Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

Adeline Cœugnet; Hannes Schihada; Estelle Rascol; Isabel Alves; Marie-Lise Jobin

doi:10.3791/68463

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Artigo de método

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

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DOI:

10.3791/68463

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7 de novembro de 2025

Adeline Cœugnet¹ , Hannes Schihada² , Estelle Rascol¹ , Isabel Alves¹ , Marie-Lise Jobin¹

¹CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, ²Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

Neste artigo

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Resumo

Este protocolo descreve o uso de biossensores baseados em BRAKET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas HEK293 após estimulação do ligante do receptor acoplado à proteína G. Aqui, o receptor β2-adrenérgico e o receptor canabinóide tipo 1 servem como exemplos para demonstrar a eficiência dos sensores para vários subtipos de proteína G e em vários GPCRs.

Resumo

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de receptores transmembrana, desempenhando um papel crucial na sinalização celular ao transduzir estímulos extracelulares em respostas intracelulares. A ativação do GPCR leva a mudanças conformacionais que permitem interações com proteínas G heterotriméricas. Após a ativação, a subunidade G_α sofre troca GDP-GTP, dissociando-se do dímero G_βγ e desencadeando cascatas de sinalização a jusante. Para estudar a ativação da proteína G mediada por GPCR, os biossensores baseados em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) são uma abordagem altamente sensível e não invasiva. Os sensores de atividade tricistrônica baseados na proteína G (biossensores G-CASE), desenvolvidos por Schihada et al., detectam a dissociação do heterotrímero como um proxy para ativação e permitem o monitoramento em tempo real da atividade do GPCR usando uma única transfecção de plasmídeo, superando as limitações das abordagens de co-transfecção. Os ensaios BRET oferecem várias vantagens em relação às técnicas baseadas em fluorescência, como menor ruído de fundo, fotobranqueamento reduzido e sensibilidade aprimorada. Neste protocolo, os biossensores G-CASE baseados em BRET foram usados em células vivas e placas de 96 poços. Especificamente, avaliamos a atividade do receptor β2-adrenérgico (β2-AR) e do receptor canabinóide tipo 1 (CB1R) em termos de ativação da proteína G. Usando células do tipo selvagem HEK 293T transfectadas transitoriamente com β2-AR e células HEK293T expressando CB1R de forma estável, a robustez dos biossensores G_s e G_i3 G-CASE é confirmada. Este protocolo apóia a utilidade dessa abordagem para estudos farmacológicos e triagem de GPCR de alto rendimento para entender melhor a capacidade dos ligantes de ativar vias específicas, por exemplo, por meio de uma sinalização tendenciosa e, assim, facilitar a descoberta de novos compostos terapêuticos.

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) representam a maior superfamília de receptores transmembrana, responsáveis por transduzir estímulos extracelulares em cascatas de sinalização intracelular, resultando em respostas biológicas específicas. Eles são alvos farmacológicos fundamentais, com aproximadamente 30% dos medicamentos comercializados atuando em GPCRs¹. A ligação do ligante GPCR induz mudanças conformacionais no receptor, facilitando as interações com proteínas G heterotriméricas e/ou GPCR quinases (GRKs) e β-arrestinas, iniciando assim a sinalização a jusante ou a internalização do receptor