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Artigo de método

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

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DOI:

10.3791/68463

⸱

7 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

Neste artigo

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Resumo

Este protocolo descreve o uso de biossensores baseados em BRAKET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas HEK293 após estimulação do ligante do receptor acoplado à proteína G. Aqui, o receptor β2-adrenérgico e o receptor canabinóide tipo 1 servem como exemplos para demonstrar a eficiência dos sensores para vários subtipos de proteína G e em vários GPCRs.

Resumo

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de receptores transmembrana, desempenhando um papel crucial na sinalização celular ao transduzir estímulos extracelulares em respostas intracelulares. A ativação do GPCR leva a mudanças conformacionais que permitem interações com proteínas G heterotriméricas. Após a ativação, a subunidade Gα sofre troca GDP-GTP, dissociando-se do dímero Gβγ e desencadeando cascatas de sinalização a jusante. Para estudar a ativação da proteína G mediada por GPCR, os biossensores baseados em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) são uma abordagem altamente sensível e não invasiva. Os sensores de atividade tricistrônica baseados na proteína G (biossensores G-CASE), desenvolvidos por Schihada et al., detectam a dissociação do heterotrímero como um proxy para ativação e permitem o monitoramento em tempo real da atividade do GPCR usando uma única transfecção de plasmídeo, superando as limitações das abordagens de co-transfecção. Os ensaios BRET oferecem várias vantagens em relação às técnicas baseadas em fluorescência, como menor ruído de fundo, fotobranqueamento reduzido e sensibilidade aprimorada. Neste protocolo, os biossensores G-CASE baseados em BRET foram usados em células vivas e placas de 96 poços. Especificamente, avaliamos a atividade do receptor β2-adrenérgico (β2-AR) e do receptor canabinóide tipo 1 (CB1R) em termos de ativação da proteína G. Usando células do tipo selvagem HEK 293T transfectadas transitoriamente com β2-AR e células HEK293T expressando CB1R de forma estável, a robustez dos biossensores Gs e Gi3 G-CASE é confirmada. Este protocolo apóia a utilidade dessa abordagem para estudos farmacológicos e triagem de GPCR de alto rendimento para entender melhor a capacidade dos ligantes de ativar vias específicas, por exemplo, por meio de uma sinalização tendenciosa e, assim, facilitar a descoberta de novos compostos terapêuticos.

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) representam a maior superfamília de receptores transmembrana, responsáveis por transduzir estímulos extracelulares em cascatas de sinalização intracelular, resultando em respostas biológicas específicas. Eles são alvos farmacológicos fundamentais, com aproximadamente 30% dos medicamentos comercializados atuando em GPCRs1. A ligação do ligante GPCR induz mudanças conformacionais no receptor, facilitando as interações com proteínas G heterotriméricas e/ou GPCR quinases (GRKs) e β-arrestinas, iniciando assim a sinalização a jusante ou a internalização do receptor2.

As proteínas G heterotriméricas servem como transdutores intracelulares primários da sinalização GPCR e consistem em três subunidades: Gα, Gβ e Gγ. Esses heterotrímeros são classificados em quatro famílias - Gi / o, Gs, Gq e G12/13 - com base no subtipo Gα , cada um ativando vias de sinalização distintas: o subtipo Gi / o inibe a adenilato ciclase, enquanto Gs a estimula, Gq ativa a fosfolipase C-β e G12/13 regula as GTPases da família Rho.

A ativação do GPCR leva a seus rearranjos conformacionais, permitindo o rápido envolvimento da proteína G na cinética de subsegundos. Este processo induz alterações conformacionais da proteína G, promovendo a troca GDP-GTP na subunidadeG α. A ligação ao GTP altera ainda mais a conformação da subunidade Gα, resultando em sua dissociação do dímero Gβγ, permitindo a propagação do sinal. As proteínas G são, portanto, cruciais na modulação da especificidade e dinâmica temporal das respostas celulares, regulando diversas proteínas efetoras, como adenilato ciclase ou canais iônicos 3,4,5.

Este protocolo descreve a medição da ativação ou inativação da proteína G usando biossensores baseados em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) após estimulação do ligante GPCR em células vivas. Inspirado no trabalho pioneiro em biossensores de proteína G 6,7,8,9, o sistema G-CASE (sensores de atividade tricistrônica de proteína G), introduzido por Schihada et al.10, é baseado em BRET entre as subunidades Gα e Gβγ marcadas e oferece uma abordagem simplificada que requer apenas uma única transfecção de plasmídeo. Esse recurso aumenta a sensibilidade e mitiga os desafios associados à co-transfecção de múltiplos plasmídeos que codificam as três subunidades (Gα, Gβ e Gγ) da proteína G heterotrimérica. Esses sensores foram disponibilizados comercialmente para grupos de pesquisa acadêmica (ver Tabela de Materiais).

O BRET oferece vantagens significativas sobre a Transferência de Energia por Ressonância de Förster (FRET). No BRET, a transferência de energia ocorre entre um doador bioluminescente e um aceptor fluorescente sem a necessidade de fontes de luz externas. Essa bioluminescência intrínseca reduz os problemas associados ao FRET, como autofluorescência e dispersão de luz, resultando em um sinal de fundo mais baixo e melhor sensibilidade do ensaio 6,7,11.

Essa ausência de excitação externa no BRET minimiza o fotobranqueamento e os efeitos fototóxicos, levando a sinais de fundo mais baixos em comparação com o FRET. Consequentemente, os ensaios BRET geralmente exibem sensibilidade aumentada, permitindo a medição da ativação da proteína G de GPCRs constitutivamente ativos. A sensibilidade aprimorada dos ensaios BRET facilita a detecção de interações biológicas sutis, o que é particularmente valioso em estudos farmacológicos onde a medição precisa da atividade do receptor é crucial.

Esses biossensores podem ser traduzidos em triagem de alto rendimento em placas de 96 ou 384 poços, como demonstrado recentemente por Scott-Dennis et al., onde um método usando esses biossensores foi desenvolvido em um ensaio de 384 poços baseado em membrana para analisar a atividade dos receptores canabinóides CB1R e CB2R12. Este artigo descreve o uso desses biossensores em placas de 96poços em células vivas, medindo a atividade do β2-AR como um GPCR prototípico de classe A, que se liga à proteína G s e ao CB1R que pertence aos GPCRs de classe A e ativa a proteína da família Gi / o . O uso de dois biossensores G-CASE é validado: Gs e Gi3 em células HEK 293T com o GPCR transitoriamente (com o β2-AR) ou expresso de forma estável (com o CB1R).

É importante ressaltar que esse experimento pode ser realizado em várias linhagens celulares, demonstrando a versatilidade e robustez dessa técnica em vários contextos celulares. Isso garante que o método possa ser aplicado a diversos modelos experimentais, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudar a sinalização GPCR em diferentes ambientes fisiológicos e farmacológicos. A Figura 1 ilustra o princípio dos sensores de atividade da proteína G baseados em BRET.

figure-introduction-1
Figura 1: Princípio dos sensores de atividade da proteína G baseados em BRET. Os sensores de proteína G consistem em três subunidades: Gα, Gβ nativo e Gγ. A subunidade Gα é fundida à pequena e brilhante NanoLuciferase (Nluc), enquanto a subunidade Gγ é marcada N-terminalmente com Vênus circularmente permutada (cpVenus173). Os genes que codificam essas subunidades da proteína G modificadas são combinados em um único plasmídeo. A ligação do ligante aos GPCRs induz alterações conformacionais do GPCR, promovendo o recrutamento da proteína G e subsequente dissociação seguida de hidrólise do GTP. Essa dissociação interrompe a transferência de energia entre os parceiros, resultando em uma diminuição no sinal BRET. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Semeadura de placas de poços (Dia 1)

NOTA: Siga todos os protocolos de cultura de células em uma capela de fluxo laminar estéril para manter as condições estéreis. Placas de poços brancos com fundos planos transparentes são usadas para acompanhar o crescimento e a viabilidade celular. Use a placa de poço branco completo para evitar o uso de um adesivo na etapa 3.2.1.

  1. Revestimento de placa de poço
    NOTA: Placas pré-revestidas podem ser usadas para ignorar esta etapa.
    1. Despeje em um reservatório multicanal cerca de 6 mL de solução estéril filtrada de poli-L-lisina (PLL) (0,01%). Com uma pipeta multicanal, encha cada poço de uma microplaca de 96 poços brancos com 60 μL de PLL.
    2. Coloque a microplaca em local escuro e incube por 20 min.
    3. Durante a incubação, proceder à preparação das células conforme descrito nos passos 1.2.1-1.2.3.
    4. Aspirar a solução de PLL com a pipeta multicanal e conservá-la a 4 °C num tubo de 15 ml.
    5. Lave a placa três vezes com DPBS para remover PLL livre que pode causar degradação celular.
  2. Preparação e revestimento celular
    1. Cultura de células HEK293 em meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C em 5% de CO2.
      NOTA: O FBS é adicionado ao meio de cultura para fornecer os nutrientes e fatores de crescimento necessários para a viabilidade celular adequada.
    2. Remova o meio e enxágue as células com 2 mL de DPBS.
    3. Adicione 0,5 mL de tripsina e incube por 3-5 min a 37 °C para separar as células.
    4. Adicione 4,5 mL de DMEM ao frasco para neutralizar a tripsina e, em seguida, pipete para cima e para baixo repetidamente para separar as células e ressuspendê-las.
    5. Transfira as células destacadas para um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 1000 x g (à temperatura ambiente, RT).
    6. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de DMEM.
    7. Conte as células com uma câmara de contagem de Malassez e prepare 9 mL a 300.000 células/mL. Coloque-os em um reservatório multicanal e semeie a microplaca de 96 poços despejando 100 μL por poço com a pipeta multicanal (densidade final de 30.000 células/poço).
    8. Incubar a microplaca à 37 °C, 5% CO2 durante aproximadamente 24 h.
      NOTA: As células devem atingir cerca de 70%-80% de confluência para uma transfecção eficiente.

2. Transfecção de plasmídeo (Dia 2)

NOTA: A transfecção celular pode ser realizada no primeiro dia em células suspensas antes do plaqueamento, durante a etapa 1.2.7 e aquisição de dados no dia 3.

  1. Dilua 10 μg do DNA dos plasmídeos desejados (por exemplo, 5 μg de receptor β2-adrenérgico e 5 μg de Gs (curto) -CASE em células HEK wt ou apenas 10 μg de Gi3-CASE em células HEK CB1) e 20 μL de lipofectamina nos tubos contendo 500 μL de meio Opti-MEM. Incubar em RT por 5 min.
    1. Para um controle negativo, substitua o receptor β2-adrenérgico por um plasmídeo vazio pcDNA 3.1 na mesma concentração. Combine as soluções em um tubo e misture para obter uma mistura de transfecção (1 mL).
  2. Incubar a mistura de transfecção em RT por 20 min.
  3. Adicione 10 μL de mistura de transfecção da etapa 2.2 gota a gota a cada poço e balance suavemente a placa para frente e para trás para garantir a mistura completa.
    NOTA: Uma concentração final de 100 ng de DNA por poço é obtida.
  4. Incubar a microplaca em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h.

3. Aquisição de dados (Dia 3)

  1. Preparação de ligantes
    NOTA: Tampão de solução salina balanceada de Hank (HBSS): NaCl 140 mM, cloreto de potássio 5 mM, cloreto de cálcio 1 mM, sulfato de magnésio heptahidratado 0.4 mM, cloreto de magnésio hexahidratado 0.5 mM, fosfato de sódio dibásico di-hidratado 0.3 mM, fosfato de potássio monobásico 0.4 mM, D-glicose (dextrose) 6 mM, bicarbonato de sódio 4 mM, pH 7.4, filtrado 0.22 μm.
    1. Preparar uma solução-mãe na concentração mais elevada possível no solvente de solubilização adequado para os diferentes ligantes (neste protocolo, prepara-se isoproterenol em H20 mQ e WIN-55.212-2 em DMSO).
      NOTA: A concentração da solução estoque do ligante precisa ser ajustada dependendo da solubilidade e da constante de dissociação conhecida (Kd) do ligante.
    2. A partir desta matéria-prima, preparar uma diluição em série do ligante que varie em torno do Kd do ligante, de 10 μL no solvente de solubilização adequado. Conservar esta diluição em série a -20 °C.
      NOTA: Dependendo do ligante, a faixa de diluição serial pode ser congelada e descongelada até dez vezes antes que ocorra a degradação. Preparar uma solução contendo apenas o solvente utilizado para a dissolução do ligante de modo a incluir um estado do veículo (neste protocolo, H20 ou DMSO).
    3. Para cada concentração de ligante e veículo, realizar uma diluição de 1/100 em HBSS adicionando 1,3 μL de cada concentração a um volume total de 130 μL. Isso resulta em uma concentração final de 1% de veículo no HBSS.
      NOTA: Esta faixa de diluição final é a usada para experimentos adicionando 10 μL para obter 100 μL de volume total por poço. Isso resulta em uma concentração final de 0,1% de veículo em todos os poços. O volume de 130 μL corresponde à quantidade necessária para preencher uma fileira de uma placa de 96 poços: (10 x 12) ± 10%. Cada linha corresponde a uma concentração de ligante diferente, com a última linha servindo como controle do veículo.
    4. Preparar 980 μL de Furimazina 1/100 diluição a partir de solução-mãe (9,8 μL em 970,2 μL de HBSS para obter um volume total de 980 μL).
      NOTA: Prepare uma solução fresca de furimazina e deixe incubar por pelo menos 3 min. Em seguida, adicione-o imediatamente antes da aquisição. Não deve ser preparado muito cedo, pois o sinal tem uma meia-vida de aproximadamente 120 min à temperatura ambiente. Para superar essa limitação, derivados de furimazina de ação prolongada, como vivazina e endurazina, podem ser usados. Esses substratos mantêm um sinal BRET estável por até 48 h.
  2. Leituras de placas
    NOTA: Use um leitor de placas multimodo. Ajustar a medição às condições estudadas e ao número de réplicas. Aqui, a aquisição de dados é dividida em três leituras de 4 colunas, o que corresponde a 32 poços. Todas as leituras são feitas com óptica superior com tampa transparente para evitar a evaporação do tampão. Antes de todas as leituras, ajuste o ganho de medição. Neste estudo, o ganho foi fixado em 3600. É possível evitar a adição manual de ligantes usando um sistema automatizado de injetores ou seringas, que está disponível em muitos leitores de placas.
    1. Remova o meio das primeiras 4 colunas da placa de 96 poços. Enxágue cada poço com 100 μL de HBSS e adicione 80 μL de HBSS. Cole um adesivo branco na parte inferior da placa. Isso melhora as medições de fluorescência e/ou bioluminescência.
    2. Registro de espectros de luminescência da proteína G: Insira a placa de 96 poços no leitor de placas. Registre a emissão de cpVenus173 usando um monocromador de 535/30 nm e meça a emissão de luminescência entre 500 e 600 nm com resolução de 2 nm.
      NOTA: Esta gravação é um controle para garantir que a fluorescência seja emitida após a excitação do cpVenus173 .
    3. Registo dos espectros de luminescência da proteína G: Registar a intensidade da emissão de Nluc utilizando um monocromador de 450/40 nm e medir a emissão de luminescência entre 400 nm e 600 nm com uma resolução de 5 nm.
      NOTA: Este registro é um controle para garantir que nenhuma bioluminescência seja emitida antes da adição do substrato Nluc, furimazina.
    4. Retirar a placa do leitor de placas e adicionar 10 μL da solução de furimazina previamente preparada (passo 3.1.4.) em cada alvéolo com a ajuda de uma pipeta multicanal.
    5. Repita a etapa 3.2.3.
      NOTA: Esta gravação é um controle para garantir que a bioluminescência seja emitida após a adição de furimazina. Prossiga diretamente com a etapa 3.2.6 após esta medição para evitar variação do sinal devido ao consumo e/ou degradação da furimazina. A variação do sinal BRET pode ocorrer devido ao consumo e/ou degradação da furimazina e processos regulatórios que ocorrem para encerrar a resposta induzida pela estimulação agonista. Para superar essa limitação, inibidores de GRK (CMPD101) e inibidores de internalização (dinamísoro) ou células editadas por genes desprovidas de GRKs ou arrestinas podem ser usados.
    6. Registro do BRET basal da proteína G: Antes de adicionar o ligante GPCRs, registre a intensidade de emissão de Nucle e cpVenus173 usando um monocromador de 450/40 nm e um monocromador de 535/30 nm, respectivamente. Meça 3 ciclos de 60 s com um intervalo de medição de 0,30 s (tempo total de leitura de 3 min).
      NOTA: Aumentar o tempo do intervalo de medição para 0,90 s geralmente melhora significativamente a relação sinal-ruído, mas resulta em um tempo de leitura muito mais longo. O experimentador deve decidir se a resolução temporal mais alta ou a relação sinal-ruído aprimorada é mais importante para sua aplicação.
    7. Retirar a placa do leitor de placas e adicionar 10 μL da gama de diluição previamente preparada do ligante GPCR (passo 3.1), respectivamente, em cada alvéolo de uma coluna com a ajuda de uma pipeta multicanal. Siga o mesmo procedimento para as outras 3 colunas.
    8. Registro de GREET induzido por ligante da proteína G: Registre a intensidade de emissão de Nluc e cpVenus173 usando um monocromador de 450/40 nm e um monocromador de 535/30 nm, respectivamente. Meça 16 ciclos de 60 s com um tempo de intervalo de medição de 0,30 s (tempo total de leitura de 16 min).
      NOTA: Configure os parâmetros de medição para medir os poços em colunas. As duplicatas são lidas com uma diferença de tempo de 2,4 s.
    9. Repita a etapa 3.2. para as próximas quatro colunas 2 vezes.

4. Análise dos dados

NOTA: Colete os dados de cada leitura em arquivos de planilha de dados separados.

  1. Leituras de controle
    1. Representar graficamente a intensidade de emissão em relação ao comprimento de onda.
  2. Leituras basais do BRET
    1. Para cada poço, calcule a razão BRET das três leituras. A razão BRET é definida como emissão de aceptores/doadores.
      figure-protocol-1
    2. Para cada poço, calcule a média das três razões BRET antes da adição do ligante. Este valor é chamado de razão BRET basal antes da estimulação do ligante: Razãobasal.
    3. Para normalizar as razões BRET anteriores de todos os poços, para cada uma das três medições, subtraia respectivamente o valor da razão BRET calculado a partir dos poços de controle do veículo da razão BRET no tempo de medição correspondente.
      NOTA: Os dados analisados correspondem aos pontos de tempo antes da adição do ligante. Como os poços nos quais o ligante é adicionado são conhecidos, os poços de controle do veículo podem ser identificados de acordo.
  3. Leituras de BRET induzidas por ligante da proteína G
    1. Para cada alvéoço, calcular o rácio BRET de cada leitura, conforme descrito no ponto 4.2.1. Esses valores são chamados deestímulo de proporção.
    2. Para quantificar as mudanças induzidas pelo ligante, calcule o ΔBRET para cadaestímulo de razão de cada poço como uma porcentagem sobre o basal. Para isso, use a razãobasal correspondente calculada anteriormente na seção 4.2.2.
      figure-protocol-2
    3. Calcule o ΔBRET(%) para normalizar os valores de ΔBRET de cada poço. Para isso, subtraia os respectivos valores de ΔBRET do veículo.
    4. Para visualizar a cinética ΔBRET em uma planilha de dados, adicione as três leituras basais de BRET normalizadas na etapa 4.2.3. antes dos valores ΔBRET(%) correspondentes, calculados para cada poço na secção 4.3.3.
    5. Plote os dados anteriores em relação ao tempo da leitura para obter um gráfico cinético.
    6. Quando um platô for atingido, pegue os valores de ΔBRET(%) em um momento escolhido e plote-os em relação à concentração do ligante usado, pois cada poço corresponde a uma concentração de ligante diferente. Obtém-se uma curva dose-resposta.
      NOTA: O platô geralmente é atingido cerca de 5 minutos após a estimulação do ligante. Neste protocolo, os valores obtidos após 15 min de estimulação do ligante são plotados. Para comparar dados de diferentes experimentos, ajuste o tempo dependendo da cinética de ativação.
    7. Plote os dados anteriores no software de análise e ajuste usando um ajuste sigmoidal de três parâmetros dose-resposta com base na seguinte equação:
      figure-protocol-3
      onde, X é a concentração do ligante usado, Y são os valores de ΔBRET(%), Top e Bottom representam os platôs e EC50 é a concentração de ligante necessária para atingir 50% do efeito máximo. Isso permite obter o Emax e EC50.
    8. Comparar os dados da condição de controlo utilizando um teste não paramétrico de Mann-Whitney. Os resultados são considerados significativos em p < 0,05.

figure-protocol-4
Figura 2: Principais etapas para a realização do ensaio BUD. Visão geral das três principais etapas experimentais descritas neste protocolo (semeadura celular, transfecção celular e aquisição de sinal BRET) e guia passo a passo detalhado para aquisição de dados. Configuração experimental: No dia 1, as células são semeadas em uma placa branca de 96 poços pré-revestida com PLL com um fundo plano e transparente a uma densidade de 30.000 células/poço. No dia 2, as células são transfectadas com o sensor de proteína G selecionado junto com os plasmídeos GPCR ou pcDNA3.1 estudados. Após 24 h de incubação, a atividade do sensor de proteína G é medida por meio de leituras de bioluminescência e fluorescência após a adição do ligante. Aquisição de dados: Após a lavagem das células com HBSS, 80 μL de HBSS são adicionados aos poços e a emissão de fluorescência cpVenus173 é medida entre 500 nm e 600 nm usando um monocromador de 535/30 nm (1). Em seguida, a bioluminescência de Nluc é medida entre 400 nm e 600 nm usando um monocromador de 450/40 nm, antes ( 2) e depois (3) da adição de furimazina. Finalmente, o sinal BRET para a atividade da proteína G basal e induzida por ligante é medido usando monocromadores de 450/40 nm e 535/30 nm, respectivamente, durante 3 min (3 ciclos de 60 s com um intervalo de medição de 0,30 s) (4) e 16 min (16 ciclos de 60 s com um intervalo de medição de 0,30 s) (5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Um esquema generalizado da configuração e execução experimental é detalhado na Figura 2. A ativação de proteínas da família Gs ou Gi/o após a ativação do ligante de dois GPCRs foi avaliada usando os biossensores G-CASE. Primeiro, um GPCR prototípico da família A foi estudado, o β2-AR transitoriamente transfectado em células HEK 293T. Quando um agonista (ou seja, isoproterenol) foi aplicado às células HEK wt que expressam o β2-AR junto c...

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Discussão

O presente protocolo descreve o uso de biossensores BRET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas em resposta à estimulação de GPCR com ligantes específicos. Ao usar o princípio de transferência de energia doador-aceitador bioluminescente, essa abordagem permite a detecção de alterações conformacionais e dissociação de proteínas G heterotriméricas após a ativação do receptor, fornecendo uma plataforma robusta e sensível para estudar a sinalização GPCR. Este p...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

As células HEK-CB1 foram um presente gentil de M. Guzman (Universidade Complutense, Madri, Espanha), e o plasmídeo do receptor β2-adrenérgico foi um presente gentil de D. Perrais (IINS, Instituto Interdisciplinar de Neurociência, Bordeaux, França). Gi3-CASE e Gs(short)-CASE foi um presente de Gunnar Schulte (plasmídeo Addgene # 168122; Plasmídeo Addgene # 168124). Algumas das ilustrações foram criadas usando BioRender.com. Este trabalho é apoiado pelo Ministério do Ensino Superior e da Pesquisa e financiamento da agência nacional de pesquisa francesa (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019), AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647) e SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa avançada de cultura de 96 poços, branca com fundo plano transparente, com tampa, Greiner bio-oneDutscher655983
Filme Branco BrightMax ClearLineDutscher760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
Dimetil sulfóxido (DMSO)SigmaD4540
DPBS Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, líquido, filtrado por estéril, adequado para célulasSigma D8537
Dulbecco' s modificado Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAXSigmaD0822Quente em 37 graus e graus; Banho-maria C antes do uso
Soro fetal bovino (FBS)Sigma F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-VênusAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Presente de Gunnar Schulte
Galphas (isóforma curta)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-VênusAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Presente de Gunnar Schulte
HEK-293T expressando CB1R de forma estável (HEK CB1)Gentil presente de M. Guzman (Universidade Complutense, Madri, Espanha)
HEK-293T tipo selvagem (HEK wt)
IsoproterenolSigmaI6504Solubilizado em H20 e armazenado em – 20 & deg; C
Lipofectamina 2000Invitrogen 11668019
Opti-MEM I Soro Reduzido Suplemento Médio GlutaMAXFischer11564506
pcDNA3 Flag etiqueta beta-2-receptor adrenérgico FLAG C-terGeneroso presente de D. Perrais (IINS, Bordeaux)
pcDNA3.1-(vazio)-TAGAddgene138209
Penicilina/estreptomicinaSigma P4333
Solução de poli-L-lisina (PLL)SigmaRNBL7086
Tripsina-EDTA Sigma T3924
VITÓRIA - 55.212-2Cayman Chemicals10009023Solubilizado em DMSO e armazenado em – 20 & deg; C

Referências

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Zhang, M., et al. G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).
  3. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. protein pathways. Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).
  5. Hepler, J. R., Gilman, A. G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).
  6. Van Unen, J., et al. A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells. PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).
  7. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  8. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2411 (2001).
  9. Galés, C., et al. Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes. Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).
  10. Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors. Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).
  11. Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors. Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).
  12. Scott-Dennis, M., et al. Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors. Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).
  13. Violin, J. D., et al. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics. J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).
  14. Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics. Life Sci. 38, 309-315 (1985).
  15. Thomas, B. F., et al. Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists. J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).
  16. Schihada, H., et al. Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias. J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).

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Errata


Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68463

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Atividade de GPCREnsaio BRETImagem de C lulas VivasAtiva o de Prote na GSinaliza o Enviesada de LigantesPlaca de 96 Po osC lulas HEK293TReceptor Beta2 Adren rgicoReceptor Canabinoide CB1
Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas
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