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Artigo de método

Automatizando a implantação de tumores em larvas de peixe-zebra para pesquisa e medicina do câncer

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DOI:

10.3791/68441

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19 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Norwegian Centre for Molecular Biosciences and Medicine (NCMBM), University of Oslo, 2Life Science Methods BV, 3BioReperia AB, 4ZeClinics SL, 5Division of Diagnostics and Specialist Medicine, Linköping University

* These authors contributed equally

Neste artigo

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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para implantação automatizada de xenoenxerto tumoral em larvas de peixe-zebra usando um sistema de injeção robótica de última geração. Além disso, apresentamos vídeos de injeção e dados de validação que demonstram o desempenho bem-sucedido do sistema.

Resumo

As injeções de larvas de peixe-zebra, incluindo xenoenxerto de tumor ortotópico subcutâneo e cerebral, bem como a administração intravenosa de medicamentos, tornaram-se técnicas centrais na pesquisa baseada em peixe-zebra. Esses procedimentos, no entanto, permanecem tediosos, tecnicamente desafiadores e altamente dependentes da habilidade do operador, limitando o rendimento e a reprodutibilidade. Para resolver essas limitações, introduzimos um sistema robótico avançado que automatiza microinjeções em larvas de peixe-zebra, melhorando significativamente a eficiência, precisão e reprodutibilidade em relação às injeções manuais. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para operar o injetor automatizado, um sistema de alto rendimento capaz de fornecer líquidos, partículas ou células cancerígenas em três locais anatômicos diferentes com precisão e velocidade superiores em comparação com pesquisadores treinados em peixes-zebra. Descrevemos as etapas essenciais, incluindo configuração, calibrações, procedimentos de injeção e solução de problemas, para garantir o desempenho ideal. Além disso, fornecemos exemplos representativos de resultados do uso do robô e discutimos seu potencial para facilitar injeções larvais em larga escala, inclusive para exames de drogas e medicina de precisão. Ao integrar um injetor automatizado aos fluxos de trabalho, os pesquisadores podem superar as limitações das injeções manuais e acelerar a descoberta pré-clínica de medicamentos e a seleção de tratamento personalizado.

Introdução

À medida que nossa compreensão do comportamento do câncer e da resistência aos medicamentos melhora, torna-se cada vez mais claro que há necessidade de um melhor diagnóstico, caracterização e direcionamento terapêutico dos subtipos de câncer. Nos últimos vinte anos, as publicações no campo da medicina personalizada (também conhecida como medicina de precisão) têm crescido 1,2. De fato, a medicina de precisão é definida como a prática de adaptar o tratamento médico com base nas características individuais da doençado paciente 3. Isso segue nosso entendimento atual de que não existe uma abordagem única para todos, que se tornou particularmente clara e pertinente na terapia do câncer. Atualmente, no entanto, a falta de abordagens de medicina de precisão clinicamente relevantes para a maioria dos pacientes com câncer significa que o processo de seleção da estratégia de tratamento mais adequada é por tentativa e erro. Isso resulta em atrasos significativos e desconforto desnecessário com diminuição da qualidade de vida e redução da sobrevida. É importante ressaltar que um paciente com diminuição da qualidade de vida após vários regimes de quimioterapia ineficazes pode optar por mudar para o tratamento paliativo4. Com um método de triagem adequado e personalizado, a seleção de medicamentos pode ser realizada com maior precisão e sem demora. Embora seja possível realizar sequenciamento genético e proteômico em células cancerígenas5, esses dados moleculares são pouco preditivos do resultado do paciente e geralmente têm pouco valor clínico6. No desenvolvimento de medicamentos, ter uma abordagem de medicina de precisão o mais cedo possível melhora muito as taxas de sucesso nos vários marcos do pipeline de desenvolvimento de medicamentos. De fato, entender desde o início quais candidatos a medicamentos têm o perfil de eficácia interindividual mais amplo, ou quais subtipos de câncer são particularmente sensíveis a cada candidato a medicamento, reduz os riscos e melhora a eficiência de testes pré-clínicos tardios e ensaios clínicos7. Com o aumento dos custos de P&D farmacêutico8, a crescente pressão política para reduzir os preços dos medicamentos 9,10 e os avanços na validação de alvos orientada por IA11, a necessidade de um método de triagem em larga escala, eficiente e centrado na medicina de precisão no desenvolvimento de medicamentos nunca foi tão grande.

Aqui, o peixe-zebra entra em cena, especificamente as larvas de peixe-zebra 48 horas após a fertilização (hpf). Modelos de xenoenxerto tumoral baseados em larvas de peixe-zebra como hospedeiros constituem uma plataforma de triagem in vivo rápida para prever as respostas clínicas à quimioterapia 6,12,13,14. Os modelos de xenoenxerto de tumor de peixe-zebra surgiram como uma alternativa poderosa à medicina de precisão molecular (ou seja, abordagens genômicas ou de patologia molecular para orientar a escolha do tratamento para pacientes com câncer), bem como estudos de xenoenxerto de organoides e camundongos para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos15,16. Com xenoenxertos tumorais de peixe-zebra, células tumorais fluorescentes (geneticamente ou quimicamente marcadas) são enxertadas em larvas de peixe-zebra com alta eficiência13. Medicamentos ou candidatos a medicamentos com um modo de ação relativamente rápido (por exemplo, de modo que visem a viabilidade das células tumorais direta ou indiretamente por meio de, por exemplo, ativação da citotoxicidade das células T) podem ser rastreados em apenas três dias, levando a leituras rápidas e funcionais da eficácia do medicamento anticâncer e antimetastático. Em seguida, uma seleção informada da terapia que mostra uma boa eficácia pode ser feita, com estudos mostrando que isso deve se traduzir em um forte resultado de tratamento para o paciente ou uma chance de sucesso em um projeto de desenvolvimento de medicamentos, respectivamente 12,17,18,19. Além disso, esse processo de triagem é altamente relevante para a seleção de compostos a serem movidos no pipeline de desenvolvimento de medicamentos.

No entanto, para se tornar uma ferramenta de diagnóstico viável em ambientes clínicos e permitir exames de medicamentos em larga escala na pesquisa e desenvolvimento de medicamentos em câncer, o modelo de xenoenxerto de tumor de peixe-zebra (ZTX) deve ser rápido, confiável, reprodutível e econômico. A automação é essencial para atingir esses objetivos, pois minimiza a variabilidade do operador, aumentando o rendimento e aumentando a precisão na injeção e análise de células tumorais. Ao padronizar esses procedimentos, podemos melhorar a reprodutibilidade dos dados e eliminar o erro humano, enquanto os fluxos de trabalho automatizados apresentam oportunidades para triagem de alto rendimento e viabilização de estudos em larga escala20,21. Recentemente, desenvolvemos um injetor automatizado que injeta líquidos, partículas ou células de várias origens em três locais anatômicos diferentes com velocidade, precisão e reprodutibilidade iguais ou superiores às de pesquisadores treinados em peixes-zebra22. Aqui, apresentamos um protocolo para a injeção automatizada de células tumorais em larvas de peixe-zebra de maneira precisa e controlada. Usando reconhecimento de imagem avançado, as larvas de peixe-zebra estão localizadas na placa de injeção, a orientação é determinada e o local alvo para a injeção é identificado. A agulha é então guiada automaticamente e uma punção bem-sucedida é determinada pelo software. Com treinamento mínimo, os operadores podem usar esse sistema para realizar injeções complexas, por exemplo, criando microtumores em larvas vivas de peixe-zebra, permitindo assim uma triagem eficiente de estratégias de tratamento.

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Protocolo

As linhagens de peixe-zebra foram mantidas de acordo com os protocolos padrão (https://zfin.org) e manuseadas em conformidade com os regulamentos locais de bem-estar animal. Esses regulamentos implementam as Diretrizes do Conselho da Europa para a Proteção de Animais Experimentais (Diretiva 86/609/EEC), que permitem o uso de larvas de peixe-zebra até o início da alimentação livre (5 dias após a fertilização). Uma vez que todas as larvas utilizadas neste estudo não tinham mais de 5 dias de idade, não foi exigida qualquer licença ética ao abrigo da Directiva 86/609/CEE.

NOTA: As larvas de peixe-zebra descorionadas de 48 hpf e o material a ser injetado nessas larvas devem ser preparados antes de iniciar o procedimento usando o injetor automatizado. Os protocolos para isso podem ser encontrados nos métodos suplementares (Arquivo Suplementar 1) associados a este artigo. Uma apresentação esquemática do fluxo de trabalho do protocolo é mostrada na Figura 1. A Figura 1 suplementar mostra uma representação esquemática dos estágios de desenvolvimento dos embriões de peixe-zebra.

1. Preparação de microagulhas

NOTA: Microagulhas são necessárias para as injeções e são um elemento essencial do processo de injeção para solucionar problemas e ajustar para essa finalidade. Tanto as agulhas comerciais quanto as agulhas feitas manualmente podem ser usadas no injetor automatizado. A seguir está o procedimento para puxar manualmente microagulhas usando o Sutter Instrument P-1000 ou PC-10, embora a maioria dos extratores de microagulhas seja semelhante em operação. A morfologia preferida da agulha é um cone gradual de 6-8 mm, com um tamanho de ponta de 0,3-0,7 μm, que é aberto manualmente antes da injeção usando uma pinça afiada.

  1. Prepare capilares de vidro borossilicato adequados: 1,0 mm OD, 0,78 mm de diâmetro interno (ID). Certifique-se de que eles estejam limpos e livres de poeira e detritos.
  2. Verifique se a serpentina de aquecimento está intacta e em boas condições.
  3. Insira o capilar de vidro nos grampos e prenda firmemente usando os parafusos de grampo, mas não com tanta força que o tubo esteja rachado.
  4. Ajuste as configurações: configuração de calor, força de tração e amptempo de rampa. Ao usar um extrator de agulha PC-10, a morfologia correta da agulha é obtida usando um puxão de estágio único com a configuração de aquecimento 68 e pesos completos.
    NOTA: Essas configurações influenciarão o comprimento e a largura do cone da ponta e podem variar dependendo da espessura da parede do capilar. Tentativa e erro são necessários aqui para produzir o melhor resultado.
  5. Remova as agulhas dos grampos com cuidado, para não danificar a ponta. Inspecione a ponta para garantir uma conicidade uniforme.
  6. Guarde as microagulhas cuidadosamente em fita adesiva, garantindo que a ponta delicada não entre em contato com nenhuma superfície.

2. Preparação da placa de gel de agarose para injeção robótica

  1. Pesar 0,6 g de agarose e transferi-lo para um frasco de vidro de 100 mL.
  2. Usando um cilindro medidor, meça 40 mL de solução E3. Coloque-o no frasco de vidro com a agarose para preparar uma solução de agarose a 1,5%.
  3. Coloque a garrafa de vidro no micro-ondas e aqueça por 30 s a 900 W. Em seguida, continue aquecendo em incrementos de 30 segundos, girando o conteúdo (usando luvas) entre cada intervalo até que a agarose esteja completamente dissolvida.
    NOTA: Tenha cuidado, pois a fervura também pode começar como resultado do turbilhão.
  4. Depois de derretida, arrefeça a agarose lavando o exterior da garrafa de vidro em água corrente até ficar quente, mas não quente ao toque (aproximadamente 60 °C).
  5. Limpe e seque bem o suporte de prato reutilizável e a lâmina de vidro. Monte deslizando a corrediça de vidro na ranhura na lateral do suporte da placa (Figura Suplementar 2A) e coloque-a em uma superfície plana.
    NOTA: Verifique se a placa de vidro não está saindo da lateral do suporte.
  6. Despeje aproximadamente 40 mL da mistura de agarose na placa de vidro, garantindo que ela se espalhe para cobrir toda a superfície. Se necessário, incline de forma que todas as bordas sejam alcançadas.
  7. Deixe a agarose solidificar por cerca de 5 min. A placa está então pronta para uso.
    NOTA: Adicionar solução E3 na superfície da placa sólida de agarose pode impedir a secagem. No entanto, deve ser removido antes de ser utilizado para injeções.

3. Colocação de larvas de peixe-zebra na placa de gel de agarose

  1. Umedeça a placa de gel de agarose com solução E3.
  2. Segure a placa em ângulo, permitindo que o excesso de solução E3 seja coletado.
  3. Preparar uma solução E3 contendo 40 μg/ml de tricaína numa placa de Petri. Coloque aproximadamente 20 larvas na solução e deixe-as anestesiar por 2 min.
  4. Coloque cuidadosamente 10-20 larvas anestesiadas na placa (Figura Suplementar 2B), garantindo que o excesso de água seja drenado naturalmente.
  5. Certifique-se de que as larvas estejam espalhadas, sem se tocarem, e evite posicioná-las muito próximas (5-10 mm) da borda da placa (Figura Suplementar 2B).
  6. Remova qualquer excesso de líquido do prato, garantindo que as larvas permaneçam úmidas.
    NOTA: O excesso de líquido pode induzir movimentos larvais não intencionais durante a injeção, enquanto níveis inadequados de umidade podem aumentar as taxas de mortalidade.

4. Carregando a microagulha

NOTA: Carregue a microagulha com células fluorescentes de alta densidade antes de realizar uma injeção. As células podem expressar geneticamente um marcador fluorescente ou um marcador químico pode ser usado23. Embora o número de células injetadas em cada larva seja comparativamente baixo, normalmente, 700 a 900 células, a densidade celular precisa ser alta no estágio de injeção; cerca de 300.000 a 500.000 células por μL, devido principalmente ao volume minúsculo (cerca de 2 nL) que é injetado.

  1. Centrifugar a suspensão celular a 200 × g durante 5 min e retirar o meio celular.
  2. Conte as células usando um contador de células e, em seguida, ressuspenda o pellet em PBS estéril à temperatura ambiente (RT) para atingir uma densidade final de 300.000 células / μL.
  3. Pegue uma microagulha preparada e segure-a cuidadosamente entre o polegar e o indicador. Em seguida, usando uma ponta de pipeta microcarregadora, carregue a microagulha com 1-10 μL da suspensão celular, dependendo do número de células.
    NOTA: Insira a ponta na extremidade da microagulha e puxe-a lentamente enquanto ela está sendo preenchida.
  4. Usando um estereomicroscópio com ampliação de 4x e um par de pinças finas, quebre cuidadosamente a ponta selada da microagulha para produzir uma abertura. Esta etapa também pode ser realizada antes de carregar uma suspensão de injeção.
    NOTA: Uma ponta de agulha chanfrada facilita a punção e pode ser criada usando um moedor de agulha. Se estiver usando um moedor de agulhas, chanfre a ponta da agulha antes de carregar as suspensões de injeção. Nesse caso, a agulha já está aberta antes que as células sejam carregadas.

5. Operação do robô para microinjeção

  1. Execute o procedimento de inicialização.
    1. Certifique-se de que um suprimento de gás adequado esteja conectado e ligado.
      NOTA: A pressão de entrada recomendada de um compressor de ar ou válvula de ar em um ambiente de laboratório com ar pressurizado centralizado é de 0.6 MPa (6 bar). O compressor de ar ou válvula pode permanecer continuamente ligado e aberto sem a necessidade de desligamento frequente. Ar comprimido, nitrogênio ou CO2 podem ser usados para a pressão de entrada.
    2. Insira uma unidade USB em uma das portas na parte traseira do robô (opcional).
      NOTA: Uma unidade USB deve ser inserida na máquina antes de ligar o robô e é removida somente depois que o robô for desligado.
    3. Pressione o botão liga/desliga verde ao lado da tela para ligar o robô (Figura Suplementar 2C). Aguarde até que o painel de controle apareça (aproximadamente 1 min).
    4. Verifique se há 15 cm de espaço livre nos lados esquerdo e direito do robô e pressione OK no pop-up (Figura Suplementar 2D).
    5. Pressione OK no próximo pop-up (Figura Suplementar 2E) sobre a unidade USB.
      NOTA: Este pop-up não aparecerá se nenhuma unidade USB estiver inserida.
  2. Defina a conexão para controle remoto (opcional).
    NOTA: Um controle remoto é usado para view e operar a máquina à distância. Essa função é útil para demonstrações, sessões de treinamento, atualizações de software e solução de problemas.
    1. Insira um cabo Ethernet na porta na parte traseira da máquina. Para a configuração inicial, entre em contato com o departamento de TI para obter assistência.
    2. Toque no ícone do menu localizado no canto superior esquerdo da tela (Figura Suplementar 2F).
    3. Toque no ícone de configurações na parte inferior central do menu (Figura Suplementar 2F).
    4. Selecione o modo de manutenção no menu de configurações (Figura suplementar 2G).
    5. Toque em Conectar ao LSM para iniciar uma conexão remota (Figura 2H suplementar).
  3. Execute as configurações de injeção.
    1. Toque em configurações de injeção no menu (Figura Suplementar 2F).
    2. Escolha o estágio de desenvolvimento apropriado das larvas de peixe-zebra para injeção (Figura 3A suplementar).
      NOTA: Para injeções no ducto de Cuvier, espaço perivitelino e ventrículo rombencéfalo, recomenda-se 48 larvas hpf mantidas a 28,5 ° C.
    3. Selecione o local de injeção preferido entre as opções fornecidas para realizar injeções (Figura 3B suplementar).
    4. Selecione o local da injeção no diagrama esquemático de uma larva de peixe-zebra. Ajuste a posição do diagrama larval, a ponta da agulha e a orientação da agulha para alinhar com o local de injeção selecionado (Figura 3C suplementar).
      NOTA: As colocações sugeridas de agulhas para diferentes locais de injeção são fornecidas em um artigo publicado anteriormente22. Para a injeção do ducto de Cuvier (DoC), normalmente, a agulha é colocada no meio do DoC devido ao maior fluxo sanguíneo nessa região. A orientação da agulha pode ser dorsal ou ventral. Para injeção de espaço perivitelino (PVS), recomenda-se iniciar a inserção da agulha na borda do espaço e posicioná-la em um ângulo de aproximadamente 30-45° em relação à notocorda. Para injeção no ventrículo do rombencéfalo, recomenda-se iniciar a inserção da agulha fora do rombencéfalo para evitar que escorregue. O ângulo da agulha deve estar alinhado entre os olhos e a vesícula ótica.
    5. Selecione a macro de injeção, oferecendo opções para os modos automático e manual (Figura 3D suplementar).
      NOTA: Para o modo automático, o nome do local de injeção indica que o processo de injeção é realizado de forma autônoma pelo sistema. A seleção manual envolve o robô localizando e se aproximando das larvas de forma autônoma. Assim que as larvas forem identificadas, uma interface de controle aparecerá para os usuários operarem o processo de injeção.
    6. Assim que as configurações de injeção forem finalizadas, toque em Continuar para a calibração da agulha para prosseguir com a calibração da agulha.
  4. Execute a calibração da agulha.
    NOTA: Como cada agulha é diferente, a posição da ponta da agulha precisa ser calibrada. A interface inicial da calibração da agulha é mostrada na Figura Suplementar 3E.
    1. Segure o porta-agulha com firmeza e gire a parte metálica no sentido anti-horário para desconectar o porta-agulha do robô.
    2. Insira o lado rombudo de uma agulha cheia no lado frustocônico do porta-agulha.
    3. Toque em Mover estágio para montar a agulhae exibida na tela (Figura Suplementar 3E). A platina será realocada para uma posição segura para montar a agulha e uma régua será exibida (Figura Suplementar 3F). Meça o comprimento da agulha fora do porta-agulha usando a régua. Deve ter cerca de 22 mm.
    4. Segure o porta-agulha que contém a agulha cheia e gire a parte metálica no sentido horário para apertar firmemente a conexão (Figura Suplementar 3G). Pressione OK para continuar.
    5. Na tela pop-up, posicione a agulha no centro do círculo (Figura Suplementar 3H) ajustando os dois parafusos da máquina (Figura Suplementar 3I). Quando estiver centralizado, toque na marca de seleção verde.
    6. Na próxima tela pop-up (Figura Suplementar 3J), ajuste o foco na ponta da agulha girando o parafuso localizado na parte de trás da cabeça do robô (Figura Suplementar 3K). Quando focado, toque na marca de seleção verde. O robô calibrará automaticamente a altura da agulha. Posteriormente, o robô girará a agulha e exibirá as posições de injeção como pontos vermelhos a cada rotação (Figura Suplementar 3L).
    7. Quando terminar, toque em Entendi e Continue para a calibração de gotículas no canto inferior direito da tela.
  5. Execute a calibração de gotículas.
    NOTA: O tamanho da gota é calibrado usando uma injeção em óleo mineral.
    1. Prepare uma placa de 6 poços com um poço cheio com 10 mL de óleo mineral e outro poço com 10 mL de tampão de limpeza (por exemplo, PBS ou água). Coloque a placa de 6 poços na posição esquerda do suporte da placa.
      NOTA: Remova a tampa da placa de 6 poços durante o experimento (inteiro) para que possa ser usada novamente quando uma agulha estiver entupida ou uma nova agulha for colocada.
    2. Toque no ícone ao lado de Calibrar usando uma placa de poço (Figura Suplementar 4A).
    3. Selecione as posições do poço de petróleo e do poço de limpeza (Figura Suplementar 4B).
    4. Toque em Make droplet para gerar um droplet com as configurações mostradas no lado esquerdo da tela (Figura Suplementar 4C). Ajuste a pressão de injeção, a contrapressão e a duração do pulso de ar conforme necessário para atingir o volume desejado. Como alternativa, toque no botão Melhorar automaticamente para otimizar automaticamente as configurações e atingir o volume desejado.
    5. Se a agulha estiver entupida, pressione o botão azul Limpar agulha (Figura Suplementar 4C) para ativar um pulso de limpeza de alta pressão no poço contendo água ou meio.
    6. Se a agulha e a gota parecerem embaçadas, ajuste o foco da agulha e da gota usando o terceiro botão superior no lado direito da tela (Figura Suplementar 4C).
    7. Toque na marca de seleção verde para fechar a tela.
  6. Execute a seleção da placa.
    1. Clique em Mover platina para colocar a placa e o robô moverá automaticamente a platina para uma posição apropriada para colocar a placa.
    2. Verifique se a placa de gel de agarose está seca por baixo e coloque a placa com as larvas anestesiadas na posição correta do suporte da placa.
    3. Em seguida, clique em OK e toque em Continuar para injeção para prosseguir com o processo de injeção (Figura Suplementar 4D).
  7. Realize a injeção.
    1. Na interface de injeção, clique no botão Iniciar para iniciar o processo de injeção (Figura Suplementar 4E). O processo começa com o estágio do robô se movendo enquanto o sistema escaneia a placa de agarose, procurando por um peixe (Figura Suplementar 4F). Ao identificar uma larva, a agulha navega automaticamente até o local de injeção designado e ajusta automaticamente sua direção ao ângulo predeterminado.
    2. Se o modo automático for escolhido, o robô administra injeções perfeitamente no local selecionado (Figura Suplementar 4G). Ao completar a injeção atual, o robô continuará procurando a próxima larva na placa para fazer as injeções.
    3. Se o modo manual for selecionado, uma interface de controle manual aparecerá quando a agulha se aproximar da larva (Figura Suplementar 4H). Use as setas azul e amarela para mover a agulha e gire a agulha usando o botão de rotação circular no lado esquerdo da tela. Assim que a agulha estiver posicionada dentro da larva, toque no botão de gota vermelha para realizar a injeção. Como alternativa, pressione a tecla m para iniciar a sequência de macro para executar a injeção automaticamente.
    4. Quando todas as larvas tiverem sido injetadas, feche a interface de injeção clicando no botão Parar. A agulha será colocada no poço de petróleo automaticamente.
    5. Remova cuidadosamente a placa que contém as larvas injetadas.
  8. Transfira as larvas de peixe-zebra injetadas.
    1. Para transferir as larvas injetadas, incline a placa sobre uma placa de Petri e use uma pipeta ou garrafa de aperto para lavar suavemente as larvas com um fluxo controlado de água.
    2. Comece de cima e desça para uma lavagem eficaz.
    3. Remova todas as larvas mortas, substitua a água por solução E3 fresca e coloque a placa de Petri na incubadora.
      NOTA: Se células cancerígenas humanas ou amostras clínicas forem injetadas, incube a placa de Petri a 33-36 °C; caso contrário, incubar a 28,5 °C.

6. Desligando o robô

  1. Quando a injeção estiver concluída, remova a agulha visitando o menu de calibração da agulha e pressionando Mover estágio para remover a agulha (Figura Suplementar 3E). Se alguém pretende manter a agulha na máquina para uso posterior, pule esta etapa.
  2. Vá para o menu e toque no botão liga / desliga , localizado no canto inferior esquerdo (Figura Suplementar 2D).
  3. Pressione o botão Estacionar agulha para preservar a agulha (Figura Suplementar 4I).
  4. Caso contrário, clique em OK. A máquina será desligada e a luz verde do botão liga/desliga se apagará assim que o desligamento for concluído.
    NOTA: Quando o robô estiver ocioso, coloque placas vazias de vários poços em ambos os suportes de placas de vários poços para evitar que a poeira entre na máquina.

7. Removendo o gel de agarose e limpando

  1. Remova o gel de agarose da placa e remova cuidadosamente (use óculos e luvas) a placa de vidro do suporte.
  2. Limpe bem a placa de vidro e o suporte com água morna e etanol, certificando-se de que esteja seco antes de reutilizá-lo.
    NOTA: Limpe todas as placas de gel imediatamente após o uso, pois o gel de agarose é mais fácil de remover ainda molhado.

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Resultados

Aqui, apresentamos o processo de injeção automatizado para os três locais de injeção mais utilizados para xenoenxertos de células cancerígenas.

O vídeo 1 demonstra a injeção automática do duto de Cuvier (DoC) usando o sistema robótico. O robô primeiro examina a placa sistematicamente, movendo-se de cima para baixo e da esquerda para a direita, para localizar uma larva de peixe-zebra. Uma vez que uma larva é identificada, a agulha se aproxima a...

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Discussão

O desenvolvimento e a implementação do injetor automatizado representam um avanço significativo no campo do xenoenxerto de tumor de peixe-zebra para triagem de drogas anticâncer e medicina de precisão. Este é, até onde sabemos, o primeiro robô comercialmente disponível para injeção automatizada de suspensões celulares em larvas de peixe-zebra, e este protocolo é, portanto, relevante para todas as pesquisas que envolvem tais injeções em alto rendimento. Ao automatizar o processo de injeçã...

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Divulgações

Y.D., K.J.v.d.K. e J.d.S. trabalham para a Life Science Methods, que explora comercialmente o sistema robótico usado nesta publicação. Os demais autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente ao programa Eurostars por apoiar nossa pesquisa por meio da bolsa ROBO-FISH (Grant Number: E! 114899) e ao programa EIC-PATHFINDER por meio da bolsa ALADDIN (Grant Number: 101130574).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 6 poços  Greiner bio-one cellstar Ref 657160
AgaroseVWR#N605-100G
Sistema automatizado de injeção + consumíveisMétodos das Ciências da Vidahttps://www.lifesciencemethods.com/microinjection_system_for_zebrafish_larvae.html?nocache=1752058717774
Capilares de vidro borosilicatoInstrumentos de Precisão MundialN/A1,0 mm de diâmetro de diâmetro, 0,78 mm de diâmetro
Contador celular  ThermoFisherCondessa 3
Agulhas comerciais  Clunbury Scientific LLC #B100-58-20
DNase tipo I Roche#11284932001
Filtro para células cancerígenasSysmex CellTricsTM04-0042-231630 & micro; m
Óleo mineral & nbsp;Diapharma #330779-1L
Moedora de agulhas ()Narishige   EG-401
Polivinilpirrolidona 40Sigma#102420477
GentleMACS Octo DissociadorMiltenyi Biotechttps://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/gentlemacs-octo-dissociator-with-heaters.html

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine
Posted by JoVE Editors on 11/03/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68441

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