devem ser colocados em uma almofada de aquecimento a 37 ° C até ficarem totalmente conscientes e capazes de manter a decúbito esternal, e devem ser monitorados continuamente enquanto estiverem na almofada de aquecimento. Posteriormente, transfira os animais para gaiolas limpas com cama limpa. O monitoramento contínuo deve ser realizado de hora em hora por 24 horas para avaliar possíveis complicações pós-operatórias, incluindo postura curvada e diminuição da atividade.
4. Clarificação do tecido vascular
- Injete células-tronco Sca1+ marcadas com mCherry na região adventícia na junção da artéria inominada e do arco aórtico. Após 4 semanas, eutanasiar os camundongos usando CO2 e, em seguida, coletar o tecido aórtico após a perfusão.
- Fixe o tecido aórtico em paraformaldeído a 4% por 4 h em temperatura ambiente, seguido de lavagens de PBS por 3 x 1 h. Transferir o tecido para uma solução de clarificação de tecidos e incubar numa plataforma vibratória a 37 °C durante 2 dias para obter transparência.
NOTA: A solução de limpeza de tecido referenciada é uma mistura de 10% de N-butildietanolamina e 10% de Triton-X-100 dissolvido em ddH2O11. - Lave o lenço por 3 x 2 h com PBS em temperatura ambiente. Transferir o tecido para PBS contendo o anticorpo primário CD31 (1:100) e incubar a 4 °C durante 24 h.
- Após lavar por 3 x 1 h com PBS, incubar o tecido com o anti-cabra de burro (1:800) em temperatura ambiente por 3-4 h, seguido de lavagem com PBS por 3 x 1 h.
- Transfira o tecido para uma solução de correspondência de índice de refração e incube por pelo menos mais 2 dias para transparência contínua.
NOTA: A solução de correspondência de índice de refração referenciada é uma mistura de 45% de antipirina, 30% de nicotinamida e 0,5% de N-butildietanolamina dissolvida em ddH2O11. - Prepare um gel de agarose a 2%, aqueça e derreta, incorpore o tecido transparente em gel de agarose e deixe esfriar para manter sua forma de cilindro com diâmetro de 5 mm. Fixe-o no palco de um microscópio de folha de luz e digitalize-o em 3D. Sob as seguintes especificações: Objetiva de iluminação: 2 unidades de lentes de imersão em água de abertura numérica (NA) de 10x 0,3; Objetivo de detecção: 1 unidade de lente multi-imersão 10x 0,5 NA; Trocador de ampliação: 1x/0,75x, a imagem foi realizada.
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Resultados
Entrega guiada por ultrassom de células-tronco vasculares
Neste estudo, a injeção guiada por ultrassom foi realizada usando um sistema de ultrassom Doppler colorido de pequenos animais (Figura 1A, B). Durante o procedimento, os camundongos foram imobilizados em uma plataforma de ultrassom aquecida, com ajustes feitos na plataforma e na sonda de ultrassom conforme necessário (Figura 1C).
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Discussão
Os DAAs causados por mutações genéticas são classificados como DAA hereditários, dentre os quais a MFS é a mais prevalente. O AAD representa a complicação com maior risco de vida do MFS22. Para investigar essa condição, empregamos um modelo de camundongo bem estabelecido de MFS (camundongos Fbn1C1041G / +), que desenvolve espontaneamente aneurismas da aorta, tornando-o ideal para estudos de intervenção precoce. Este modelo também contorna o dan...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (2023ZD0503304), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32271231) e do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2023YFC3606500). Agradecemos ao Dr. Chao Zheng pelo suporte técnico em imagens 3D.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de gelatina a 0,1% | OriCell | GLT-11301 | |
| Microtubos de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 μ L ponteiras de pipeta | Seleção de laboratório | T-001-10 | |
| 1000 μ L ponteiras de pipeta | Seleção de laboratório | T-001-1000 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Seleção de laboratório | CT-002-15A | |
| 200 μ L ponteiras de pipeta | Seleção de laboratório | T-001-200 | |
| Tubo de microcentrífuga de 5 mL | Biosharp | BS-50-M | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Seleção de laboratório | CT-002-50A | |
| Antipirina | Macklin | A800873 | |
| Kit de MicroBead Anti-Sca-1 | Miltenyi Biotec | 130-123-124 | |
| Sistema Bruker Luxendo MuVi-SPIM | |||
| CD31 | R& D | AF3628 | Razão de diluição 1:100 |
| CUBIC-L | solução de limpeza de tecidos | ||
| CUBIC-RA | solução de correspondência de índice de refração | ||
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| anticorpo secundário anti-cabra de burro, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | Rolamento A11055 | Razão de diluição 1:800 |
| FBS | Corning | 35-076-CV | |
| HBLV-mcherry-PURO | HANBIO | ||
| Tubos homogeneizadores | Seleção de laboratório | HGT-003-200 | |
| Aparelho de injeção de agulha guiado por imagem | Visualsonics | ||
| Seringa de insulina | BD | 328421 | |
| Isoflurano | Ameixin | LAT-YFW | |
| Microscópios de folha de luz | Bruker Luxendo | MuVi-SPIM | |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Transdutor Microscan MS400 | Visualsonics | ||
| Plataforma de Manuseio de Camundongos e Monitoramento Fisiológico | Visualsonics | ||
| N-butildietanolamina | Macklin | N802391 | |
| Nicotinamida | Macklin | N814605 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| Pomada oftálmica Puralube | EQUL | 1703321138 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Solução de mancha azul de tripano | Solarbio | C0040 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| Sistema de medição Vevo 2100 | yiswelsonics | ||
| Sistema Ferroviário Integrado Vevo II | yiswelsanics |
Referências
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Reimpressões e permissões
