Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

Summary

Este protocolo fornece um método para a otimização global sistemática de biossensores geneticamente codificados por meio da geração e avaliação de bibliotecas genéticas assistidas por automação. Isso é combinado com metodologias de design de experimento para agilizar a experimentação e permitir a seleção de componentes genéticos para ajustar os biossensores a resultados de design específicos.

Abstract

Os biossensores geneticamente codificados são ferramentas poderosas para o processamento de informações de alto rendimento, permitindo a transdução de sinais de entrada ambientais ou químicos em uma variedade de saídas. Isso permite detecção dinâmica, controle direto e regulação ajustada da expressão gênica em uma ampla gama de aplicações biotecnológicas, incluindo otimização de enzimas, desenvolvimento de cepas e controle de processos microbianos. Para torná-los adequados ao propósito, o desempenho do biossensor pode ser refinado modificando a estequiometria dos componentes do circuito do biossensor (por exemplo, transportadores, módulos de entrada e saída) e / ou ajustando as interações intermoleculares hospedeiro-biossensor associadas (por exemplo, DNA-proteína, proteína-proteína). No entanto, aqui, o grande número de possíveis permutações de biossensores cria um espaço de design combinatório complexo, necessitando de otimização cuidadosa das estratégias de triagem para identificar configurações que forneçam o desempenho fenotípico desejado. Essa complexidade é agravada ainda mais por características de desempenho do biossensor, como a capacidade de ajuste, que requerem análise de titulação do efetor sob condições de triagem monoclonal. Consequentemente, a necessidade de explorar diversas sequências e espaço experimental torna os métodos de amostragem fracionada particularmente adequados para esse fim. Sustentando esse fluxo de trabalho estão os algoritmos de Design of Experiment (DoE), que estão bem posicionados para permitir mapeamento estruturado eficiente baseado em estatística e amostragem fracionária desse espaço de design experimental combinatório.

Relatada é uma automação combinada de alto rendimento e abordagem computacional para amostrar com eficiência o espaço de design de biossensores baseados em fatores de transcrição alostéricos para oferecer configurações distintas com curvas de dose-resposta digitais e analógicas. O protocolo começa com a criação e seleção automatizada de bibliotecas de locais de ligação de promotores e ribossomos. Essas bibliotecas e seus dados de expressão correspondentes são transformados em entradas adimensionais estruturadas, permitindo o mapeamento computacional de todo o espaço de projeto experimental. A amostragem fracionada é então realizada usando um algoritmo DoE e acoplada à análise de titulação do efetor usando uma plataforma de automação de alto rendimento. Este fluxo de trabalho fornece uma estrutura agnóstica para o desenvolvimento e otimização de futuros sistemas de biossensores e circuitos genéticos, fornecendo um kit de ferramentas regulatórias para a comunidade de biologia sintética.

Introduction

A capacidade de regular a expressão de genes é uma função essencial em todas as formas de vida, facilitando respostas dinâmicas e em tempo real a influências internas e externas, desde efetores químicos até estímulos biofísicos¹. A miríade de sistemas regulatórios transcricionais encontrados na natureza tem um enorme potencial no aumento e aceleração da engenharia metabólica e da pesquisa biotecnológica possibilitada pela biologia sintética. Em procariotos, grande parte da regulação que ocorre na célula é controlada por meio de mecanismos regulatórios de um componente impulsionados pelas interações de fatores de transcrição alostéricos (aTFs) com vários efetores de moléculas pequenas². Normalmente consistindo em um domínio de ligação efetora (EBD) e um domínio de ligação ao DNA (DBD), os aTFs atuam como interruptores moleculares ao se ligarem a efetores específicos de pequenas moléculas, modulando a afinidade de seu DBD por sequências específicas de operadores de DNA localizadas nas regiões promotoras do genoma, resultando na ativação ou repressão da transcrição³. Esse mecanismo enganosamente simples deu origem a uma série de estratégias de regulação diversas, que vão desde sistemas de repressão/desrepressão até ativadores capazes de detectar e responder a um número impressionante de efetores de moléculas pequenas ou estímulos ambientais⁴. Consequentemente, a biologia sintética aproveitou essa diversidade para construir biossensores geneticamente codificados capazes de acoplar uma infinidade de sinais de entrada em saídas sob medida, ou seja, produção de proteína repórter fluorescente e regulação de vias sintéticas. Quando aplicados em fluxos de trabalho biotecnológicos, esses sistemas permitem o monitoramento em tempo real das concentrações intracelulares de metabólitos, regulação dinâmica de vias e leituras fáceis, auxiliando no desenvolvimento de vias, cepas e bioprocessos mais eficientes 5,6,7,8.

Fundamentalmente, os biossensores são caracterizados de acordo com uma série de parâmetros, incluindo especificidade, faixa operacional, faixa dinâmica, sensibilidade e inclinação, com a curva de resposta à dose de um biossensor descrevendo esses parâmetros através do sinal de saída em função da concentração do ligante (Figura 1)9,10,11,12 . A equação de Hill pode ser usada para ajustar as características de desempenho de um biossensor, fornecendo evidências semi-empíricas para cada um dos parâmetros descritos acima, fornecendo assim um meio de caracterizar o sistema de biossensores e, ao mesmo tempo, permitir a avaliação dos esforços necessários para ajustar o sistema em direção a resultados orientados por aplicativos. A especificidade pode ser definida como as diferenças relativas na saída de sinal induzida por um efetor em comparação com uma série de outras moléculas efetoras potenciais e é tipicamente modulada no nível EBD do aTF. A faixa operacional é definida como a faixa de concentrações de ligantes que o biossensor é capaz de detectar, ditando a faixa de concentrações às quais o biossensor será capaz de responder. A faixa dinâmica, por outro lado, descreve a razão entre o estado de ativação mensurável mais alto (ON) e o estado inativado (OFF) e é um parâmetro importante para garantir que o biossensor relate de forma confiável as concentrações do efetor acima da autofluorescência de fundo¹⁰. A sensibilidade para a molécula efetora é descrita como a concentração necessária para eliciar um determinado sinal de saída, medida pela metade da concentração máxima (EC₅₀) do efetor¹³. Finalmente, a inclinação da curva é denotada pela cooperatividade (n_H) do aTF para seu local de operação no promotor e resulta em um perfil de saída de resposta mais digital ou analógico. A cooperatividade surge de interações proteína-proteína entre aTFs ligados a ligantes, formando complexos multiméricos que fortalecem a afinidade pelo local do operador, resultando em aumentos acentuados na capacidade de resposta do circuito com concentrações de ligantes saturantes e um perfil de resposta mais digital¹⁴.

As características de resposta à dose de um biossensor podem afetar significativamente a adequação de suas aplicações e geralmente são um ponto decisivo para qualquer aplicação conceitual. O desempenho do biossensor pode variar enormemente de sistema para sistema, com a faixa operacional normalmente variando de 0,1 nM a 10 mM¹³, enquanto as faixas dinâmicas podem ser de 1,4 a 2000 vezes¹⁵. Além disso, embora o número de compostos efetores relatados para aTFs seja amplo (produtos metabólicos, aminoácidos, metais, antibióticos, quorum sensing, etc.)¹¹, não é abrangente, apresentando desafios aos pesquisadores quando ainda não existe na literatura um biossensor adequado para seu efetor. A biologia sintética permitiu a engenharia de biossensores que abordam tais desafios, permitindo o ajuste do escopo do efetor e das características de dose-resposta para se alinhar mais de perto com os resultados da pesquisa da aplicação, e tem sido usada para resolver os dois problemas mencionados, respectivamente^16,17. Duas áreas-chave para a engenharia são direcionáveis por meio da biologia sintética, a região promotora do biossensor e o próprio aTF, mediando seus efeitos no nível transcricional e proteico. As abordagens que se concentram nos elementos genéticos do biossensor para modular o desempenho no nível do promotor incluem engenharia do RBS, locais do operador e -35, -10 (hexboxes) para ajustar a sensibilidade, faixas operacionais e dinâmicas, e são o foco da metodologia descrita neste manuscrito (Figura 1). Alternativamente, modificar a seletividade e a sensibilidade do biossensor por meio da análise de seu domínio de ligação efetor e mutação de resíduos envolvidos na coordenação do efetor (usando homologia de sequência e / ou biologia estrutural) pode modular sua resposta a um efetor cognato^{18 , 19 , 20} ou alterá-lo inteiramente para um efetor não cognato de interesse^{16 , 17 , 21}. Esses esforços de ajuste podem direcionar os biossensores para aplicações específicas, sendo comumente controladores metabólicos (loops de feedback, circuitos de controle), ferramentas de triagem primária (descoberta de enzimas ou cepas), ferramentas de triagem secundárias (triagem de variantes enzimáticas, engenharia metabólica) e bioprospecção de transportadores^{22 , 23 , 24}. Um exemplo envolve o uso de um aTF responsivo ao ácido mucônico, CatM, combinado com uma sequência promotora projetada para melhorar a faixa dinâmica e operacional. Este sistema foi integrado à classificação de células ativadas por fluorescência para isolar as cepas de produção de ácido mucônico mais eficazes com base na fluorescência GFP após a evolução laboratorial adaptativa²⁵.

Embora o sucesso das estratégias de engenharia descritas acima seja evidente, as interdependências das alavancas disponíveis para um biólogo sintético ajustar os biossensores podem complicar o processo de design e prolongar o período gasto no desenvolvimento de biossensores, o que pode dissuadir alguns pesquisadores de implementar biossensores em seus próprios fluxos de trabalho. Conforme ilustrado na Figura 1, as tentativas de ajustar um biossensor para um resultado específico por meio da modificação dos hexboxes podem inadvertidamente atenuar outros parâmetros, sendo essa interdependência um desafio reconhecido na engenharia de biossensores¹². As abordagens comuns de ajuste de biossensores consistem em design racional e engenharia de evolução dirigida, com a primeira contando com a compreensão a priori das características estruturais e mecanicistas do sistema para focar a experimentação em componentes com alta probabilidade de sucesso; enquanto o último depende de mutagênese aleatória e evolução natural acoplada a uma tela de alto rendimento para selecionar variantes que exibem características otimizadas 26,27,28,29,30. Embora eficazes, ambas as técnicas também sofrem de algumas desvantagens: a engenharia direcionada, por exemplo, por meio de seu foco em elementos estruturais ou funcionais específicos, é propensa a uma exploração limitada de todo o espaço experimental e pode ignorar efeitos alostéricos ou secundários³⁰. A geração e triagem de bibliotecas não direcionadas, embora ideais para otimizar projetos de maneira não guiada, exigindo pouco trabalho inicial de design (ou seja, design e geração de bibliotecas), exigem um viés para mutações úteis. Sem esse viés, espera-se que uma porcentagem muito maior de mutações possa ser deletéria, exigindo mais rastreamento³¹. Como tal, abordagens holísticas que consideram não apenas o efeito primário das partes constituintes do biossensor (aTF, RBS, locais do operador e hexboxes), mas também como esses componentes interagem uns com os outros para influenciar os parâmetros do biossensor são altamente atraentes.

Metodologias estruturadas de experimentação multivariada e modelagem estatística têm sido amplamente adotadas em fluxos de trabalho de engenharia de processos, a fim de interrogar o espaço experimental multidimensional usando o menor número possível de experimentos. Essa abordagem, que combina experimentação e modelagem, denominada design de experimentos (DoE), permite que os pesquisadores otimizem processos multivariáveis complexos em direção a resultados definidos, sem exigir amplo conhecimento a priori ^23,30. Embora normalmente aplicado à otimização de variáveis contínuas para as quais a exploração experimental estruturada é mais fácil, o DoE também tem sido usado na otimização de vias metabólicas no nível genético 31,32,33. Isso envolve uma etapa inicial de triagem na qual os fatores considerados mais importantes para o resultado desejado são selecionados, seguido por uma etapa de otimização em que os fatores selecionados são ajustados para obter a saída desejada, neste caso para otimizar parâmetros específicos do biossensor, a fim de aumentar seu escopo de aplicação. Criticamente, essa técnica pode ser acoplada a plataformas automatizadas de manipulação de líquidos para aumentar o rendimento de triagem até bibliotecas de médio porte de 10³ a 10⁴ para otimizar globalmente o desempenho do biossensor em uma base orientada por dados²³. Abaixo, descrevemos um protocolo para a implementação de uma abordagem orientada pelo DoE para otimização de biossensores, auxiliada por robótica de manuseio de líquidos para agilizar a geração, triagem e coleta de dados de bibliotecas para a otimização global da sensibilidade do biossensor.

Protocol

1. Projeto da peça RBS/promotor

1. Identifique elementos regulatórios específicos do biossensor que podem ser sistematicamente ajustados como variáveis contínuas no processo DoE. Agrupe esses elementos regulatórios em módulos distintos. Isso pode incluir módulos que regulam o transporte efetor, a expressão do fator de transcrição e/ou a expressão gênica de saída. Certifique-se de que cada módulo seja ajustável no nível transcricional e/ou translacional por um promotor ou RBS (por exemplo, RBS_trans, P_reg, RBS_out e P_out, respectivamente).
2. Determine os principais locais funcionais dentro das regiões selecionadas do promotor e do RBS, como caixas hexadecimais, locais do operador e sequências RBS.
   NOTA: Muitos promotores e RBSs caracterizados existem na literatura para criar bibliotecas a partir de 34,35,36. No entanto, para sequências promotoras não caracterizadas (normalmente o promotor P_reg), veja abaixo as etapas adicionais para localizar elementos de sequência genética sintonizáveis, se nenhum estiver disponível na literatura.
   1. Localize outros operons contendo as sequências de biossensores de interesse por meio de pesquisas BlastP do aTF com a entrada de detecção desejada. Extrair a região intergênica do aTF e seus genes regulados para obter sequências promotoras.
      NOTA: A localização e o número de sequências promotoras variam dependendo da classe de aTF utilizada.
3. Use várias ferramentas de alinhamento de sequência e outros softwares de motivos para pesquisar os promotores putativos em busca de motivos conservados, como hexboxes e locais de operadores. Com base na análise da sequência do promotor, selecione sequências de nucleotídeos para randomização com bases degeneradas, por exemplo, N = qualquer coisa, R = qualquer purina, Y = qualquer pirimidina, etc.
   NOTA: Os leitores são direcionados para a publicação de origem para obter mais detalhes sobre a análise do promotor e a randomização de base²³.

2. Montagem e validação da biblioteca de peças

1. Projete e solicite primers que amplificarão especificamente o vetor de expressão desejado para permitir a inserção de variantes de sequência promotora/RBS a montante de um marcador fluorescente (por exemplo, GFP). Diluir os iniciadores liofilizados à chegada a uma concentração final de 100 μM em H₂O desionizado estéril.
   1. Monte a mistura de reação de PCR em gelo em tubos de PCR de acordo com os parâmetros da polimerase específica. Certifique-se de que uma polimerase de alta fidelidade seja usada para evitar a transferência de mutações para a espinha dorsal do vetor de expressão. Ajuste a temperatura de recozimento e o tempo de extensão de acordo com as necessidades dos primers e o comprimento do produto de PCR desejado.
   2. Analisar o produto da PCR através de eletroforese em gel e purificar o vector linearizado utilizando a purificação por PCR ou um kit de extracção em gel. Medir a concentração de ADN vectorial linearizado e conservar a -20 °C.
2. Encomende as bibliotecas variantes projetadas (RBS ou promotores) para inserção no vetor linearizado como oligonucleotídeos degenerados de fita simples com braços de homologia de plasmídeo de 30 pb nas extremidades 5 'e 3' para recombinação homóloga direcionada no vetor de expressão.
   1. À chegada, ressuspender os oligonucleótidos liofilizados até uma concentração final de 100 ng/μl em H₂O desionizado estéril.
3. Determine os volumes para quantidades equimolares da biblioteca linearizada de vetores e variantes usando calculadoras online. Certifique-se de que o volume final da reação seja de 20 μL e que uma proporção molar de 2:1 de inserto para vetor seja usada.
   1. Descongele uma alíquota da mistura mestre de montagem Gibson comercial (X2) no gelo e monte a reação em um tubo de PCR de acordo com os volumes fornecidos pela calculadora escolhida.
      NOTA: A mixagem master Gibson também pode ser feita no laboratório ^37,38.
   2. Adicione 10 μL de mistura mestre 2x Gibson aos fragmentos de DNA e incube por 1 h a 50 ° C em um termociclador ou similar.
   3. Aplique todos os 20 μL de produto de ligação a 200 μL de E. coli competente em um tubo de microcentrífuga. Incubar em gelo por 30 min seguido de choque térmico por 45 s a 42 °C.
   4. Retorne as células ao gelo por 2 min, adicione 800 μL de caldo super ideal com meio de repressão catabólica (SOC) ao tubo e deixe as células se recuperarem por 1 h a 37 ° C em uma incubadora agitada.
   5. Espalhe 50 μL de células transformadas em várias placas de Petri de ágar Luria-Bertani (LB) de 60 mm com seleção de antibióticos relevante. Incubar as placas a 37 °C durante 18 h.
4. Verifique as placas em busca de transformantes, calcule o número de colônias que representam 3x a diversidade da biblioteca teórica para capturar representação suficiente de cada variante. Otimize o conjunto isotérmico se o número de colônias for baixo/zero.
   NOTA: A sobreamostragem é necessária ao considerar uma biblioteca ideal gerada a partir de reagentes ou síntese de alta fidelidade. Normalmente, isso é 3x maior que o tamanho total da biblioteca. Por exemplo, 4 posições de degenerescência (NNNN) = 4⁴ = 256 sequências únicas. Portanto, raspe ~ 768 colônias.
   1. Raspe o número necessário de colônias em um único frasco estéril de 125 mL contendo 25 mL de meio LB suplementado com antibióticos apropriados. Incubar o balão a 37 °C durante 18 h numa incubadora agitada (180 rpm), assegurando que a cultura é visivelmente densa após este tempo.
   2. Use um kit de purificação midi-prep de plasmídeo para purificar a biblioteca de variantes da cultura transformadora preparada. Determinar a concentração do DNA da biblioteca de plasmídeos; 1-10 μg são necessários para etapas a jusante. Certifique-se de que o DNA da biblioteca seja eluído usando H₂O desionizado estéril.
      NOTA: As etapas além desse ponto se concentrarão na clonagem e validação de bibliotecas variantes no host de expressão Pseudomonas putida (P. putida); A adaptação do protocolo a outros hospedeiros pode exigir modificação dos tempos de incubação, temperaturas de incubação e métodos de transformação.
5. Preparar uma placa de ágar-LB do hospedeiro de expressão desejado P. putida , separando um estoque de glicerol e incubando a placa a 30 °C durante 18 h.
   1. Pegue uma única colônia de P. putida da placa de ágar LB, inocule 10 mL de meio LB e cresça a 30 ° C por 18 h, a 180 rpm agitando.
   2. Preparar as células para a eletrocompetência centrifugando a cultura cultivada a 4000 x g a 18 °C durante 2 min. Despeje o sobrenadante, ressuspenda em 1 mL de H₂O deionizado estéril e transfira as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga estéril.
      NOTA: As células de P. putida devem parecer rosadas quando peletizadas.
   3. Centrifugue as células por 1 min a 4 x g em uma microcentrífuga, despeje o sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de H₂O deionizado estéril. Repita as etapas de centrifugação e ressuspensão mais 4 vezes.
      NOTA: Pode ocorrer perda celular ao despejar o sobrenadante durante a lavagem; Isso é normal e não deve afetar os rendimentos.
   4. Transfira 100 μL de células lavadas para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm, adicione 1-10 μg de DNA da biblioteca de plasmídeos à cubeta e misture.
   5. Ligue o eletroporador, certifique-se de que o voltage está ajustado para 2.5 kV para a cubeta de 0.2 cm, insira a cubeta na câmara de eletroporação e pulse.
   6. Adicione 900 μL de meio SOC à cubeta, misture e transfira as células para um tubo de microcentrífuga estéril. Deixar as células recuperarem durante 2 h a 30 °C numa incubadora agitada.
6. Espalhe 50 μL de células transformadas em grandes placas de Petri quadradas (230 mm) de ágar LB suplementado com antibiótico relevante e incube a 30 ° C por 18 h.
   NOTA: Garanta densidade moderada de colônias em placas de biblioteca (2-3 UFC/cm²). Isso dependerá da competência bacteriana e do volume de plaqueamento. Se for muito baixo, a otimização da transformação, ou rodadas sucessivas de transformação, pode ser usada para aumentar o número de colônias.
7. Selecione entre 25-50 colônias de todas as placas transformantes para validação de sequência. Use primers que amplificam a sequência degenerada, amplificam a região por PCR e enviam para sequenciamento de Sanger para avaliar a diversidade da sequência, bem como a policlonalidade.
   NOTA: Se a policlonalidade se tornar problemática, espalhar as transformações em vários lotes de cubetas com 1 μg de DNA pode ajudar a reduzir esse efeito.

3. Triagem clonal da biblioteca de peças - automação

1. Configuração do manipulador de líquidos
   1. Crie 7 programas em uma plataforma de manipulador de líquidos para garantir que as etapas intensivas de pipetagem sejam banalizadas.
   2. Crie um programa de "Transferência de Líquido MTP", certifique-se de que o manipulador de líquidos esteja configurado para pipetar um volume ajustável de um reservatório preparado para placas de microtitulação vazias (MTP) em seu layout.
   3. Crie um programa "Adicionar glicerol ao MTP", certifique-se de que o manipulador de líquidos esteja programado para pipetar um volume de 100 μL de glicerol a 50% em placas, certifique-se de que a velocidade de dispensação e aspiração seja de 5-20 μL/s.
      NOTA: Um programa separado é criado para levar em conta a maior viscosidade do glicerol a 50%, o que pode levar à formação de bolhas, aspiração incompleta ou contaminação cruzada de poços vizinhos devido a respingos se não for controlado.
   4. Crie um programa de "Transferência de Líquido DWB", configure o manipulador de líquidos para pipetar em blocos de poços profundos (DWB) com uma configuração de volume ajustável e certifique-se de que o manipulador de líquidos pipeta de um reservatório pré-preenchido.
   5. Crie um programa "Inocular de MTP descongelado", certifique-se de que o manipulador de líquidos esteja programado para aspirar 5 μL de MTP descongelado contendo as colônias selecionadas e transferi-lo para as placas DWB correspondentes no layout.
      NOTA: Preste muita atenção ao arranjo MTP e DWB no layout, garantindo uma ordem lógica de eventos para evitar inoculação dupla acidental ou placas perdidas.
   6. Crie um programa "Transferir para o ensaio DWB", certifique-se de que o manipulador de líquidos esteja configurado para transferir 5 μL de células de uma posição da placa DWB para outra posição da placa DWB. O programa deve então repetir esta ação 4 vezes com cada transferência inoculando uma posição diferente da placa, ou seja, P1 -> P2, P1 -> P3, etc.
      NOTA: Este programa garante a subcultura perfeita de 96 variantes em diferentes concentrações de ensaio.
   7. Crie um programa "Configuração de ensaio - ressuspensão de PBS (DWB)", certifique-se de que o manipulador de líquidos pipeta cada DWB no layout com 500 μL de PBS, o programa também deve incluir uma etapa de mistura para garantir que os grânulos de células sejam ressuspensos adequadamente.
   8. Crie um programa "Configuração de ensaio - Adição de células e PBS (MTP)", certifique-se de que este programa inclua uma etapa para transferir 200 μL das células ressuspensas de uma posição de placa DWB para uma posição MTP vazia.
      NOTA: Para todas as etapas do 3.1, a programação e os layouts do manipulador de líquidos variam; Os pesquisadores devem consultar os manuais de manipuladores de líquidos comerciais específicos para modificar os programas acima para atender à capacidade e às necessidades do experimento.
2. Cultura e código de barras da biblioteca de variantes
   1. Determine o tamanho teórico da biblioteca e calcule o número de variantes individuais para garantir > 95% de cobertura da biblioteca (3x o tamanho da biblioteca recomendado) (consulte a nota da etapa 2.5.).
   2. Calcule o volume necessário de meio LB suplementado com antibióticos de acordo com o número de colônias que devem ser rastreadas (200 μL por colônia + 10% mais).
   3. Abra o software manipulador de líquidos e clique em Executar ao lado do programa MTP Liquid Transfer (consulte Arquivo Suplementar 1). Coloque a mídia preparada na posição correspondente do reservatório e encha o deck com MTPs vazios de acordo com o layout. Defina o programa para dispensar 200 μL de mídia. Clique em OK para confirmar o início do programa.
      NOTA: Certifique-se sempre de que os reservatórios e pontas sejam fornecidos adequadamente à plataforma do manipulador de líquidos antes de confirmar o início do programa para evitar interrupções.
   4. Repita o programa quantas vezes forem necessárias, sele os MTPs preenchidos com uma membrana respirável para manter a esterilidade.
   5. Transfira as placas MTP preenchidas para uma plataforma de seleção de colônias e solte, transfira também as placas quadradas de P. putida transformadas com DNA da biblioteca de variantes de plasmídeo para a plataforma de seleção de colônias. Use o seletor de colônias para inocular cada um dos poços de placas de microtitulação pré-preenchidos com uma única colônia das placas da biblioteca transformante.
      NOTA: Certifique-se de que a profundidade mínima do ágar seja de 25 mL para evitar danificar a cabeça do colhedor de colônias.
   6. Sele novamente e transfira as placas inoculadas para uma incubadora off-line agitada a 30 °C (800 rpm), garantindo que o controle de umidade esteja ativado em 75% para evitar a evaporação da cultura. Deixe-os crescer por 16 h.
      NOTA: Após a incubação, as culturas parecerão visivelmente densas aos olhos, se não for o caso, verifique novamente os requisitos de meios e antibióticos.
   7. Após 16 h de crescimento, retorne as placas cultivadas para a plataforma do manipulador de líquidos e solte. Clique em Executar ao lado do protocolo Adicionar glicerol ao MTP (consulte o Arquivo Suplementar 1), certifique-se de que o layout da placa na tela corresponda ao da doca do manipulador de líquidos. Clique em OK e permita que o protocolo seja executado.
   8. Quando terminar, sele as placas novamente e misture brevemente em uma incubadora de agitação offline (800 rpm) por 5 min antes de codificar barras e armazenar a -80 °C.
   9. Repita as etapas 3.2.7. e 3.2.8. até que todos os MTPs tenham glicerol adicionado, tenham sido misturados, codificados com código de barras e armazenados a -80 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado neste ponto para se preparar para as etapas de caracterização abaixo. Além disso, o bloqueio das placas em diferentes execuções experimentais pode ser planejado para se adequar à capacidade da plataforma de manipulação de líquidos em uso ou para reduzir a carga de trabalho de uma só vez.
3. Triagem da biblioteca de variantes
   1. Calcule o volume necessário de meio suplementado com antibióticos para o número de DWB a ser preenchido (~ 495 μL por poço + 10% acima).
   2. Clique em Executar ao lado do programa DWB Liquid Transfer (consulte Arquivo suplementar 1), certifique-se de que a mídia seja adicionada ao reservatório correto no layout do programa. Certifique-se de que DWB vazios sejam adicionados às posições de layout correspondentes e que um suprimento adequado de pontas esteja disponível. Defina o programa para dispensar 495 μL de mídia. Quando estiver pronto, clique em OK para iniciar o programa.
   3. Selar os DWB cheios com uma membrana respirável e transferir para armazenamento temporário a 4 °C, repetir o passo 3.3.2. até que o número necessário de DWBs tenha sido preenchido com mídia.
   4. Clique em Executar ao lado do programa Incoculate from Thawed MTP (consulte o Arquivo Suplementar 1), certifique-se de que os criostocks MTP e os DWBs preenchidos sejam transferidos para a plataforma do manipulador de líquidos de acordo com o layout. Certifique-se de que um suprimento suficiente de dicas seja fornecido. Clique em OK para inicializar o programa.
      NOTA: Descongele as placas de estoque no gelo por 30 min, somente quando os programas e placas de pré-requisito tiverem sido preparados para garantir a viabilidade ideal das células.
   5. Quando o programa terminar, sele os DWBs inoculados durante a noite com uma membrana respirável e transfira para uma incubadora agitadora de placas off-line com controle de umidade de 75% e deixe crescer durante a noite por 16 h a 30 ° C (180 rpm).
   6. Feche novamente, misture e retorne os MTPs de estoque criogênico ao freezer a -80 °C conforme a etapa 3.2.8.
   7. Repita as etapas 3.3.4. ao ponto 3.3.6. quantas vezes forem necessárias até que o número necessário de DWBs durante a noite tenha sido inoculado e transferido para a incubadora.
      NOTA: Recomenda-se registrar quando cada lote de placas é adicionado à incubadora para levar em conta o intervalo de tempo entre as execuções durante a inoculação e usar a mesma ordem para as etapas a jusante.
   8. Calcule o volume necessário de meio suplementado com diferentes concentrações de efetor e antibiótico de acordo com o número de DWB durante a noite a ser rastreado (495 μL por alvéolo + 10% sobre). Cada concentração efetora requer seu próprio reservatório separado no manipulador de líquidos.
      NOTA: Para caracterização inicial, como triagem ON/OFF, duas concentrações efetoras são suficientes (por exemplo, concentração final de 0 e 1000 μM). Para gerar dados de dose-resposta para uma caracterização mais robusta, esse intervalo é aumentado para um mínimo de quatro concentrações (por exemplo, concentração final de 0, 1, 25 e 1000 μM). Os sistemas repressores não requerem a adição de um efetor para determinar a função, enquanto para ativadores, como o sistema descrito, é necessário um efetor.
   9. Clique em Executar ao lado do programa DWB Liquid Transfer (consulte Arquivo suplementar 1). Certifique-se de que os reservatórios contendo meios suplementados com efetores estejam nas posições corretas, de acordo com o layout. Adicione DWBs vazios à plataforma do manipulador de líquidos. Certifique-se de que dicas suficientes estejam disponíveis para a plataforma. Quando estiver pronto, clique em OK para iniciar o protocolo para gerar os DWBs de ensaio.
   10. Após o enchimento, sele os DWBs do ensaio com uma membrana respirável e transfira para armazenamento temporário a 4 °C, e reabasteça a plataforma do manipulador de líquidos com mais placas vazias.
   11. Repita as etapas 3.3.9 e 3.3.10 quantas vezes forem necessárias até que o número necessário de DWBs seja preenchido.
   12. Clique em Executar ao lado do programa Transferir para Ensaio DWB (consulte Arquivo Suplementar 1). Certifique-se de que os DWBs de ensaio não selados contendo meios suplementados com efetores sejam adicionados aos locais corretos no layout do manipulador de líquidos.
   13. Transferir e abrir os DWBs durante a noite contendo P. putida crescida inoculada na etapa 3.3.4. para a plataforma de manipulação de líquidos, novamente garantindo que o layout seja rigorosamente respeitado. Certifique-se de que dicas suficientes estejam disponíveis para a plataforma. Quando estiver pronto, clique em OK para iniciar o protocolo.
       NOTA: A transferência e o arranjo de subculturas nas placas de ensaio normalmente precisam ser feitos em lotes, dependendo do tamanho da plataforma do manipulador de líquidos.
   14. Após o término do programa, aplique selos e transfira as placas de ensaio para uma incubadora off-line a 30 °C, com 75% de umidade por 16 h (180 rpm), o volume final do ensaio será de 500 μL nesta etapa.
   15. Descarte os DWBs durante a noite após a inoculação e repita as etapas 3.3.12 a 3.3.14 conforme necessário até que todos os DWBs de ensaio necessários tenham sido inoculados e estejam crescendo em incubadoras off-line.
   16. Remova os DWBs da incubadora, transfira para uma centrífuga e células de pellets a 4000 x g, 18 ° C por 5 min. Despeje o sobrenadante e coloque os DWBs centrifugados na plataforma do manipulador de líquidos.
       NOTA: Os volumes dos pellets celulares podem variar dependendo da concentração ou variante do efetor, além disso, alguns pellets podem parecer mais visivelmente fluorescentes aos olhos do que outros.
   17. Calcule o volume de 1x PBS necessário com base no número de DWB a ser rastreado (500 μL por poço + 10% a mais).
   18. Clique em Executar ao lado do programa Configuração do ensaio - ressuspensão PBS (DWB) (consulte o Arquivo suplementar 1), defina o volume de distribuição para 500 μL, certifique-se de que 1x PBS seja adicionado ao reservatório correto e, em seguida, organize as placas centrifugadas de acordo com o layout do manipulador de líquidos. Certifique-se de que dicas suficientes estejam disponíveis. Clique em OK para iniciar o programa.
       NOTA: A lavagem das células é realizada para remover os meios de crescimento residuais, que podem produzir alguma autofluorescência.
   19. Sele novamente e remova as placas ressuspensas do manipulador de líquidos. Certifique-se de que os pellets sejam completamente ressuspensos verificando a parte inferior da placa. Continue a transferir DWBs peletizados para o manipulador de líquidos e repita a etapa 3.3.18. até que todas as placas tenham sido ressuspensas.
   20. Clique em Executar ao lado do programa Configuração de ensaio - Adição de células e PBS (MTP) (consulte Arquivo suplementar 1). Transfira os DWBs ressuspensos da etapa 3.3.18. no manipulador de líquidos de acordo com o layout sugerido. Transfira MTPs vazios para o manipulador de líquidos de acordo com o layout. Certifique-se de que o volume de distribuição esteja definido para 200 μL e que haja pontas suficientes disponíveis. Clique em OK para iniciar o programa.
   21. Transfira MTPs preenchidos (volume final do ensaio 200 μL) para um leitor de placas multimodo off-line, meça a fluorescência relativa em um comprimento de onda de emissão de excitação apropriado (por exemplo, sfGFP lEx/lEm = 488/520) e OD₆₀₀ para cada poço na placa.
       NOTA: As configurações de comprimento de onda de emissão de excitação dependerão da escolha do gene fluorescente codificado no vetor de expressão. Certifique-se de que as configurações de ganho no leitor de placas sejam consistentes e permita a discriminação entre variantes baixas e altas sem saturar o detector.
   22. Repita as etapas 3.3.20. e 3.3.21. até que todos os DWPs do ensaio tenham sido transferidos para MTPs e medidos.

4. Processamento/transformação de dados e classificação diferencial

1. Realize uma normalização dos dados coletados dividindo a fluorescência GFP registrada (RFU) pela medição OD₆₀₀ registrada para cada variante para cada uma das concentrações efetoras avaliadas (0 e 1000 μM).
   NOTA: A maioria dos leitores de placas pode ser programada para normalizar automaticamente a fluorescência por OD₆₀₀ durante a coleta de dados.
2. Calcule ON/OFF para obter a faixa dinâmica de cada variante dividindo a RFU/OD₆₀₀ a 1000 μM (ON) pela RFU/OD₆₀₀ a 0 μM (OFF). Plote todos os valores de ON/OFF de variantes como um gráfico de dispersão usando o ON/OFF da construção do biossensor de base para determinar as variantes que exibem atividade acima do nível de base.
   NOTA: O ON/OFF da construção inicial do biossensor usado no protocolo foi determinado em 3,6 vezes com base na caracterização inicial da sequência do tipo selvagem²³.
3. Para uma caracterização aprofundada, ajuste os dados de dose-resposta usando uma função Hill com uma inclinação variável para extrair valores de EC50 e/ou inclinação de Hill usando software analítico.
   NOTA: Para estimar a sensibilidade e EC₅₀, colete pelo menos quatro pontos de dados abrangendo o intervalo em que a resposta faz a transição de baixa para alta ativação, normalmente a parte mais íngreme da curva. Embora mais pontos de dados melhorem a resolução e a precisão, quatro pontos são suficientes para estimar a classificação de sensibilidade.
4. Do conjunto completo de variantes, selecione um subconjunto de variantes (por exemplo, N = 100) garantindo uma cobertura equilibrada das classificações desejadas, neste caso EC₅₀. Para fazer isso, identifique variantes que abrangem uma ampla gama no EC₅₀, garantindo que as variantes de alta e baixa classificação sejam representadas proporcionalmente. Remova variantes redundantes (por exemplo, aquelas com classificações semelhantes e impacto mínimo na cobertura de distribuição).
5. Depois de selecionar a biblioteca de amostra de variante final (por exemplo, N = 100), transforme os dados usando a seguinte equação de transformação linear-logarítmica (lin-log) (Eq.1).
   Eq.1:
   
   onde
   
   
   
6. Para valores EC50, atribua +1 para o mais alto (menos sensível) e -1 para o mais baixo (mais sensível). Uma média geométrica de 0 corresponde a níveis de expressão intermediários.

5. Geração de Projeto de Triagem Definitiva / DoE

1. Para explorar sistematicamente o espaço de design do biossensor, use um Definitive Screening Design (DSD). Este projeto é preferido devido à sua capacidade de explorar o espaço do projeto de forma eficiente, adaptando o estudo às necessidades específicas do sistema.
2. Clique na categoria DOE e, em seguida, selecione o botão Definitive screening design no software estatístico (ver Arquivo Suplementar 2).
3. Defina os fatores experimentais (por exemplo, EDR_trans , P_reg , EDR_e P_saída) como variáveis contínuas clicando no botão Contínuo e nomeando-os, certificando-se de definir os Valores para +1 e -1 (consulte o Arquivo Suplementar 3).
4. Defina as respostas desejadas (por exemplo, ON, OFF, ON/OFF, EC50, Slope) clicando no botão Adicionar resposta e personalizando o nome (consulte o Arquivo Suplementar 4).
   NOTA: Defina a meta da resposta clicando no menu suspenso da meta, selecione Nenhum ou Maximizar dependendo do objetivo do design (por exemplo, exploração versus otimização).
5. Uma vez definidos os fatores e respostas, clique em Continuar para abrir a guia de opções de projeto. Selecione Nenhum bloco necessário e, em seguida, clique no botão Criar projeto (consulte Arquivo suplementar 5).
   NOTA: Blocos podem ser adicionados para isolar o experimento de fatores incômodos (fatores que não são de interesse primário). Isso pode adicionar complexidade aos experimentos; no entanto, é usado a critério do pesquisador.
6. O software gerará uma tabela de projeto experimental descrevendo as combinações específicas de fatores a serem testados. As partes genéticas das bibliotecas transformadas lin-log correspondentes serão usadas para gerar as 17 construções correspondentes. Salve e exporte a tabela de design clicando em Criar tabela (consulte o Arquivo Suplementar 6).

6. Repita a etapa 2 - Projeto e montagem de projetos genéticos informados pelo DoE

1. Comece a construir os plasmídeos multivariáveis de acordo com o plano de Projeto de Triagem Definitiva (DSD).
   1. Identifique uma variável inicial (por exemplo, promotor, RBS, etc.). Projete e solicite primers para linearizar o vetor de expressão, garantir que os primers flanqueiem a região variável alvo, garantindo a remoção de quaisquer elementos de sequência pré-existentes.
   2. Projete e solicite primers que amplificarão especificamente as sequências variantes correspondentes aos níveis de biblioteca predefinidos (por exemplo, -1, 0, +1) para cada nó regulador (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). Certifique-se de que cada primer inclua braços de homologia de 30 pb que sejam complementares ao local de inserção do vetor de expressão.
   3. Purificar o DNA do plasmídeo da cultura de estoque criogênico relevante correspondente aos níveis de biblioteca +1, 0 e -1 para a variável identificada por meio de miniprep.
2. Estabelecer as reações de PCR para o vector de expressão linearizado e os fragmentos de biblioteca no gelo e determinar a concentração do produto conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2.
   1. Repita as etapas 2.3 a 2.4 do protocolo para realizar a montagem de Gibson do vetor de expressão linearizado e fragmentos de biblioteca. Certifique-se de que placas de Petri de tamanho padrão sejam usadas neste estágio.
   2. Filtre as colônias usando o sequenciamento Sanger para confirmar a montagem correta da construção para cada um dos projetos DSD sugeridos e, em seguida, prossiga para a transformação de P. putida (etapas 2.5 - 2.6).
   3. Usando PCR, confirme a presença do plasmídeo correto em colônias transformadas. Escolher transformantes confirmados e inoculá-los em 10 ml de LB suplementado com antibiótico para crescimento noturno a 30 °C durante 18 h (180 rpm). Crie criostocks (25% de glicerol final) e armazene a -80 °C.

7. Triagem e racionalização de dados

1. A partir de estoques criogênicos, listre o P. putida transformado com as construções de design DSD relevantes em ágar LB suplementado com antibiótico, incube a 30 ° C por 18 h durante a noite para cultivar colônias.
   1. Escolha três colônias individuais de cada placa correspondentes aos designs DSD sugeridos e cultive durante a noite em 10 mL de meio LB suplementado com antibiótico a 30 ° C por 18 h.
   2. No dia seguinte, carregar um DWB com um gradiente de concentração do efetor variando de 0 mM a 1 mM (concentração final) por linha até um volume total de 50 μL por alvéolo. Diluir as culturas durante a noite 1/100 em LB fresco e adicionar 450 μL de cultura ao DWB através do gradiente de concentração.
   3. Repita manualmente as etapas 3.3.14 e 3.3.16 para obter DWBs crescidos e, em seguida, pule para e execute manualmente as etapas 3.3.18, 3.3.20. e 3.3.21. para obter dados RFU/OD para cada variante sugerida.
2. Ajuste os dados de resposta à dose (RFU/OD) usando uma função Hill (com inclinação variável), extraindo parâmetros apropriados (fatores) para otimização, como EC₅₀, inclinação de colina, faixa dinâmica ou faixa operacional. Transforme os dados resultantes em log10 e insira os parâmetros extraídos na tabela DSD para cada um dos experimentos testados.
   1. Realize uma análise de triagem de dois níveis para identificar fatores significativos que afetam o desempenho do biossensor. Use a razão t de Lenth e a análise de gráfico seminormal^{23, 30} para determinar qual fator se desvia da distribuição esperada e retém no modelo. Manter o efeito da hereditariedade, garantindo que qualquer fator significativo apenas na interação também seja incluído individualmente.
   2. Realizar modelagem de regressão de mínimos quadrados padrão (SLSR)³⁰ para cada variável de resposta de forma independente, incorporando apenas os fatores significativos identificados. Avalie o diagnóstico do modelo de regressão, incluindo gráficos residuais, testes de falta de ajuste e valores de R², para garantir o ajuste adequado dos dados.
   3. Use um criador de perfil de resposta para determinar as configurações de fator ideais com base nas características desejadas do biossensor. Defina funções objetivo para cada resposta (por exemplo, maximizar a faixa dinâmica e minimizar o EC₅₀) para gerar configurações de fator que alcancem o melhor equilíbrio em todas as respostas, considerando as restrições e compensações do sistema.
3. Retorne às bibliotecas de variantes e construa o biossensor otimizado de acordo com os módulos sugeridos pelo profiler de resposta, seguindo as etapas 6.1 a 6.2 do protocolo. Valide o desempenho da construção otimizada por meio da caracterização dose-resposta.

Results

Inicialmente, os módulos que afetam a função do biossensor devem ser selecionados para variação; isso pode incluir a regulação de proteínas de transporte, que podem afetar a concentração intracelular de ligantes e, portanto, a saída do biossensor, mas também inclui níveis relativos de transcrição e tradução do próprio aTF, bem como o repórter fluorescente ou gene de saída (Figura 1). A Figura 2 demonstra um fluxo de trabalho típico usado no desenvolvimento de um experimento baseado em DoE para otimização de biossensores; começando com a organização de elementos regulatórios em módulos distintos passíveis de manipulação via biologia sintética por meio de mudanças no nível da sequência, especificamente em locais de operadores, hexboxes ou RBS' (Figura 2A). Como tal, a próxima etapa no fluxo de trabalho do DoE é a randomização de locais de sequência para gerar bibliotecas de variantes (Figura 2B). O grau de randomização deve ser cuidadosamente considerado, pois o número de colônias rastreadas deve ser dimensionado com o grau de randomização 4^N, onde N é igual ao número de posições de base aleatórias. Tratar cada promotor único ou sequência RBS como uma variável categórica única no DoE aumentaria o número de construtos necessários para níveis experimentalmente inviáveis, pois tal conversão para variáveis contínuas por meio da caracterização das bibliotecas é uma etapa de triagem necessária para avaliar a gama de funções adquiridas por meio da randomização e definir o superior, médio, médio, e limites inferiores de funcionalidade. Isso é alcançado pela primeira vez por meio da análise da produção das bibliotecas como uma medida da força do RBS ou variante promotora por meio de um gene repórter (Figura 2C). Uma transformação lin-log é realizada, como mostrado, para discretizar as variáveis contínuas em níveis que podem ser usados pelo DoE para explorar diferentes combinações e desenvolver um modelo que descreva os efeitos dessas variantes. Um projeto de triagem é então implementado usando 3 níveis que descrevem a faixa de atividade para cada fator de forma combinatória (Figura 2D). Por meio da montagem e teste dos projetos sugeridos, o espaço experimental é explorado de forma eficiente e as interações entre os fatores reveladas. A análise estatística dos dados resultantes é usada para determinar qual combinação de fatores tem o efeito mais significativo na saída do biossensor, e o SLSR é usado para prever o comportamento do sistema sob diferentes critérios, facilitando a otimização do biossensor em direção a resultados específicos, como aumento da faixa dinâmica ou sensibilidade (Figura 2D).

Figura 3 demonstra a montagem e triagem de uma biblioteca de promotores regulada por aTF. A montagem isotérmica usando um oligonucleotídeo degenerado foi realizada para criar uma biblioteca codificada por plasmídeo, em que cada plasmídeo é randomizado exclusivamente em posições específicas. O grau de diversidade da biblioteca determinará o número de colônias a serem rastreadas, com tamanhos de biblioteca teórica maiores se beneficiando muito da automação. A análise da sequência do promotor de operons homólogos ao TphR forneceu um mapa de conservação de bases que foi usado para informar os locais de randomização, especificamente bases que mostraram algum grau de variação e, portanto, podem modular a atividade sem serem absolutamente essenciais²³. Três bases em cada uma das caixas hexagonais -35 e -10 foram direcionadas para randomização completa, além de seis bases no local do operador (Figura 3A), resultando em uma biblioteca teórica de promotores de ~ 500.000. A biblioteca de plasmídeos foi posteriormente usada para transformar a cepa hospedeira. Nesse estágio, uma boa eficiência de transformação é crucial para obter cobertura de biblioteca suficiente com abordagens comuns de solução de problemas mostradas em Figura 3B. A otimização das concentrações de DNA, o método de transformação e o design de clonagem podem melhorar significativamente os rendimentos do transformador. Figura 3C demonstra um fluxo de trabalho típico Ao obter transformantes, colônias individuais correspondentes a variantes únicas devem primeiro ser cultivadas em meio antes que qualquer trabalho de caracterização possa começar. Para cobrir o tamanho da biblioteca teórica, um grande número de variantes precisará ser escolhido e organizado em placas. Aproveitar sistemas automatizados, como manipuladores de líquidos e colhedores de colônias, pode banalizar essa etapa de trabalho intensivo. Passo 1 de Figura 3C ilustra a transferência de meios de crescimento em MTPs que foram carregados manualmente na doca do manipulador de líquidos, seguida de inoculação automatizada por um colhedor de colônias. Algumas etapas, como selar as placas e transferi-las para incubadoras off-line, são manuais, mas também podem ser automatizadas, se desejado. Após o crescimento das culturas, manipuladores de líquidos também podem ser usados para gerar estoques criogênicos por meio da adição de glicerol, como mostrado em Figura 3C. Nesta fase, o código de barras das placas garantirá que cada variante escolhida seja vinculada a uma placa específica e localização do poço, permitindo fácil referência para posterior caracterização a jusante. Uma das principais vantagens das abordagens automatizadas, além da redução do trabalho, é a redução do erro humano, com erros na fase de preparação da biblioteca menos propensos a serem levados adiante. Passo 2 de Figura 3C ilustra a fase de caracterização automatizada da preparação da biblioteca. Isso começa via o enchimento de DWBs com meios usando a plataforma de manipulação de líquidos, seguido de inoculação usando os estoques criogênicos com código de barras. A automação neste estágio novamente garante que os erros de pipetagem e mão de obra sejam minimizados. As placas são então seladas e transferidas manualmente para incubadoras off-line para crescimento, momento em que a disposição dos compostos efetores em placas frescas de poços profundos pode ser iniciada. Para fins de uma tela inicial de bibliotecas de peças, uma tela ON/OFF simples pode ser desejável, pois pode ser usada para pré-selecionar variantes não funcionais que exibem atividade igual ou pior do que a construção base e enriquecer o pool de variantes para aquelas que exibem atividade aprimorada. Isso tem o benefício adicional de reduzir os custos de material de pontas e placas que podem se tornar proibitivos em protocolos de triagem de grandes bibliotecas. No entanto, quando a otimização de métricas de desempenho de biossensores mais complexas é necessária (por exemplo, EC₅₀), serão necessárias concentrações adicionais de efetores. Após o crescimento das culturas, as placas são devolvidas à plataforma de manipulação de líquidos, que começa a inocular as placas contendo compostos efetores antes de serem devolvidas manualmente à incubadora mais uma vez durante o ensaio. Figura 3D demonstra a etapa final de automação antes da coleta de dados. Após o período decorrido para crescimento e ativação do biossensor, as placas são removidas da incubadora offline e devolvidas à plataforma de manipulação de líquidos. Para remover os meios de crescimento residuais, que podem interferir na coleta de dados de fluorescência, são necessárias centrifugação, remoção do sobrenadante e lavagem das células com 1x PBS. O uso de manipuladores de líquidos pode novamente banalizar esse processo, com a ressuspensão automatizada de culturas permitindo o processamento rápido das placas, incluindo a transferência das células lavadas para MTPs de formato de 96 poços para triagem. A coleta de dados pode ser realizada de forma manual ou automatizada, com alguns leitores apresentando pilhas de placas que podem interagir com manipuladores de líquidos para automatizar ainda mais o processo de coleta de dados. Ao comparar a proporção de ativação do biossensor na presença do efetor (ON) com sua ausência (OFF), 5.000 variantes foram avaliadas usando o grau de ativação do biossensor (mudança de dobra) para determinar a função do biossensor; Apenas as variantes com atividade acima da construção base (3,6 vezes) foram levadas adiante para caracterização posterior, conforme indicado pela região sombreada vermelho-rosa do gráfico de dispersão (Figura 3D). Com base nas posições das placas e dos poços do pool de variantes enriquecido, a caracterização robusta usando réplicas biológicas ou diferentes concentrações de efetores pode ser realizada consultando-se de volta às placas crio-estoque originais com código de barras geradas na Etapa 1 do fluxo de trabalho.

A Figura 4 demonstra a triagem das variantes triadas a partir da triagem inicial da biblioteca com o objetivo de desenvolver uma biblioteca promotora para otimizar a sensibilidade. Usando os dados das 5.000 variantes rastreadas no fluxo de trabalho anterior, um pool triado de 226 variantes da tela inicial ON/OFF, determinado como mais ativo do que a sequência parental, foi então caracterizado e classificado de acordo com sua sensibilidade, a fim de atuar como níveis em torno dos quais um DSD poderia ser projetado. Como primeiro passo, as variáveis categóricas, neste caso as variantes P_out top, devem ser convertidas em variáveis contínuas que abrangem uma ampla faixa de sensibilidade. Para rastrear a sensibilidade, são necessárias curvas de resposta à dose para obter dados EC₅₀ de uma função Hill plotada; isso aumenta drasticamente o trabalho de galvanização e é adequado para automação usando manipuladores de líquidos para simplificar o processo de configuração e triagem do ensaio, conforme mostrado na Figura 4A. Seguindo o fluxo de trabalho estabelecido na Etapa 2 da Figura 3C, códigos de barras de placas e posições de poços correspondentes ao conjunto enriquecido de variantes foram usados para inocular DWBs preenchidos com meios de crescimento e antibióticos. Para aumentar a robustez experimental, as variantes foram rastreadas em triplicata biológico. Após a transferência das placas para a incubadora off-line para crescer, os DWBs frescos foram preenchidos com meios de crescimento suplementados com efetores de 0, 1, 25 e 1000 μM usando os manipuladores de líquidos para reduzir o trabalho. Para reduzir o número de placas necessárias para o ensaio, foi escolhida uma faixa de concentração abrangendo a parte inferior, média e superior da curva, com as concentrações do ponto médio revelando as sensibilidades relativas de cada variante, conforme ilustrado na Figura 4A. Após a inoculação dos pools variantes em cada concentração efetora e análise de fluorescência e OD₆₀₀, as curvas de resposta à dose foram plotadas, com análise de regressão não linear usada para determinar EC₅₀. Nesta fase, uma biblioteca bruta de cada variante com um valor EC₅₀ exclusivo foi gerada, com as 100 variantes mais robustas levadas adiante, conforme mostrado na Figura 4B , a fim de reduzir ainda mais o tamanho da biblioteca. Antes que essa biblioteca possa ser usada no DoE, no entanto, a conversão das variantes exclusivas em uma biblioteca classificada, representando a faixa de sensibilidade contida nela, deve ser gerada. Isso foi obtido realizando uma transformação lin-log dos dados, que classifica e redimensiona os dados para que cada variante seja classificada da mais sensível (-1) para a menos sensível (+1), bem como definindo um valor de ponto médio (0), que representa a média geométrica do conjunto de dados Figura 4C. A transformação dos dados brutos produziu o gráfico azul mostrado na Figura 4D, a partir do qual sequências discretas de P_out correspondentes a +1, 0 e -1 foram levadas para o projeto de triagem definitivo como níveis de fator de P_out .

Figura 5 demonstra o fluxo de trabalho completo após a geração da biblioteca, desde a geração do DSD até a modelagem e otimização global de um biossensor com base nos aprendizados assistidos pelo DoE. Figura 5A apresenta uma divisão de um biossensor típico em 3 módulos com 1 (módulos de transporte e regulador) ou 2 (módulo de saída) nós de regulação. Seguindo o exemplo de Figura 4, bibliotecas RBS ou promotoras terão sido desenvolvidas e níveis variando de +1, 0 e -1 selecionados para abranger a maior variação de cada fator. O tamanho das bibliotecas selecionadas normalmente determinaria o número de experimentos necessários para explorar totalmente o espaço de design, por exemplo, se cada biblioteca fosse de tamanho 22, isso equivaleria a 22⁴ (234.256) combinações. O DoE visa simplificar a carga de trabalho experimental, reduzindo o número de combinações por meio de projetos de triagem estruturados. Embora muitas metodologias sejam possíveis, o DSD é ideal para o desenvolvimento de biossensores, pois permite a identificação de fatores principais e interações de dois fatores, evitando efeitos confusos de segunda ordem. Além disso, como os projetos DSD utilizam 3 níveis, é possível estimar a curvatura (não linearidade). Figura 5A demonstra uma saída DSD típica em que cada um dos 4 módulos é definido para níveis diferentes; como cada nível corresponde a um promotor específico ou variante RBS, a montagem isotérmica é usada para gerar as construções genéticas correspondentes aos projetos recomendados do DSD. Depois de montar e transformar a cepa hospedeira com as construções recomendadas, as curvas de resposta à dose são obtidas usando uma gama completa de concentrações efetoras para fornecer mais confiança no desempenho de cada uma das construções Figura 5B. Como o DSD reduz drasticamente o número de construções, essa etapa geralmente pode ser executada manualmente ou usando manipuladores de líquidos automatizados, se preferir. Figura 5C apresenta a saída do perfil de predição obtido após a construção e teste das combinações sugeridas a partir da tela DSD e a construção de modelos preditivos baseados no coeficiente de Hill (n_H) e CE₅₀ saída de cada combinação testada. O objetivo do experimento foi desenvolver uma construção de biossensor que fosse globalmente otimizada para n_H e CE₅₀ através da modulação da expressão dos 4 nós reguladores para maximizar ambos os parâmetros. Cada fator regulador é mostrado em sua própria coluna com o grau de expressão indicado ao longo do eixo x correspondente ao promotor transformado lin-log e às bibliotecas de peças RBS (-1 a +1). O efeito de alterar a expressão de nós em ambos os EC₅₀ e n_H é indicado pelas curvas nas subparcelas. Os gráficos de perfil destacam a natureza muitas vezes não intuitiva da otimização do biossensor, em que o ajuste de um nó regulador pode ter efeitos opostos nos parâmetros de saída. Por exemplo, EDR_Trans não tem forte correlação com n_H,_{no entanto, correlaciona-se positivamente com a CE50} de forma não linear. Interações de ordem superior (não lineares) também estão implícitas, no caso de RBS_fora Um aumento na resistência aumentará a inclinação (maior n_H) com um aumento concomitante da sensibilidade (menor CE₅₀), resultando em uma curva com uma inclinação mais digital e resposta mais nítida ao aumento da concentração de efetores. A partir desses modelos, facetas não intuitivas do ajuste do biossensor podem ser renderizadas com mais clareza, o que permite a otimização dos nós de regulação em direção a um ótimo global. Os modelos foram usados para prever os ótimos globais para ambos os EC₅₀ e n_H , com as linhas vermelhas no gráfico indicando os níveis ótimos de cada nó regulador (Figura 5C). Figura 5D demonstra o perfil dose-resposta da construção inicial do biossensor parental (Azul) em comparação com o design DSD de melhor desempenho (Verde) e a construção globalmente otimizada (Lilás). Usando o modelo para prever as forças ideais do módulo para maximizar o EC₅₀ e n_H, uma variante correspondente a RBS_Trans (-1), P_Reg (-0,7), P_fora (-0,3) e RBS_fora (+1) foi montada e caracterizada com o construto otimizado mostrando melhorias no EC₅₀ e n_H (Figura 5D). Embora tanto o DSD quanto os biossensores otimizados globalmente exibam EC₅₀ (0,8 vs 0,7 μM), n_H foi significativamente melhorado sem comprometer a CE₅₀ ganhos que já foram alcançados. Os resultados demonstram claramente as vantagens do design orientado a dados sobre as abordagens baseadas na intuição e servem para validar o DoE como um meio de agilizar e simplificar o processo de ajuste do biossensor.

Figura 1: Ajuste de parâmetros de biossensores geneticamente codificados. Layout dos módulos genéticos de um biossensor geneticamente codificado, incluindo aTF, locais do operador (OS), hexboxes (-35, -10) e componentes RBS. As caixas coloridas correspondem a interações que normalmente afetam os parâmetros do biossensor, como: afinidade ligante-aTF (cinza), operador aTF (rosa), RNAP-Hexbox (verde) e RBS (laranja). Os efeitos de cada parâmetro nas características dose-resposta são indicados nos gráficos representativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral de um fluxo de trabalho típico de otimização de biossensores DoE. (A) Visão geral da modularização dos componentes do biossensor mostrando um módulo de transporte que codifica uma proteína de transporte para importar o efetor alvo, um módulo regulador pertencente ao aTF e um módulo de saída que codifica uma proteína repórter como sfGFP. Também são mostrados nós de regulação, como RBS_trans, P_reg, P_out e RBS_out, que correspondem aos nós genéticos que serão submetidos à randomização para explorar os parâmetros do biossensor. (B) Uma seleção de elementos de sequência passíveis de randomização de base, incluindo promotores e RBS '. A sequência parental do promotor é mostrada na linha superior, com a sequência mutante finalizada mostrada abaixo, as estrelas indicam bases inalteradas, enquanto K, M e N referem-se a guanina/timina, adenina/citosina ou qualquer nucleotídeo, respectivamente. Os promotores oferecem maior potencial de randomização por meio do direcionamento de hexboxes ou locais de operadores e também podem incluir duplicação ou modificação do espaçamento das sequências. As bibliotecas RBS oferecem opções de randomização mais limitadas, no entanto, são significativamente mais fáceis de rastrear devido à sua menor diversidade máxima. (C) Os níveis de expressão das variantes são caracterizados e, em seguida, convertidos em uma biblioteca lin-log classificada para converter os fatores de variantes categóricas em 3 níveis discretos que são mais passíveis de análise via DoE. (D) O mapeamento do espaço experimental é realizado usando combinações multiplexadas dos três níveis de cada módulo para gerar um modelo que pode ser usado para informar as escolhas de projeto para ajustar o desempenho do biossensor em direção aos resultados desejados, isso pode ser em direção à faixa dinâmica ou à sensibilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Modularização do biossensor, construção da biblioteca do promotor e fluxo de trabalho automatizado. (A) Exemplo de randomização de sequências específicas no promotor aTF e inserção na construção do biossensor via montagem isotérmica. Letras em negrito indicam posições que foram randomizadas no local do operador ou hexboxes de acordo com a chave fornecida durante a síntese de oligonucleotídeos degenerados. (B) Painel descrevendo a transformação da biblioteca de variantes do biossensor resultante em um hospedeiro de clonagem , como E. coli, e as próximas etapas, dependendo do rendimento do transformador. A baixa eficiência de transformação pode resultar em baixa cobertura teórica da biblioteca e exploração inadequada do espaço de design. A solução de problemas neste estágio é fundamental para garantir que uma parte significativa das variantes esteja disponível para caracterização, com medidas comuns de solução de problemas descritas. (C) Fluxo de trabalho das etapas 1 e 2 conforme descrito no protocolo, com o símbolo da mão vermelha indicando etapas manuais e a engrenagem indicando etapas automatizadas. O fluxo de trabalho da etapa 1 destaca as principais etapas do protocolo, desde a seleção da colônia até a geração de estoque criogênico. O fluxo de trabalho da etapa 2 demonstra o renascimento e o rearranjo de estoques criogênicos para análise por curva de resposta à dose. (D) O painel demonstrando o procedimento final antes da triagem, incluindo a lavagem das células e a transferência para placas de ensaio antes da medição da fluorescência e do OD. Um pool de variantes rastreadas de 5000 é mostrado no painel, com as variantes demonstrando ON/OFF além da sequência do promotor parental (3,6 vezes) destacada na caixa laranja. Muitas das variantes podem ser vistas agrupadas em torno de 1, indicando baixo desempenho e baixa variabilidade, provavelmente devido à randomização no nível da sequência causando perda de função. As 226 variantes mostradas em caixa no gráfico foram levadas adiante para uma caracterização robusta. Os dados foram adaptados da publicação original de Alvarez Gonzalez et al²³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Triagem e discretização de variantes superiores da biblioteca do promotor por meio da transformação lin-log. (A) Esboço do procedimento padrão para gerar dados de expressão para uma EDR ou biblioteca promotora. Usando as variantes triadas que representam uma boa gama de níveis de expressão, os manipuladores de líquidos são usados para gerar placas de ensaio pré-preenchidas com concentração predeterminada de efetor a partir da qual derivar curvas de resposta à dose das 226 variantes triadas. (B) Após a determinação do EC₅₀ e posterior redução da biblioteca caracterizada para 100 variantes, os dados são plotados como um gráfico de barras mostrando a mistura de diferentes sensibilidades geradas a partir da randomização do promotor. (C)Os dados EC₅₀ são transformados usando a equação de taxa lin-log para converter o conjunto de dados contínuos em um conjunto categórico mais adequado para fatoração em um DSD. (D) Os dados da variante EC₅₀ transformados são mostrados agora reduzidos a uma escala simplificada e classificados de alta a baixa atividade EC₅₀ . A partir disso, 3 níveis correspondentes à média geométrica superior (+1) (0) e inferior (-1) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Projeto experimental DSD, teste e resultados de aprendizagem baseados em modelo. (A) Fluxo de trabalho esquemático mostrando a geração de uma tabela de projeto DSD com base nas bibliotecas classificadas transformadas em lin-log dos módulos RBS_trans, P_reg, P_{out e RBSout} . A tabela de projeto DSD sugere o menor número de combinações para mapear com eficiência o espaço experimental. Um exemplo de saída é fornecido em que +1, 0 e -1 se referem a variantes de desempenho superior, médio e inferior para cada nó regulatório, conforme descrito pelas transformações lin-log. Estes são construídos por meio de montagem isotérmica e confirmados por sequenciamento antes de serem transformados no hospedeiro de expressão para caracterização. (B) Após a transformação, as células são cultivadas e analisadas em relação a uma ampla gama de concentrações efetoras, e a saída fluorescente é medida para gerar curvas dose-resposta. Vários parâmetros, como nH e EC50, são extraídos das curvas dose-resposta e alimentados no DSD para gerar modelos preditivos para cada fator. (C) Usando os modelos, podem ser feitas previsões sobre o impacto da modulação de um parâmetro do biossensor por meio da alteração do nível de expressão de qualquer módulo regulatório. É importante ressaltar que o ajuste global dos nós regulatórios torna-se possível, permitindo a maximização de um ou mais parâmetros do biossensor simultaneamente, indicados pelas linhas vermelhas tracejadas em cada subparcela. (D) A otimização do modelo em direção à sensibilidade máxima resulta na construção globalmente otimizada (lilás), cuja curva de resposta à dose é plotada em relação à construção DSD de melhor desempenho (verde) e à construção do biossensor parental (azul). Os parâmetros n_H e EC₅₀ extraídos são mostrados abaixo do gráfico, demonstrando a melhoria de ambos os parâmetros acima do construto DSD de melhor desempenho, validando a eficácia dos modelos preditivos gerados a partir do DSD. Os dados foram adaptados da publicação original de Alvarez Gonzalez et al²³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Etapas do protocolo automatizado de manuseio de líquidos usadas para preparação da biblioteca de biossensores e configuração do ensaio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2 à Figura Suplementar 6: Geração passo a passo de um Projeto de Triagem Definitivo (DSD). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Bibliotecas de elementos genéticos abrangendo ampla variabilidade genética são cruciais para o sucesso de uma metodologia baseada em DoE. Conforme demonstrado na Figura 2A, o número de variantes teóricas aumenta com o número de posições a serem direcionadas para mutagênese, bem como o grau de randomização, com esse tamanho de biblioteca cada vez maior criando gargalos de triagem significativos. Reduzir o número de posições visadas ou o grau de randomização pode reduzir o número de variantes que precisam ser rastreadas e é uma abordagem atraente se for necessária uma abordagem mais direcionada para o ajuste ou se existir um conhecimento significativo a priori do sistema como um guia. No caso de sistemas como biossensores, no entanto, que apresentam muitas características sobrepostas ou podem não ter elementos genéticos bem caracterizados, é difícil contornar o requisito de tamanho da biblioteca. O uso de manipuladores de líquidos automatizados pode banalizar o trabalho de escolher colônias e variantes de cultura, especificamente quando é necessária uma maior coleta de pontos de dados para a plotagem de funções mais avançadas, como curvas de resposta à dose versus dois comparadores de pontos de dados, como ON/OFF. Embora seja difícil quantificar especificamente o tempo economizado com a inclusão de fluxos de trabalho automatizados, O maior benefício de sua implementação está no tempo que pode ser dedicado a outros experimentos paralelos³⁸.

Apesar disso, em muitos casos em que os tamanhos das bibliotecas excedem 10⁴, mesmo as metodologias assistidas por manipuladores de líquidos tornam-se impraticáveis³⁹. Nesses casos, uma triagem preliminar de variantes usando citômetros de fluxo é uma abordagem altamente atraente, com uma capacidade de triagem muito maior de até 10⁷ células por h⁴⁰. O uso de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com duas rodadas de seleção positiva e pelo menos uma rodada de seleção negativa tem sido rotineiramente empregado na triagem das variantes de biossensores de melhor desempenho antes de uma caracterização mais extensa 16,26,42. O desenvolvimento e a execução de tais protocolos utilizando o FACS foram revisados em detalhes em outro lugar³¹. As telas de triagem inicial são possíveis usando ensaios de manipulador de líquidos baseados em placas, conforme descrito no protocolo acima; comparando os dados ON/OFF usando uma única concentração efetora como mostrado na Figura 3D, apenas biossensores variantes com um ganho apreciável de função (3,6 vezes conforme fornecido nos métodos) podem ser selecionados para caracterização mais detalhada, simplificando o desenvolvimento da biblioteca e o tempo de execução experimental. Tanto o FACS quanto as plataformas de manuseio de líquidos, no entanto, vêm com um investimento de capital significativo para o laboratório e geralmente exigem um nível de conhecimento técnico para operar e manter. As telas baseadas em placas de ágar fornecem uma barreira técnica e financeira mais baixa à entrada e têm sido usadas em combinação com GFP ou triagem de colônias azul-esbranquiçadas para selecionar variantes da biblioteca RBS, bem como mutantes enzimáticos com base na intensidade da fluorescência^43,44. No entanto, também estas são limitadas no número de variantes que podem ser efetivamente rastreadas, mas também requerem uma diferença significativa na fluorescência para serem detetáveis⁴⁴. Como um compromisso entre a mutação simultânea totalmente combinatória de vários elementos ao mesmo tempo, uma metodologia de "dividir e conquistar" visa dividir grandes bibliotecas de variantes em blocos de triagem mais gerenciáveis⁴¹. Embora uma abordagem modularizada possa ser pragmática, ela não explora efetivamente o espaço de design combinatório, pois o desempenho dos componentes biológicos é conhecido por ser altamente dependente do contexto, especialmente em bactérias, onde o acoplamento transcricional e translacional é predominante. Isso tem o potencial de resultar em escolhas de design que visam os máximos locais em vez dos ótimos globais.

O transporte e o reconhecimento de indutores específicos representam outra característica importante do desenvolvimento de biossensores que merece destaque, apesar de não ser o foco principal do protocolo delineado. A falta de um aTF apropriado para a molécula-alvo representa um desafio significativo para os pesquisadores. A seleção racional de um aTF existente que se liga a um análogo estrutural do efetor alvo pode fornecer um modelo ideal no qual aplicar a randomização de códons para ajustar a especificidade do aTF ao efetor desejado¹⁷. O alinhamento da sequência alvo às estruturas resolvidas ou as predições de Alphafold podem permitir a identificação de sítios de ligação efetores com resíduos suspeitos de aminoácidos submetidos à randomização e classificação semi-racionais, adaptáveis ao protocolo¹⁷. Da mesma forma, a seleção e modulação de transportadores responsáveis pela importação/exportação de efetores podem alterar significativamente as características dose-resposta do biossensor. A expressão gênica do transportador foi considerada um ator significativo na resposta do biossensor, com uma biblioteca diversificada de promotores de P_tac e RBS controlando a expressão de um transportador MucK usado para estabilizar sua expressão em várias rodadas de FACS, aumentando a robustez da resposta do biossensor¹⁷. Da mesma forma, a triagem de diferentes proteínas transportadoras pode modular a especificidade dos biossensores, com a triagem de um conjunto putativo de transportadores de PcaK usando um biossensor responsivo a PCA levando à identificação de dois transportadores capazes de absorver substratos 3,5-hidroxilados, expandindo o conjunto de compostos detectáveis por esse sistema²⁴.

As plataformas automatizadas podem se tornar ferramentas ainda mais poderosas para caracterização e exploração ao combinar os princípios do DoE com modelos de aprendizado profundo^46,47. Depois de explorar pela primeira vez o espaço de design de um biossensor com uma plataforma de alto rendimento, os algoritmos de aprendizado de máquina foram aproveitados para prever a função de sequências não caracterizadas com boa precisão ⁴⁷. Os métodos descritos neste protocolo podem ser facilmente aplicados no teste de novos modelos de aprendizagem de idiomas para design de promotores, semelhantes aos modelos que foram desenvolvidos com base na previsão de sequência de RBS cruzado⁴⁸. Além disso, a integração de tais modelos pode tirar proveito dos dados de função de sequência contidos nos projetos de promotores não funcionais e fornecer uma visão crítica sobre a funcionalidade mais ampla do biossensor como um todo. Ou seja, isso teria o potencial de resolver uma limitação crucial do fluxo de trabalho do DoE, que falsos positivos, por exemplo, um promotor não funcional, não equivalem necessariamente a uma saída medida de zero, com fenômenos como transcrição espúria ou introdução de um elemento de ruído nos dados do DoE, que é difícil de identificar e controlar. Crucialmente, para abranger o espaço total de design experimental, quaisquer bibliotecas geradas devem exibir uma ampla gama de atividades, pois uma faixa de atividade insuficiente resultará em resultados de design distorcidos e criará falta de confiabilidade em quaisquer modelos estatísticos gerados a partir do conjunto de dados³⁰. Se a baixa variabilidade da biblioteca se tornar um problema, explorar outros elementos de sequência ou aumentar o grau de randomização pode ser implementado, e a variação entre as bibliotecas pode ser comparada até que um pool de variantes adequado seja alcançado.

Um aspecto crucial do processo DoE envolve a correta estimativa e seleção dos efeitos primários e secundários obtidos do DSD que serão então incorporados à análise estatística. O DoE, sendo uma abordagem baseada em modelagem, é altamente propenso a sobreajuste e viés, o que pode complicar rapidamente o processo de otimização por meio da orientação de esforços iterativos de engenharia em seções abaixo do ideal do espaço de projeto⁴⁹. Como tal, é fundamental garantir que quaisquer projetos sejam fortemente isolados de tais efeitos, tanto na fase de concepção quanto na análise dos dados. Na fase inicial do projeto de triagem, as execuções centradas em que todos os fatores são definidos para a média geométrica (ou seja, 0,0,0,0) podem ajudar a reduzir o viés do modelo, contabilizando melhor as interações não lineares, sem adicionar carga experimental significativa (1-3 execuções adicionais) ⁴⁹ . Além disso, a inclusão de experimentos randomizados pode ajudar a contabilizar variáveis estranhas que não estão incluídas no projeto experimental, mas ainda podem influenciar as variáveis de resposta que estão sendo medidas. Em um contexto biológico, a randomização aborda questões como efeitos espaço-temporais, como posição da placa ou variação de lote para lote, evitando que tais efeitos afetem significativamente a interpretação dos dados. A atenção a esses detalhes neste estágio inicial pode melhorar a robustez dos modelos e levar a conclusões mais confiáveis. Depois de realizar os experimentos sugeridos pelo DSD, a análise estatística dos dados é necessária para elucidar os fatores que tiveram um impacto significativo nos parâmetros de saída. Gráficos semi-normais oferecem uma representação visual intuitiva das magnitudes dos efeitos, com efeitos sem significância normalmente caindo ao longo de uma linha reta, enquanto os efeitos com um impacto significativo se desviarão dessa linha, permitindo a seleção simples dos fatores mais importantes na otimização do biossensor. Com isso em mente, uma abordagem conservadora para a seleção de efeitos deve ser adotada, como em toda modelagem, para reduzir o risco de sobreajuste do modelo.

A capacidade de projetar e otimizar rapidamente biossensores e outros circuitos genéticos acelerará muito o ritmo da pesquisa no campo da biotecnologia, como no desenvolvimento de cepas e enzimas, mas também em diagnósticos em tempo real. O surgimento de metodologias de triagem baseadas em DoE neste campo é particularmente promissor, facilitando o uso eficiente de tempo e recursos enquanto explora o máximo de espaço de design possível, e já foi usado com grande efeito na otimização de circuitos genéticos para vias metabólicas e para biossensores 31,33,34,51. O DoE é particularmente adequado para problemas de otimização multifatorial nos quais muitas interações de primeira, segunda ou mesmo terceira ordem estão em ação, o que seria difícil de interrogar com a abordagem típica de design experimental de um fator de cada vez. Além disso, os esforços para projetar um aspecto de um biossensor muitas vezes resultam inadvertidamente no sacrifício de outro parâmetro, como melhorar a sensibilidade em detrimento da faixa dinâmica⁵¹. Por meio da capacidade do DoE de mapear essas interações ocultas, bem como criar modelos que preveem o comportamento do biossensor, o ciclo de aprendizado do teste de construção é bastante acelerado.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µ L pontas CO-RE, estéril sem filtro	Hamilton	235939
2,2 mL 96 Placa de poço profundo, poços quadrados com fundo em forma de V	Thermo	11594754
300 µ L CO-RE Pontas, NTRs empilhados, estéreis	Hamilton	235985
96 placas de microtitulação pretas com fundo transparente e 96	Greiner	655097
Agarose	Invitrogen	16500100
DNA de plasmídeo montado	Fornecido pelo usuário	NA
Leitor de microplacas ClarioStar Plus	BMG	NA
Mistura de solução de dexinocloetida (dNTP)	NEB	N0447L
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher BioReaggents	BP231-100
Escada de DNA 100bp	NEB	N3231L
Escada de DNA 1KB	NEB	N3232L
Sequenciamento de DNA	Fonte: Biociência	NA
Síntese de DNA	IDT	NA
Escherichia coli DH5α Células Potentes	NEB	C2987H
Corante de Carregamento de Gel, Roxo X6 Sem SDS	NEB	B7025S
Pulsador do gene/cubetas do eletroporation de Micropulser, diferença de 0.2cm	Biorad	1652082
Graph Pad Prism 10	GraphPad	NA
Hamilton Star Liquid Handler	Hamilton	NA
Incubadora de Placas HT multitron Shaker	Jogadores de Inteligência HT	NA
Suíte de Análise Estatística JMP	JMP	NA
Caldo LB (Miller)	Miller	L3522
Caldo LB (Miller) com ágar	Sigma	L3147
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621S
Q5 DNA polimerase de alta fidelidade	NEB	M0491S
QIAprep Spin Midiprep Kit	QIAGEN	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Kit de Extração de Gel QIAquick	QIAGEN	28706X4
Kit de Purificação PCR QIAquick	QIAGEN	28104
Qpix 420 Selecionador de Colônias	Dispositivos Moleculares Reino Unido	NA
SOC Meio de Crescimento	NEB	B9020S
SYBR Safe DNA Gel Mancha	Invitrogen	S33102
Tampão TAE (Tris-acetato-EDTA, 50X)	Thermo Fisher	B49
UltraPureTM Dnase/Rnase-Free Água Destilada	Invitrogen	10977015