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Ensaio cometa para quantificar danos ao DNA em células 32D que expressam mutantes FLT3 após exposição a inibidores de FLT3 tipo I e tipo II

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DOI:

10.3791/68469

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17 de outubro de 2025

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1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método eficaz para quantificar a diferença no dano ao DNA induzido por inibidores do tipo I e tipo II em células mutantes FLT3 por meio da aplicação do ensaio cometa.

Resumo

A tirosina quinase 3 semelhante à FMS (FLT3), uma tirosina quinase do receptor de classe III, exibe uma frequência de mutação de aproximadamente 30% em pacientes com leucemia mieloide aguda (LMA) e constitui um alvo terapêutico crítico. Como inibidores representativos de FLT3 tipo I e tipo II, respectivamente, gilteritinibe e quizartinibe (AC220) são clinicamente empregados no tratamento da LMA mutante FLT3.

O gilteritinibe inibe as proteínas FLT3 ativadas e inativadas, com inibição adicional dos alvos AXL para ajudar a superar a resistência. O AC220 inibe o FLT3 ativado. O ensaio cometa foi sistematicamente empregado para quantificar e comparar padrões de danos ao DNA induzidos por inibidores de FLT3 tipo I versus tipo II em células mutantes. Os resultados experimentais revelaram que o dano ao DNA causado pelo AC220 foi significativamente maior do que o causado pelo Gilteritinibe. Para fortes danos ao DNA, os inibidores de FLT3 podem ser combinados com inibidores de reparo de danos ao DNA para atingir defeitos de reparo de DNA. Os resultados fornecem suporte experimental para a estratégia de combinação racional de drogas direcionadas a danos no DNA.

Introdução

A leucemia mieloide aguda (LMA) representa um distúrbio clonal de células-tronco hematopoiéticas definido pela expansão patológica de progenitores mieloides indiferenciados, resultando em supressão hematopoiética e falência da medula óssea. A heterogeneidade molecular inerente da LMA apresenta desafios terapêuticos significativos1. De particular significado clínico, as mutações da tirosina quinase 3 (FLT3) semelhantes à SFM constituem uma das alterações genéticas mais prevalentes na LMA, ocorrendo em aproximadamente 30% dos casos, e demonstram uma forte correlação com resultados clínicos adversos2. A tirosina quinase do receptor FLT3 sofre ativação na membrana plasmática para mediar as cascatas de sinalização PI3K / AKT e RAS / MAPK, enquanto a variante mutante FLT3-ITD é retida no retículo endoplasmático, induzindo a fosforilação persistente do Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 5 (STAT5). Essas alterações genéticas conduzem a leucemogênese por meio de múltiplos mecanismos oncogênicos, principalmente por meio da desregulação da transdução de sinal, sinalização proliferativa descontrolada e resistência apoptótica3.

AC220 e gilteritinibe, como inibidores típicos de FLT3, inibem a proliferação celular e induzem a apoptose suprimindo a expressão de FLT3, mas com diferentes mecanismos de ação. O gilteritinibe (um inibidor do tipo I) não apenas cobre um espectro mais amplo de mutações ativadoras de FLT3, mas também inibe a tirosina quinase AXL, que está intimamente relacionada ao FLT3. Por meio da inibição dupla, o gilteritinibe pode bloquear o crescimento de células cancerígenas de forma mais abrangente4. O AC220 (um inibidor do tipo II) exerce seu efeito inibitório por meio da ligação competitiva à conformação da quinase ativada, visando especificamente a bolsa de ligação ao ATP com alta especificidade5. Essa inibição pode levar à parada do ciclo celular e ao aumento do estresse de replicação do DNA.

O gilteritinibe está associado a um baixo risco de resistência e é indicado para monoterapia na LMA com mutação FLT3 recidivante/refratária. O AC220 é eficaz e seletivo para mutações FLT3-ITD, com boas taxas de resposta clínica, mas é ineficaz para mutações FLT3-TKD e pode ser resistente a mutações FLT3-TKD devido a mutações secundárias de FLT3-TKD (por exemplo, D835 ou F691L) ao desenvolvimento de resistência. Esses inibidores ganharam destaque na terapêutica da LMA com base na eficácia clínica demonstrada e na melhora dos índices terapêuticos6. No entanto, o uso clínico dessas drogas é desafiado pela resistência adquirida e pelos efeitos fora do alvo. O uso prolongado de AC220 na clínica leva à resistência devido a mutações FLT3-TKD, enquanto o uso prolongado de gilteritinibe pode ter limitações para mutações compostas (por exemplo, FLT3-ITD combinado com TKD), mesmo que não resulte em resistência devido a mutações FLT3-TKD 7,8.

Essas duas classes de inibidores de FLT3 exercem um efeito terapêutico duplo, induzindo indiretamente o estresse replicativo por meio da inibição de FLT3 e bloqueio da via de sinalização proliferativa-RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, sinalização STAT5. O bloqueio da proliferação celular geralmente leva à parada do ciclo celular, distúrbios metabólicos (desregulação da homeostase redox) e, finalmente, à apoptose 9,10. Esse mecanismo, em última análise, gera lesões de DNA que ativam adaptações compensatórias de reparo de DNA em populações de células resistentes. O ensaio do cometa permite a comparação quantitativa de perfis de danos ao DNA específicos do inibidor em células mutantes FLT3. Essa abordagem experimental fornece insights críticos para o desenvolvimento de terapias combinadas racionais que exploram vulnerabilidades a danos no DNA, superando assim a resistência terapêutica adquirida.

As metodologias contemporâneas para detecção de danos ao DNA abrangem análise imuno-histoquímica, eletroforese em gel de agarose de fragmentos de DNA, reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de nova geração (NGS), cada um demonstrando alta sensibilidade e especificidade analítica11. No entanto, essas abordagens são limitadas por requisitos financeiros substanciais, durações de processamento prolongadas e condições experimentais rigorosas. Isso ressalta o imperativo de adotar estratégias de detecção que equilibrem a precisão analítica com a simplicidade operacional.

O ensaio cometa tem sido amplamente utilizado na avaliação de toxicologia ambiental e genotoxicidade devido à sua sensibilidade superior, acessibilidade técnica, quantificação visualizada de danos ao DNA e ampla aplicabilidade em sistemas biológicos12,13. Três variantes metodológicas principais foram estabelecidas: ensaio de cometa alcalino para detecção de quebra de fita simples/dupla, ensaio de cometa neutro para análise de quebra de fita dupla e ensaio de cometa modificado por enzima para identificação de lesão de DNA específica. 14

O princípio metodológico envolve: (1) Indução de quebras de fita de DNA por meio de tratamento experimental; (2) Dissolução mediada por tampão de lise de membranas celulares e nucleares, permitindo a difusão de proteínas citoplasmáticas/nucleares e RNA em tampão de eletroforese, enquanto o DNA de alto peso molecular permanece imobilizado na matriz de agarose; (3) Desnaturação alcalina (pH > 13) induzindo desenrolamento de DNA e liberação de fragmentos de DNA danificados; (4) Migração anódica eletroforética conduzida por campo de DNA fragmentado criando morfologia característica do cometa, com DNA intacto retendo estrutura nucleóide esférica15,16. A quantificação de danos ao DNA é obtida por meio da análise computadorizada da porcentagem de DNA da cauda (TDP), fornecendo medição precisa do impacto genotóxico na resolução de uma única célula17.

Esta investigação empregou uma estrutura experimental sistemática para comparar os efeitos genotóxicos diferenciais do gilteritinibe e do AC220 em células 32D mutantes FLT3 validadas. O desenho experimental compreendeu dois componentes principais: (i) estabelecimento de um modelo de dano ao DNA específico da mutação FLT3 e (ii) avaliação quantitativa do dano ao DNA induzido por drogas por meio da metodologia de ensaio de cometa alcalino. A linhagem celular 32D mutante FLT3 foi mantida sob condições in vitro padrão antes da exposição a inibidores de FLT3 diluídos em série. A viabilidade celular foi avaliada por meio de ensaios CCK-8, com posterior cálculo dos valores de concentração inibitória semimáxima (IC50) por meio de análise de regressão não linear. Um valor de IC50 quíntuplo foi escolhido como limiar de indução de danos ao DNA. As células tratadas com drogas foram colhidas e incluídas em agarose de baixo ponto de fusão em lâminas para análise subsequente. A separação eletroforética foi realizada a 24 V (~ 0,74 V / cm) e 300 mA por 30 min em tampão alcalino, durante o qual o DNA fragmentado migrou anodicamente para formar a morfologia característica do cometa, enquanto o DNA intacto reteve a configuração nucleóide esférica. A quantificação de danos ao DNA foi obtida por meio de análise de imagem computadorizada do projeto de software de ensaio cometa (CASP) medindo o momento da cauda, com valores aumentados do momento da cauda da azeitona correlacionando-se diretamente com a extensão da fragmentação do DNA.

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Protocolo

1. Construção de um modelo de dano ao DNA em células 32D com mutações FLT3-ITD 18

  1. Recuperação celular
    1. Usando fórceps, transfira rapidamente células 32D mutantes FLT3-ITD criopreservadas (armazenadas a -80 ° C). Recupere criogeniais usando fórceps e mergulhe-os imediatamente em banho-maria com temperatura regulada (37 °C ± 0,5 °C) por precisamente 60 s para completar o descongelamento controlado.
      NOTA: Durante o descongelamento, agite intermitentemente os criotubos no banho-maria para garantir um aquecimento uniforme.
    2. Centrifugar as amostras criopreservadas a 150 × g durante 5 min a 25 °C ± 1 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante usando pipetas sorológicas estéreis, retendo o pellet celular.
    3. Adicione 1 mL de meio de crescimento completo (RPMI 1640 + 10% de soro fetal bovino + 1% de penicilina/estreptomicina) ao tubo de criopreservação. Realize uma trituração suave através de 10 ciclos de pipetagem sequenciais (volume de 1 mL) para garantir a ressuspensão completa. Transferir a suspensão celular para uma placa de cultura de células de 100 mm e adicionar 7 ml de meio completo para obter um volume final de 8 ml.
    4. Agite suavemente o vaso de cultura com cinco movimentos horizontais e cinco rotacionais. Mantenha as células em uma incubadora umidificada a 37,0 °C ± 0,2 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade. Incubar durante 24 H antes do processamento experimental.
  2. Avaliação da viabilidade celular
    1. Selecione células 32D mutantes FLT3-ITD na fase de crescimento logarítmico com bom estado celular para o experimento.
      NOTA: As células na fase de crescimento logarítmico geralmente têm um ciclo de divisão curto e uma alta frequência de divisão celular.
      1. Observe a morfologia e o estado de crescimento das células 32D com mutação FLT3-ITD usando um microscópio eletrônico. Certifique-se de que os critérios para limiares de proliferação celular sejam atendidos: Procure células que estejam na forma de um único glóbulo com bordas lisas, dispersão uniforme, poucos agregados, tamanho de célula uniforme, integridade da membrana plasmática intacta e detritos celulares < 5%.
    2. Use um contador de células para determinar a concentração da suspensão celular.
      NOTA: Misture as suspensões celulares (10 ciclos de pipetagem sequenciais usando pontas estéreis de 1 mL a 50% da velocidade máxima da pipeta).
    3. Padronize a suspensão celular para 2,0 × 105 células/mL em meio de crescimento completo usando diluição iterativa. Usando uma pipeta, dispense alíquotas de 50 μL nos poços centrais (B2-G7) de uma placa de fundo plano de 96 poços. Encha os poços periféricos (A1-H12) com 100 μL de PBS estéril para manter a umidade e minimizar os efeitos de evaporação da borda.
    4. Preparação do meio contendo inibidor de FLT3: Selecione nove poços em uma placa de cultura de células de 12 poços e rotule-os de acordo com a escada de concentração do inibidor de FLT3 (0, 3.90625, 7.8125, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 e 1000 nM). Adicione 400 μL de meio completo aos poços rotulados como 10,0 μM e 200 μL de meio completo aos poços restantes.
      1. Diluição de gilteritinibe: Adicione 4 μL de reagente de gilteritinibe 100 μM (Gilteritinibe em Dimetilsulfóxido) a cada um dos poços marcados a 1000 nM usando uma pistola de pipeta e misture bem a solução. Pipetar 200 μL de Gilteritinibe 1000 nM nos poços marcados com 500 nM e misturar; em seguida, pipetar 200 μL de Gilteritinibe 500 nM nos poços marcados com 250 nM e misturar. A cada vez, leve 200 μL da diluição anterior para o próximo poço e misture para atingir a concentração desejada.
      2. Diluição AC220: Adicione 4 μL de reagente AC220 100 μM (AC220 em dimetilsulfóxido) a cada um dos poços marcados a 1000 nM usando uma pipeta. Siga a etapa 1.2.4.1 para os outros poços.
        NOTA: Certifique-se de que a solução estoque do inibidor FLT3 na pipeta seja completamente transferida para os poços para evitar solução residual. Certifique-se de que a solução esteja bem misturada antes de prosseguir com a diluição.
    5. Incubação: Dispense meios contendo inibidores de FLT3 em poços designados (50 μL / poço) usando uma pipeta. Mantenha a placa de 96 poços em condições fisiológicas de cultura (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% CO2, 95% de umidade) por precisamente 72 H ± 15 min.
    6. Alíquota de 10 μL de reagente CCK-8 para todos os poços de controle experimentais e em branco usando uma pipeta. Proteger a placa da luz e incubá-la em condições normóxicas (37 °C, 5% CO2) durante 2,0 H ± 10 min.
      NOTA: Dispense o reagente em baixa velocidade de pipeta com uma profundidade de imersão da ponta de 2 mm para minimizar a formação de bolhas. Evite bolhas de ar durante a adição da amostra para evitar interferência nas leituras de OD.
    7. Remova a placa de 96 poços da incubadora e meça a absorbância a 450 nm usando um leitor de microplacas. Registre os resultados.
    8. Calcular a % de inibição de acordo com a fórmula de cálculo do IC50 :
      Inibição (%) = figure-protocol-1 × 100%
      O poço experimental da droga denota poços celulares tratados com a droga. O poço de controle celular denota poços celulares que não foram tratados com o medicamento. Os poços de controle em branco indicam apenas o meio sem células.
    9. Analise os dados de dose-resposta normalizados por meio de regressão não linear, empregando um modelo logístico de quatro parâmetros. Clique no botão Curva de ajuste para ajustar a curva. Derive a concentração inibitória semimáxima (IC50) da convergência do modelo (R2 > 0,98, soma residual dos quadrados < 0,15) e calcule os intervalos de confiança de 95% por meio da reamostragem de bootstrap de 1000 iterações.
  3. Experimento de dano ao DNA de células 32D com mutação FLT3-ITD induzida por inibidor de FLT3
    1. Selecione células 32D mutantes FLT3-ITD exibindo surto de crescimento (tempo de duplicação da população < 24 h) para avaliação de danos ao DNA.
    2. Conte as células (consulte a etapa 1.2.2 para obter detalhes).
    3. Semeadura celular: Ajuste a densidade da suspensão celular para 1 × 106 células por placa, usando uma placa de 6 cm de diâmetro e 4 mL de suspensão celular por placa.
    4. Prepare três réplicas para cada concentração de inibidor: 55 nM gilteritinibe: 4 mL de meio + 2,2 μL de estoque de 100 μM, 0,15 nM AC220: 4 mL de meio + 6 μL de estoque de 100 nM. Misturar as soluções em vórtice e equilibrá-las a 37 °C durante 15 min; agite suavemente os tubos para garantir uma mistura adequada. Aspirar o meio original e substituí-lo por 4 ml/prato de meio contendo inibidores recentemente preparado, utilizando pipetas serológicas estéreis.
    5. Incubar as células tratadas em condições fisiológicas (37 °C, 5% CO2, 95% de umidade) por intervalos definidos (0, 2, 4, 6 H). Processe controles de tempo zero imediatamente para avaliação de danos ao DNA na linha de base.
    6. Ensaio de exclusão de azul de tripano
      1. Centrifugue as células coletadas a 150 × g por 1 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células com 1 ml de meio de cultura.
      2. Pipete 100 μL de células ressuspensas em um tubo de centrífuga de plástico, adicione 100 μL de mancha azul de tripano (2x), misture delicadamente e cove por 3 min.
      3. Conte as células (consulte a etapa 1.2.2 para obter detalhes).
      4. Calcule a viabilidade celular da seguinte forma:
        % de sobrevivência celular = figure-protocol-2 × 100%
        NOTA: Apenas amostras com viabilidade ≥90% foram processadas para o ensaio cometa.

2. Preparação de reagentes e preparação de amostras de células

  1. Equilibre a solução de lise (contendo 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1% de Triton X-100, 10% de DMSO) a 4 ° C ± 0,5 ° C por 30 min usando uma geladeira.
  2. Derreta a agarose de baixo ponto de fusão (LMA) a 95 °C por 15 min e mantenha-a em banho-maria a 37 °C para evitar a solidificação.
  3. Preparar o tampão de electroforese alcalina (300 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, pH >13) pesando 12 g de NaOH utilizando uma balança electrónica, pipetando 2 ml de solução de EDTA a 500 mM e, em seguida, adicionando ddH2O para perfazer até 1 L do tampão.
  4. Colheita de células
    1. Recolha a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min. Aspirar os sobrenadantes por filtração a vácuo.
      1. Ressuspenda suavemente as células em 1 mL de meio completo usando pontas de pipeta de 1 mL de diâmetro largo, seguidas por 10 inversões verticais.
      2. Conte as células como na etapa 1.2.
      3. Centrifugue a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mL a 150 × g por 5 min para remover o meio completo. Ressuspenda as células lavadas em PBS livre de cálcio para ~ 5,0 × 105 células / mL.

3. Procedimento de ensaio cometa

  1. Prepare lâminas de ensaio de cometa e amostras de células com antecedência. Prepare uma mistura 10:1 (v/v) de agarose LMA e suspensão celular (5 × 105 células/mL) em tubos de 1,5 mL usando uma pipeta e misture delicadamente. Dispensar alíquotas de 55 μL da mistura de células de agarose nas lâminas de cometa utilizando uma pipeta mantida num ângulo de 45°, mantendo uma distância de 2 mm da superfície da lâmina. Colocar as lâminas revestidas com a mistura a 4 °C durante 30 min para evitar a luz.
    NOTA: Durante a adição do LMA e da mistura de células às lâminas de ensaio cometa, dispense a suspensão lenta e uniformemente para evitar a formação de bolhas e garantir uma distribuição homogênea do gel.
  2. Mergulhe as lâminas solidificadas em solução de lise pré-resfriada (contendo 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1% de Triton X-100, 10% de DMSO) e realize a lise por ≥1 H a 4 °C em condições de proteção contra luz.
  3. Após a lise, remova a lâmina do lisado e use uma pistola de pipeta para sugar o máximo de líquido possível ao redor da pá. Em seguida, colocar a lâmina em tampão de eletroforese alcalina (300 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, pH >13) e pré-equilibrar durante 1 h a 4 °C, tendo o cuidado de evitar a luz.
  4. Eletroforese: Posicione as lâminas em uma câmara de eletroforese e adicione solução de eletroforese alcalina suficiente para imergir as lâminas. Realize eletroforese a 24 V (equivalente a 0,74 V / cm) com corrente constante (300 mA) por 30 min usando tampão pré-equilibrado (4 ° C) para minimizar os danos ao DNA.
  5. Neutralização: Após a eletroforese, use uma pistola de pipeta para aspirar a solução de eletroforese alcalina da lâmina, mergulhe as lâminas por 2 x 5 min em dH2O e, em seguida, mergulhe-as em etanol a 70% por 5 min. Secar as lâminas numa incubadora a 37 °C durante 15 min.
  6. Coloração: Aplique uma alíquota de 100 μL de 1x coloração de ácido nucleico YeaRed por poço e incube por 30 min em temperatura ambiente sob condições protegidas contra a luz. Remova o excesso de mancha com enxágue aquoso suave seguido de secagem térmica a 37 °C.
  7. Imagem: Realize a visualização de fluorescência usando um microscópio de fluorescência equipado com uma objetiva 4x, com aquisição de imagem digital realizada sob condições de exposição padronizadas.

4. Processamento de dados

  1. Realize análises quantitativas de imagens para determinar os parâmetros padrão do cometa, incluindo DNA da cauda (%), momento da cauda da azeitona e comprimento da cauda (μm).
    1. Abra a interface do software (Figura 5).
    2. Importe uma imagem para o software, clique em Ficheiro e, em seguida, clique em Selecionar Ficheiro para importar a imagem que pretende analisar para o software. Em seguida, mantenha pressionado o botão do mouse e arraste até que uma caixa azul apareça. Arraste a caixa azul para garantir que a célula que você deseja analisar esteja dentro da caixa. A opção Ajustar na figura pode ser usada para ajustar a posição do quadro para incluir a célula inteira (Figura 5).
    3. Antes de iniciar a análise, clique em Iniciar e, em seguida, clique em Analisar. Os resultados da análise de célula única serão exibidos no lado direito em 'Perfis'. Depois de analisar cada célula, clique em Salvar. Os parâmetros que podem ser detectados são exibidos no lado direito de 'Perfis' e os valores numéricos de vários parâmetros são exibidos na parte inferior. Por fim, clique em Arquivo | Exportar resultados. Os resultados obtidos incluem HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment e OliveTailMoment.

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Resultados

O ensaio cometa foi sistematicamente empregado para quantificar perfis diferenciais de danos ao DNA induzidos por gilteritinibe e AC220 em linhagens celulares mutantes FLT3. As análises mostraram que a diferença no dano ao DNA entre as populações de células não tratadas com gilteritinibe e AC220 não foi estatisticamente significativa (P > 0,05). Os aumentos dependentes da dose nos valores de DNA da cauda (%) e cauda do momento da azeitona (OMT) alcançaram significância estatística (P < 0,05) após exposições de 2-6 ...

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Discussão

O ensaio cometa representa um avanço significativo nas metodologias de avaliação de genotoxicidade. Essa técnica oferece vantagens distintas sobre as abordagens convencionais por meio de sua acessibilidade técnica, resolução de célula única e visualização direta de padrões de dano por meio de perfis de migração eletroforética. No desenvolvimento terapêutico da LMA, o ensaio cometa permite a avaliação sistemática dos perfis genotóxicos dos agentes candidatos durante as fases de validação ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Equipe de Pesquisa Inovadora para Ciência e Tecnologia da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu (2021), o Programa do Centro de Pesquisa de Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023), o Programa Provincial de Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde de Zhejiang (2025KY1861), a Fundação Chave de Ciências Naturais das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (Concessão nº 24KJA310008), os Programas da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (Concessão nº. SZWZYTD202201, szwzy202406) e Projeto do Laboratório Estadual de Medicina e Proteção contra Radiação, Universidade de Soochow (GZK12023013).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTABeyotimeST066
1x coloração de ácido nucleico YeaRedYeasen10202ES
CÉLULA 32DCobioerCBP60995
AC220TargetMolT2066
Kit de contagem de células-8DojindoCK04
Placa de contagem de célulasQiuJingXB-K-25
Incubadora CO2Thermo51032872
Projeto de software de ensaio cometa (CASP)
Kit de ensaio CometAssayTrevigen4250-050-K
Citação 5BioTek16280004
FBSPANELAST30-3302
GilteritinibeTargetMolT4409
GraphPad Prism 9.0
centrífuga de alta velocidadeThermo  9AQ2861
Pipetas L-1000XLS+Rainin17014382
Pipetas L-20XLS+Rainin17014392
tanque de nitrogênio líquidoMvecryogeYDS-175-216
Fotômetro de microplacas Multiskan FCThermo1410101
Na2OHDADÃO1588
PBSSolarbioPág. 1020
Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100xBeyotimeC0222
RPMI 1640 médioGibcoC22400500BT
Microscópio trinocular de células vivasMotico1.1001E+12
Congelador de temperatura ultrabaixaCabeloV118574

Referências

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