Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Summary

Esse protocolo introduz uma metodologia de triagem fluorométrica otimizada para identificar inibidores naturais de produtos e pequenas moléculas na síntese de proteínas. Sua praticidade o torna adequado tanto para o ensino de graduação em técnicas de descoberta de fármacos quanto para a implementação em campanhas de química medicinal.

Abstract

Produtos naturais representam uma rica fonte de compostos terapêuticos com aplicações em múltiplas doenças, especialmente câncer. Ao utilizar essas biomoléculas como modelos estruturais na descoberta de medicamentos, os pesquisadores alcançaram tanto prazos de desenvolvimento mais rápidos quanto eficácia biológica aprimorada em comparação com compostos totalmente sintéticos. A via de síntese proteica emergiu como um alvo atraente para produtos naturais, especialmente devido ao seu envolvimento em cânceres difíceis de tratar. O potente inibidor de síntese proteica cicloheximida, derivado de Streptomyces griseus, exemplifica o potencial de compostos naturais nesse espaço. À medida que esses derivados naturais de produtos são desenvolvidos em moléculas semelhantes a medicamentos, confirmar sua atividade inibitória de síntese proteica continua sendo uma etapa crucial de validação. O objetivo principal é fornecer um protocolo amigável para graduandos para avaliação rápida da atividade de inibição do composto. O protocolo emprega um substrato fluorescente e técnicas avançadas de microscopia de fluorescência para detectar e medir sistematicamente as capacidades inibitórias desses produtos naturais. O estudo examinou compostos derivados de duas espécies de plantas: Pinus sylvestris e Psoralea corylifolia. Usando cicloheximida como inibidor de referência, ambos os produtos naturais apresentaram níveis variados de inibição da síntese proteica.

Introduction

A síntese de proteínas envolve processos altamente regulados: transcrição e tradução. Durante a transcrição, sequências de DNA dos genes são copiadas, produzindo RNA mensageiro (mRNA). A enzima RNA polimerase trabalha para separar a dupla hélice do DNA e usa uma fita como guia para construir uma molécula de mRNA correspondente. Uma vez que o mRNA está totalmente formado, ele viaja do núcleo até o citoplasma para tradução. A translação ocorre no ribossomo, onde o mRNA é usado como molde para montar aminoácidos em uma cadeia polipeptídica. Essa cadeia polipeptídica, ao sair do túnel de saída do ribossomo, é dobrada em uma proteína funcional. A transcrição é regulada principalmente por fatores de transcrição, modificações da cromatina e RNAs reguladores, enquanto a tradução é regulada por fatores de iniciação, vias de sinalização e mecanismos de estabilidade do RNA. Esses sistemas reguladores permitem que as células mantenham as funções celulares e respondam efetivamente ao estresse ou^{danos 1}.

A grande maioria dos cânceres humanos — aproximadamente 85% — se manifesta como tumores^{sólidos 2}. Embora esses tumores possam variar dramaticamente em suas características e comportamentos específicos, tendem a compartilhar certos traços fisiológicos e padrões comuns, como síntese proteica aumentada independentemente de sua etiologia ou posição^{anatômica 3}. As células cancerígenas desregulam a síntese de proteínas ao sequestrar a maquinaria translacional para sustentar suas altas demandas energéticas e crescimento descontrolado. Essa reprogramação é resultado da desregulação de quase todas as principais vias de sinalização oncogênica, promovendo a sobrevivência, proliferação e metástase celular, enquanto suprime as vias de morte celular⁴. Nas células tumorais, a maquinaria para fabricar ribossomos entra em sobrecarga, permitindo aumentar a produção de proteínas e acelerar a divisão celular. Como essa síntese aprimorada de proteínas é crucial para a sobrevivência ao câncer, tratamentos que visam e bloqueiam esse processo mostram potencial como terapias^{potenciais 5}. Portanto, pesquisas focadas em fatores de tradução específicos do câncer, composições ribossomômicas únicas ou vias de sinalização alteradas que regulam a síntese proteica podem gerar inibidores mais direcionados com janelas terapêuticas melhoradas.

Como os produtos naturais (NPs) são conhecidos por sua ampla variedade de atividades biológicas, o desenvolvimento de inibidores seletivos de síntese proteica para tratamento do câncer usando seus andaimes é uma abordagem^{promissora 6,7}. Os NPs podem atingir diferentes componentes da maquinaria de síntese proteica, desde a ligação de ribossomos até a interferência em fatores de iniciação ou processos de elongamento, tornando-os pontos de partida inestimáveis no desenvolvimento de medicamentos para inibidores de síntese de proteínas em tumores^{sólidos 6}. A capacidade de rastrear rapidamente compostos para a atividade desejada serve como um ponto de entrada crucial para plataformas de descoberta de medicamentos que buscam identificar de forma eficiente os acertos NP. Normalmente, a triagem de alto rendimento de compostos utiliza ensaios de fluorescência para restringir rapidamente as moléculas candidatas^{a chumbo 8}.

Cientistas ao redor do mundo dependem de técnicas baseadas em fluorescência como ferramentas essenciais para analisar sistemas biológicos. Essas abordagens são amplamente utilizadas para estudar processos celulares, permitindo que pesquisadores acompanhem interações biomoleculares em tempo^{real 9}. Quando combinados com reações bioortogonais de química de cliques, esses métodos podem permitir a visualização precisa da síntese de^{proteínas 10}. O ensaio de síntese de proteína fluorescente apresentado é uma técnica não radioativa para avaliar a síntese de proteínas que utiliza O-propargil-puromicina (OPP), um análogo de puromicina permeável às células contendo alquino. Após o tratamento celular, a OPP é incorporada no C-terminal das cadeias polipeptídicas alongadas, causando a terminação da translação. Essas proteínas truncadas marcadas com alquínios são então detectadas usando química de clique catalisada por cobre, acoplada a 5 FAM-azida.

Esse ensaio fluorométrico é uma ferramenta valiosa de pesquisa e um método acessível de biologia química para treinar estudantes de graduação. Ao fornecer um protocolo acessível e eficiente, com processamento mínimo de dados, proporciona aos estudantes experiência prática em técnicas modernas de descoberta de medicamentos e acelera o processo de descoberta de medicamentos. À medida que a demanda por novos inibidores de síntese de proteínas cresce, essa abordagem oferece aos graduandos oportunidades significativas de pesquisa, ao mesmo tempo em que contribui para avanços em terapias contra o câncer.

Protocol

1. Preparação de reagentes a partir do kit

NOTA: Misture adequadamente, centrifuge e mantenha todos os reagentes no gelo até o uso.

1. Organize e obtenha o kit de inibição de síntese proteica, o tampão PBS, o meio de cultura celular, as placas tratadas com cultura celular, tubos centrífugas cônicos estéreis de polipropileno de 15 mL, tubos centrífugas de 2 mL, pipetas p10, p20, p200 e p1000, e pontas apropriadas.
2. Prepare o buffer de lavagem.
   1. Descongele o buffer de lavagem 10x a 37 °C prendendo o frasco na mão. Use o calor corporal das mãos para descongelar e verifique frequentemente se o descongelamento está completo.
   2. Dilua o estoque de buffer de lavagem 10x 1:10 em água desionizada em um tubo de centrífuga. Misture por inversão ou resuspensão, pipetando para cima e para baixo. Guarde no gelo até o uso.
3. Descongelar a solução fixadora em temperatura ambiente. Guarde no gelo até o uso.
4. Prepare o buffer de permeabilização.
   1. Descongele o buffer de permeabilização 10x a 37 °C envolvendo o frasco com a mão. Use o calor corporal das mãos para descongelar e verifique frequentemente se o descongelamento está completo.
   2. Dilua o estoque 10x 1:10 em água desionizada em um tubo de centrífuga. Misture os componentes por inversão ou ressuspensão, pipetando para cima e para baixo. Guarde no gelo até o uso.
5. Descongelar 400x marcador proteico, 100x azida fluorescente, 100x cicloheximida, coloração de DNA e o agente redutor 20x em temperatura ambiente. Mantenha no gelo em um ambiente escuro enquanto estiver em uso. Cubra os corantes com papel alumínio ou mantenha-os em uma geladeira de 2 °C quando não estiverem em uso.

2. Marcagem de controles e células experimentais

NOTA: Este protocolo foi desenvolvido usando células MDA-MB-231 de câncer de mama epitelial aderentes estáveis. Qualquer linha celular aderente pode ser utilizada. Todas as etapas listadas abaixo utilizam uma placa de 96 poços, e todos os volumes e concentrações são calculados para dois compostos de teste e dois controles com volume de trabalho de 100 μL.

1. Cultivo de células aderentes de mamíferos
   NOTA: As células devem ser eliminadas antes de atingir 80-90% de confluência para manter um crescimento saudável e exponencial e evitar inibição ou diferenciação de contato.
2. Descongele um frasco de células criopreservadas até a temperatura ambiente, depois dilua com o meio apropriado.
3. Centrifuge a suspensão para pelletar as células e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em meio fresco e transfira para um novo frasco na densidade celular apropriada.
4. Quando as células estão 80% confluentes, remova o meio e aspire o meio de crescimento antigo do frasco. Depois, enxágue as células com PBS estéril para remover o soro residual, que inibe a tripsina. Adicione a solução de tripsina-EDTA para cobrir a camada celular e incube por 3-5 minutos ou até que as células se desprendam a 37 °C.
5. Adicione um meio completo contendo soro para inativar a tripsina, depois transfira a suspensão celular para um tubo, misture delicadamente e conte as células.
6. As células semente em placas de triagem diluem as células na proporção de divisão apropriada (por exemplo, 1:3 ou 1:5) em frascos frescos com novo meio e incubam (tipicamente 37 °C, 5% CO₂) para obter a concentração celular desejada.
   NOTA: Para o experimento descrito aqui, a linhagem celular foi revestida a 2 × 10⁴ por poço (placa de 96 poços) e incubada a 37 °C por 12 horas.

3. Adição de compostos

1. Prepare a mistura master A.
   1. Rotule um tubo de centrífuga como "A". Pipete 598,5 μL de meio de cultura e 1,5 μL de marcador proteico em "A". Resuspenda a mistura para garantir homogeneidade, pipeteando para cima e para baixo.
2. Prepare a mistura master B.
   1. Rotule um tubo de centrífuga como "B". Pipete 1,5 μL de marcador proteico, 6,6 μL de cicloheximida e 591,9 μL de meio de cultivo em "B". Resuspenda a mistura para garantir homogeneidade, pipeteando para cima e para baixo.
3. Trate as células com compostos desejados (Figura 1), controles positivos e negativos.
   1. Remova as células da incubadora e remova o meio de crescimento por aspiração. Incline a placa e aspire na lateral do poço em vez do centro para evitar perturbações das células.
   2. Pipete 1 μL de composto de teste em um poço e 1 μL de veículo composto de teste (0,1% v/v DMSO) em um poço. Para estudos duplicados, adicione cada amostra a um segundo poço e repita esse processo. Adicione 99 μL de mistura master A nesses poços. Pipete suavemente em ângulo para a lateral do poço para evitar a interrupção cinética das células.
      NOTA: A concentração máxima de DMSO para triagem de compostos depende do tipo celular e do ensaio, mas as diretrizes gerais são: 0,1-0,5% de DMSO — geralmente seguro para a maioria dos ensaios celulares com toxicidade mínima, e 1% de DMSO — máximo comumente usado e aceitável para muitos tipos celulares em ensaios de curto prazo.
   3. Pipete 100 μL de mistura master B em dois poços. Pipete em ângulo para a lateral do poço para evitar a perturbação das células.
   4. Bata suavemente na placa para conseguir incorporar os componentes desejados às células. Incube as células a 37 °C por 0,5-2 horas.

4. Término do experimento e lavagem das células

1. Remova o meio de cultura por meio da aspiração. Incline a placa e aspire na lateral do poço em vez do centro para evitar perturbações das células.
2. Adicione 100 μL de buffer PBS em cada poço e centrifuge a placa a 900 × g por 5 minutos.
3. Remova o buffer PBS via aspiração.

5. Fixação e permeabilização

1. Adicione 100 μL de solução fixativa a cada poço. Incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos em um ambiente escuro.
2. Remova a solução fixativa por aspiração. Incline a placa e aspire na lateral do poço em vez do centro.
3. Lave as células com 100 μL de tampão de lavagem e remova o tampão por aspiração. Repita essa etapa duas vezes.
4. Adicione 100 μL de buffer de permeabilização a cada poço e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
5. Remova o tampão de permeabilização por aspiração. Incline a placa e aspire na lateral do poço em vez do centro.

6. Reação e coloração de proteínas

1. Prepare a mistura master cocktail de reação.
   1. Adicione 651 μL de tampão PBS, 7,0 μL de reagente de cobre 100x, 7 μL de azida fluorescente e, finalmente, 35 μL de agente redutor em um tubo de centrífuga. Resuspenda essa mistura para garantir homogeneidade.
      NOTA: Siga exatamente essa ordem ao adicionar os reagentes. Use em até 15 minutos após o preparo.
2. Adicione 100 μL do coquetel de reação a cada poço. Incube as células por 30 minutos em temperatura ambiente, em um ambiente escuro, para evitar o fotobranqueamento.
3. Centrifuge as células a 900 × g por 5 minutos. Equilibre a centrífuga adicionando placas vazias para distribuir o peso de forma uniforme. Remova a mistura por aspiração.
4. Lave as células com 100 μL de tampão de lavagem e remova o tampão por aspiração. Repita essa etapa duas vezes.

7. Cornação de DNA

1. Prepare uma diluição 1x da coloração total de DNA e adicione 100 μL a cada poço. Incube as células em temperatura ambiente por 20 minutos em um ambiente escuro para evitar o fotodesbranamento.
2. Centrifuge a placa a 900 × g por 5 minutos. Equilibre a centrífuga adicionando placas vazias para distribuir o peso de forma uniforme. Remova a mistura por aspiração.
3. Lave as células com 100 μL de tampão de lavagem e remova o tampão por aspiração. Repita essa etapa duas vezes.
4. Ressuspenda as células com 100 μL de buffer PBS resfriado para prepará-las para a imagem de imagem.

8. Imagem

1. Insira a placa no leitor de placa.
2. Ajuste a ampliação para 20x.
3. Analise a coloração do núcleo com o canal GFP 469/525 nm. Use autobinning e autofoco para melhorar os resultados de imagem.
4. Analise a síntese ativa de proteínas com o canal Texas Red 586/647nm. Use autobinning e autofoco para melhorar os resultados de imagem.

Results

Esse ensaio utilizou fluorescência para visualizar e quantificar a capacidade de diferentes produtos naturais de inibir a síntese de proteínas. A cicloheximida (CHX) é um inibidor conhecido da síntese de proteínas cujo modo de ação envolve interferir no processo de translocação durante a elongação¹¹. Para este estudo, células vivas foram detectadas com um corante nuclear fluorescente verde. OPP é um derivado da puromicina que se liga covalentemente às proteínas

Discussion

Esse protocolo fornece uma metodologia de triagem fluorométrica para testar produtos naturais e pequenas moléculas, avaliando sua capacidade de inibir a síntese de proteínas. A simplicidade desse protocolo permite que pesquisadores de graduação o implementem corretamente, possibilitando que façam contribuições substanciais para o conhecimento científico. O protocolo exige uma compreensão básica dos métodos e técnicas biológicas, com etapas que exigem execução cuidadosa para garantir resu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leitor Multimodo Multimodo de Imagem de Células Agilent Biotek Cytation 1	Agilent	BTCYT1V
Composto 1 (Deshidroabietilamina, CAS 1446-61-3)	Enamine	EN300-7409771
Composto 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific & nbsp;	75004271
Placa Ibidi Gmbh-slide de 96 poços	Ibidi	80826
Linhas Celulares MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
Soro tamponado com fosfato pH 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Kit de Ensaio de Síntese de Proteínas (Verde)	Abcam	Ab239725