Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

Resumo

Este protocolo descreve o projeto de sondas de hibridização dividida utilizando o aptâmero de luz fluorescente DAP-10-42 como repórter de sinal e sua aplicação para detecção de ácido nucleico e diferenciação entre alvos com substituições de nucleotídeo único.

Resumo

Os aptâmeros fluorescentes baseados em DNA (FLAPs) são promissores para ensaios bioanalíticos porque fornecem uma leitura de sinal fluorescente de baixo custo sem a necessidade de marcação de repórteres de sinal de ácido nucleico com fluoróforos e/ou extintores, ao contrário das sondas de hibridização convencionais usadas para detecção instantânea de ácido nucleico. Em vez disso, os FLAPs ligam-se não covalentemente aos ligantes de corante, que exibem fluorescência intrinsecamente baixa em soluções aquosas, mas tornam-se altamente emissores após a ligação do FLAP. Este protocolo descreve um algoritmo para projetar sensores aptâmeros de luz dividida (SLASs) utilizando DAP-10-42, o DNA FLAP mais eficiente relatado até agora. Quando equipado com sequências de ácidos nucleicos complementares a um alvo de ácido nucleico de interesse, o SLAS é uma ferramenta promissora para análise de ácidos nucleicos, permitindo a detecção específica de sequência de alvos de ácidos nucleicos com seletividade de até um nucleotídeo para permitir a análise de substituições de nucleotídeos únicos (SNSs). Os SLASs oferecem a vantagem de uma leitura de sinal baseada em fluorescência sem rótulo, que pode ser medida com um espectrofotômetro fluorescente convencional baseado em cubeta, um fluorômetro portátil ou observado visualmente após a excitação com uma fonte de luz portátil. A abordagem SLAS é benéfica para aplicações de biossensoriamento em diagnóstico de doenças, monitoramento ambiental e pesquisa biomolecular.

Introdução

A análise de ácidos nucleicos usando sondas de hibridização é realizada rotineiramente para detectar e quantificar sequências específicas de DNA / RNA¹. Uma das sondas de hibridização mais bem-sucedidas é a sonda Molecular Beacon (MB), que é um DNA em forma de grampo de cabelo
oligonucleotídeo marcado com um fluoróforo e um atenuador no terminal oposto ^2,3. Ele detecta instantaneamente (sem a necessidade de lavar o complexo sonda-alvo do excesso da sonda) detecta a presença de uma sequência de ácido nucleico complementar ao fragmento de alça da sonda e é comumente usado em PCR quantitativo (qPCR). A necessidade de anexar covalentemente dois corantes - o fluoróforo e o atenuador - à sequência de oligonucleotídeos da sonda aumenta o custo, principalmente quando é necessária uma nova sonda MB direcionada a uma nova sequência de ácido nucleico. Alternativamente, a sonda MB pode ser usada como repórter de sinal em um formato de sonda de hibridização multicomponente (dividida), no qual dois oligonucleotídeos não marcados interagem com o alvo e o repórter da sonda MB⁴. A abordagem de sonda multicomponente aumenta a seletividade para o reconhecimento de ácidos nucleicos e melhora a ligação da sonda a alvos estruturados ^5,6,7, Essa abordagem, no entanto, não elimina a necessidade de marcação covalente do repórter com um fluoróforo⁸.

Os aptâmeros fluorescentes (FLAPs)⁹ são aptâmeros que têm afinidade com corantes sensíveis ao ambiente de baixa fluorescência (fluorógenos), onde a ligação por FLAP aumenta a fluorescência do coletor de fluorogênio. Ao contrário das sondas marcadas com fluorescência e repórteres de sinal, os FLAPs não exigem que os elementos sensores sejam marcados covalentemente com um ou mais corantes e, portanto, oferecem a vantagem da detecção de fluorescência sem marcação¹⁰. Isso é particularmente importante durante a etapa de otimização, quando dezenas de construções de ácido nucleico precisam ser testadas para obter um desempenho satisfatório do ensaio. Além disso, os ensaios FLAP podem ser otimizados ajustando a concentração de um sensor de fluorogênio e/ou FLAP em vez de alterar o design do sensor. Essas vantagens podem ser significativas para laboratórios de pesquisa e ensino de baixo orçamento. Os DNA FLAPs são particularmente promissores como repórteres de sinal de sondas de hibridização multicomponente chamadas de Split Light-up Aptamer Sensors (SLASs)¹¹. O DNA FLAP mais eficiente relatado até agora é o DAP-10-42, que foi originalmente selecionado para aumentar a fluorescência dos corantes dapoxil sulfonil¹², com uma capacidade promíscua de ligar e aumentar a fluorescência de uma variedade de corantes de arila metano (por exemplo, auramina O, AO; cristal violeta, CV) ¹³. O DAP-10-42 foi convertido em SLAS para ser usado para análise de ácidos nucleicos 13,14,15.

O objetivo do método descrito aqui é permitir a análise específica da sequência de alvos de ácido nucleico de interesse usando fitas SLAS sem marcação e um corante fluorogênico como componente tampão. Este protocolo descreve um algoritmo para projetar SLAS baseado em DAP-10-42 e destaca o desempenho do SLAS para detecção altamente seletiva de sequências de ácidos nucleicos que diferem em apenas um único nucleotídeo.

O ensaio de detecção de ácido nucleico SLAS requer dois oligonucleotídeos de DNA não modificados sintetizados de forma personalizada usados em uma concentração final de 0,5-1 μM para desempenho máximo. O protocolo descrito aqui utiliza um corante de Auramina O (AO) disponível comercialmente como fluorogênio. A concentração final de AO no ensaio varia de 1 a 10 μM para garantir um alto aumento de fluorescência na presença de um alvo específico de ácido nucleico sobre o branco (ausência do alvo; Figura Suplementar 1). Os componentes necessários do tampão do ensaio são íons potássio e magnésio (Figura Suplementar 2). Os íons de potássio (1,25-40 mM) estabilizam o domínio G-quadruplex proposto do FLAP usado como repórter de sinal. Os íons de magnésio (2,5-50 mM) reduzem a repulsão de grupos fosfato carregados negativamente após interações SLAS-alvo. A temperatura do ensaio SLAS usando as sequências relatadas para o domínio de relatório de sinal não deve exceder 28 ° C para evitar perda de desempenho¹⁶.

O SLAS é compatível com alvos de ácidos nucleicos de fita simples, como amplicons de DNA de PCR assimétrico ou uma reação isotérmica de amplificação de DNA (por exemplo, amplificação da polimerase recombinase, RPA¹⁷), produtos de RNA de amplificação mediada por transcrição (TMA) ou amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA)¹⁸ e moléculas de RNA nativas, como miRNA, rRNA ou ncRNA). Variações na sequência de nucleotídeos do alvo até um único nucleotídeo podem ser detectadas usando a abordagem SLAS^13,14.

Protocolo

1. Projeto do Sensor de Iluminação Split (SLAS) com DAP-10-42 como repórter de sinal

1. Projetar as sequências de duas fitas de oligonucleotídeos de DNA não modificadas que constituem SLAS. Use um fragmento contendo nucleotídeos (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tabela 1, Figura 1A).
2. Converta a sequência da haste 1 (nts 1-8 e 36-42) para a haste 1 'removendo um resíduo de timina protuberante na posição nt 5, encurtando a haste para 4 bp (nts 4,6-8 e 36-39) e adicionando um terminal CG bp (Figura 1A, etapa 1). Além disso, uma das fitas SLAS contém nts 9-29 da sequência central DAP-10-42, enquanto outra fita SLAS contém nts 30-35 da sequência.
3. Estenda a sequência de 3 'terminais do fragmento contendo nts 9-29 com d (GGTCAT) e a sequência de 5 'terminais do fragmento nts 30-35 com d (ATGACC) para formar uma haste 2 de 6 pb (Figura 1A, etapa 2).
   NOTA: Os pares de bases T4-A39, A6-T38, C7-G37 e G8-C36 da haste 1 em DAP-10-42 são necessários para a função de iluminação do aptâmero. A sequência da haste 1' pode ser modificada apenas no bp terminal e pode ser um par de bases G-C, A-T, T-A ou estendida com 1-2 pares de bases, conforme necessário. A sequência da haste 2 é arbitrária e pode ser alterada. No entanto, recomenda-se que a estabilidade termodinâmica do caule 2 seja preservada, a menos que a temperatura do ensaio seja elevada acima de 28 °C. O encurtamento ou a desestabilização da haste 2 evita a ligação prematura do corante sem um alvo se for observado um fundo alto do ensaio fluorescente baseado em SLAS. A divisão da sequência de nucleotídeos DAP-10-42 entre nts 28-29, 27-28 ou 26-27 em vez de nts 29-30 também é permitida (Figura 1B).
4. Para adaptar o SLAS projetado a um alvo ou interesse de ácido nucleico, estenda a haste 1 'com sequências de DNA complementares aos fragmentos de ligação alvo-alvo (braços) por meio de ligantes d (TT) (Figura 1A, etapa 3). Isso produz as sequências de fitas SLAS-U e SLAS-S que constituem a sonda.
5. Torne o braço de ligação ao alvo do SLAS-S complementar a um fragmento de 7-10 nt do alvo que contém o local SNS e o braço de ligação ao alvo do SLAS-U – complementar a um fragmento de 15-25 nt do alvo adjacente ao braço de ligação ao alvo do SLAS-S (Tabela 1).
   NOTA: É opcional conectar o braço de vinculação de alvo do SLAS-S ao nt 4 ou nt 39 da sequência DAP-10-42 (Figura 1, braço 1 ou braço 2, respectivamente).
6. Avalie a temperatura de fusão (T_m) dos duplex entre o alvo de interesse e os braços de ligação ao alvo do SLAS-S e SLAS-U usando o UNAFold Web Server (unafold.org)¹⁹.
   1. Clique na guia DINAMelt no topo da página da web; vá para Aplicativos e selecione Hibridização de fusão de dois estados (Figura 3A suplementar). Na página Hibridização de fusão de dois estados, insira uma das sequências de interação na caixa da esquerda e outra na caixa da direita (Figura 3B suplementar). Certifique-se de que ambas as sequências estejam na ordem de 5 'a 3'. Você pode inserir mais de um par de sequências de interação separando-as com ponto-e-vírgula.
   2. Na parte inferior da página, indique a temperatura do ensaio (22 °C), as concentrações de catiões monovalentes e divalentes (20 mM e 25 mM, respectivamente) para corresponder às condições do ensaio. Indicar a concentração das sequências que interagem.
   3. Pressione Enviar (Figura 3B suplementar). Observe os resultados que incluem a mudança de energia de Gibbs, mudança de entalpia e mudança de entropia da ligação, bem como os valores de T_m para os duplexes correspondentes (Figura Suplementar 3B).
   4. Certifique-se de que os valores de T_m para os duplex entre o alvo totalmente correspondente (M) e os braços de ligação ao alvo de SLAS-S e SLAS-U estejam acima da temperatura do ensaio, que é de 22 °C no protocolo atual. Aqui, os valores de T_m foram 32,2 ° C e 74,4 ° C, respectivamente (Figura Suplementar 3C).
   5. Certifique-se de que o duplex entre SLAS-S e um alvo incompatível (MM) contendo um SNS tenha um T_m abaixo da temperatura do ensaio. Isso garante alta seletividade do reconhecimento da sonda-alvo, evitando que o fluorogênio AO sinalize a presença do analito de ácido nucleico alvo se ele contiver um SNS no fragmento de ligação ao SLAS (Figura 2). Aqui, o T_m foi de 21,3 ° C (Figura Suplementar 3C), o que foi suficiente para discriminar a incompatibilidade do complexo correspondente.
   6. Ajustar as sequências dos braços de ligação ao alvo, encurtando ou alargando os fragmentos complementares do alvo, se necessário, para satisfazer os requisitos de estabilidade indicados.
7. Obtenha as fitas projetadas SLAS-S e SLAS-U de qualquer fornecedor comercial que forneça oligonucleotídeos de DNA personalizados ou sintetize as fitas de DNA internamente usando um sintetizador automatizado de oligonucleotídeos.

Figura 1: Conversão de um aptâmero de luz fluorescente (FLAP) DAP-10-42 em um sensor de aptâmero de luz dividida (SLAS). (UMA)A estrutura secundária do DAP-10-42¹² é prevista por uma aplicação de dobramento de DNA do UNAFold Web Server¹⁹ a 22 ° C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺. O aptâmero apresenta uma estrutura secundária em grampo com um núcleo que presumivelmente se dobra em um motivo G-quadruplex estabilizado pela haste 1. Para que o DAP-10-42 seja convertido em um SLAS, (1) a haste 1 do aptâmero é encurtada para 4 bp e flanqueada por um GC bp adicional para formar a haste 1 '; (2) a sequência central é dividida entre nts 29 e 30, com os lados 3' e 5' do local dividido estendidos com sequências complementares d (GGTCAT) e d (ATGACC), respectivamente, para formar a haste 2; (3) a haste 1' é estendida com as sequências complementares aos fragmentos adjacentes de um alvo de interesse - braços de ligação ao alvo, com um ligante d (TT) entre os braços de ligação ao alvo e o domínio de relatório de sinal da sonda. (B) O núcleo também pode ser dividido entre nts 28-29, 27-28 ou 26-27 sem perda significativa do sinal e / ou aumento da dobra de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mecanismo de geração de sinal SLAS. O SLAS é composto por duas fitas - SLAS-U e SLAS-S - e um corante fluorogênico (por exemplo, Auramina O; AO). Na ausência de um alvo de interesse de ácido nucleico, ambas as fitas estão no estado dissociado e incapazes de ligar o corante; nenhum sinal é observado (centro). Na presença de um alvo M totalmente correspondente, tanto o SLAS-U quanto o SLAS-S hibridizam com o fragmento adjacente de M para aproximar os fragmentos do núcleo. Isso permite a formação do local de ligação do corante. A ligação de AO aumenta sua fluorescência, que é medida como uma leitura de sinal fluorescente (esquerda). Na presença de um alvo MM incompatível contendo uma substituição de nucleotídeo único (SNS) em um fragmento interagindo com SLAS-S, apenas SLAS-U pode hibridizar com o alvo MM , enquanto SLAS-S está no estado dissociado. Isso evita a formação do local de ligação do corante e nenhum sinal é observado (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Amplificação da sequência visada

1. Amplificar um fragmento do gene a ser analisado com o ensaio SLAS. Para amplificação por PCR ou RPA, use condições assimétricas (por exemplo, com o Forward Primer adicionado a 10 vezes mais do que o Reverse Primer) para gerar um amplicon de fita simples. Para amplificar um fragmento de 126 nt do gene NANOGP8 usando Linear After The Exponential (LATE) PCR²⁰, use as sequências de primer listadas na Tabela 2. Aqui, foi utilizado um molde de DNA de fita simples (Modelo NANOGP8 ou Modelo G1423C, Tabela 2) correspondente ao fragmento de 126 nt do gene. O modelo foi sintetizado de forma personalizada pela Integrated DNA Technologies, Inc.
   1. Prepare uma reação de PCR de 100 μL misturando 10 μL de tampão de reação Taq padrão 10x, 2 μL de mistura dNTP 10 mM (para obter a concentração final de 0,2 mM), 10 μL de primer direto de 10 μM e 10 μL de primer reverso de 1 μM (para a concentração final de 1 μM e 0,1 μM), respectivamente), 0,5 μL de Taq DNA polimerase 5U/μL, molde de DNA e água livre de nuclease. Para um controle sem modelo, adicione água em vez do modelo.
   2. Utilizar as seguintes condições de termociclagem: desnaturação inicial a 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de (1) desnaturação a 95 °C durante 15 s, (2) recozimento do primer a 60 °C durante 30 s, (3) extensão do primer a 68 °C durante 30 s; e extensão final a 68 °C por 5 min.
      NOTA: Técnicas de amplificação baseadas em transcrição, como NASBA¹⁸ , podem ser usadas em vez de PCR ou RPA, especialmente se um modelo de RNA estiver disponível para amplificação. O NASBA gera um amplicon de RNA de fita simples em uma concentração de produto final na faixa micromolar, que é alta o suficiente para ser usada no ensaio SLAS a jusante sem concentração de produto.
2. Precipitar as amostras amplificadas com etanol adicionando 0,1x volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,5) e 3x volume de etanol. Incubar a -20 °C por 1 h, centrifugar a 12.000-18.000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
3. Lave o pellet com etanol a 70%, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante novamente. Seque o pellet ao ar e dissolva em 10 μL de água livre de nuclease para ser usado no ensaio SLAS.

3. Ensaio de fluorescência usando SLAS

1. Prepare soluções estoque de AO (0,1 mM em DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM em água livre de nuclease, 10x), SLAS-U (10 μM em água livre de nuclease, 10x) e 4x tampão de ensaio (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl).
   NOTA: Os íons de potássio são necessários para estabilizar o motivo G-quadruplex presumido do aptâmero, que faz parte do local de ligação do corante. Apenas 1 mM KCl (a 25 mM MgCl₂) em tampão de ensaio 1x é suficiente para garantir um aumento de fluorescência de ~ 14 vezes na presença do alvo específico M sobre o branco (amostra sem alvo; Figura suplementar 2B). Os íons de magnésio estabilizam as interações das fitas de ácido nucleico (entre SLAS-S, SLAS-U e o alvo). A concentração de Mg²⁺ no tampão de ensaio 1x deve ser de pelo menos 5 mM (a 20 mM KCl; Figura Suplementar 2C,D). A solução estoque de AO (~ 1 mM) é preparada em DMSO. As concentrações de estoque de SLAS-S e SLAS-U são arbitrárias e podem ser ajustadas, se necessário, desde que as concentrações finais das fitas sejam mantidas (consulte a justificativa para a seleção da concentração final de SLAS em Discussão).
   CUIDADO: AO é prejudicial se ingerido, tóxico em contato com a pele e suspeito de causar câncer. Sempre use luvas ao trabalhar com soluções AO. A pesagem do AO e a preparação de suas soluções de estoque devem ser feitas sob o capuz químico.
2. Prepare a mistura principal contendo todos os componentes do ensaio, exceto o alvo. Calcular o volume da mistura principal (_mistura V) multiplicando o volume da amostra (60 μL) pelo número de amostras mais uma (n+1):
   
   O número de amostras n deve incluir os controlos negativos e positivos necessários.
3. Combine 0,25x V_mix μL de 4x Assay Buffer, 0,1x V_mix μL de 0,1 mM AO, 0,1x V_mix μL de 10 μM SLAS-S e 0,1x V_mix μL de 10 μM SLAS-S. Adicionar água livre de nuclease ao volume final de modo a acomodar o volume alvo adicionado no passo 3.4. Vortex e centrifugue brevemente a mistura master. Alíquota de 50 μL da mistura principal em n tubos de amostra.
   NOTA: O sample volume pode ser ajustado dependendo das características do instrumento utilizado para detectar o sinal fluorescente. O volume da mistura principal que é aliquotado em tubos de amostra pode ser ajustado com base no volume alvo adicionado na etapa 3.4. O volume de água livre de nuclease adicionado para fazer a mistura principal deve ser ajustado de forma correspondente. Por exemplo, se a amostra contendo o alvo for adicionada a 10% (V/V) do volume final da amostra, a água deve ser adicionada à mistura principal até 0,9x V_mistura.
4. Use uma amostra como controle sem alvo (em branco) e uma amostra como controle positivo. Adicione 10 μL da amostra contendo alvo à mistura principal (50 μL) para fazer o volume final da amostra de 60 μL contendo 10-1000 nM alvo. Para o branco, use água livre de nuclease (10 μL) em vez do alvo. Para controle positivo, use um oligonucleotídeo de DNA sintético contendo a sequência alvo (por exemplo, alvo M, Tabela 1). Adicione 10 μL de controle de 0,6-3 μM para fazer uma concentração final de 0,1-0,5 μM.
   NOTA: A alta fluorescência neste controle positivo garante que o ensaio funcione conforme o esperado, mesmo que um sinal negativo seja observado para as amostras desconhecidas testadas.
5. Misture as amostras e gire para baixo usando uma microcentrífuga. Incubar as amostras a 22 °C durante 10-60 min. O sinal aumenta apenas em <15% entre 40 min e 60 min (Figura 3).
6. Medir a fluorescência das amostras a 540 nm após excitação a 475 nm utilizando um espectrofotómetro fluorescente.
   NOTA: É possível usar um fluorômetro portátil que mede a fluorescência em tubos de PCR de paredes finas. O fluorômetro precisa ter filtros de excitação e emissão adequados para detectar a fluorescência AO. Um exemplo de um filtro de excitação adequado é um passa-curto de 495 nm. Um exemplo de filtro de emissão adequado é 510-580 nm. Alternativamente, o sinal pode ser observado visualmente após a excitação da fluorescência AO na amostra com uma fonte de luz UV ou azul.
   CUIDADO: Se uma lâmpada UV for usada, use óculos de proteção UV.

Figura 3: Dependência do tempo da geração de sinal para SLAS-29U/30S. Uma amostra contendo AO, SLAS-29U e SLAS-30S foi analisada usando o modo cinético de um espectrofotômetro fluorescente (excitação a 475 nm, emissão a 540 nm, excitação/fendas de emissão de 5 nm) durante 60 min. Em um tempo de 5 minutos (indicado com uma seta), o alvo M foi adicionado à amostra. Os dados são calculados a partir de dois ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

O desempenho do SLAS utilizando o núcleo DAP-10-42 como repórter de sinal foi demonstrado usando uma sonda projetada para interrogar um fragmento do gene NANOGP8 importante para a progressão do glioblastoma multiforme (GBM), uma forma agressiva de câncer cerebral²¹. Foi relatado que este fragmento contém SNSs na carga de DNA de exossomos derivados de células cancerígenas²². Portanto, o SLAS foi adaptado ao local SNS do gene. Os alvos de DNA sintético M ou ...

Discussão

No protocolo relatado, as etapas críticas incluem (i) o design do SLAS; ii) temperatura do ensaio; (iii) presença de cátions metálicos mono e divalentes (K⁺ e Mg²⁺); iv) concentrações de fitas SLAS.

Projeto de SLAS
Ao projetar fitas SLAS, é importante considerar a estabilidade termodinâmica dos complexos formados pelas fitas SLAS-S e SLAS-U na ausência de alvos e na presença de alvos específicos ou não específicos (se ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Auramina O	MP Biomedicals	195064	um corante fluorogênico usado para relatórios de sinais
Fluorômetro Cary Eclipse	Tecnologias Agilent	G9800A	para medir o sinal fluorescente das amostras
Sulfóxido de Dimetila	MP Biomedicals	196055	solvente para preparar soluções-mãe de Auramina O
Oligonucleotídeos de DNA (primers, fitas SLAS, molde sintético para PCR)	IDT	N/A	feito sob medida e dessalgado pelo vendedor, usado sem purificação adicional
Mistura dNTP, 10 mM	ThermoFisher Scientific	R0191	para reação de PCR TARDIO
Cloreto de magnésio	invitrogen	AM9530G	componente tampão; necessário para a correta associação das fitas da sonda com o alvo analisado
Tubos de microcentrífuga (1,5 mL)	Marca de pescador	02-681-320	plástico para preparação de amostras
Micropipeta (0,1-2,5 µ L)	Eppendorph	K56877G	usado para a preparação da amostra
Micropipeta (100-1000 µ L)	Eppendorph	K13160F	usado para a preparação da amostra
Micropipeta (20-200 µ L)	Eppendorph	J05253M	usado para a preparação da amostra
Micropipeta (2-20 µ L)	Eppendorph	G24675G	usado para a preparação da amostra
Mini centrífuga	Corning	6770	usado para girar as amostras
Água livre de nuclease (não tratada com DEPC)	ThermoFisher Scientific	AM9932	Uso para amostras em ensaios de PCR e SLAS
Tubos de PCR (0,5 mL)	invitrogen	AM9932	para medir a fluorescência usando o fluorômetro Quantus
Pontas Pipett (20-200 µ L)	VWR	76322-150	plástico para preparação de amostras
Ponteiras de pipeta (1-10 uL)	VWR	76322-528	plástico para preparação de amostras
Cloreto de potássio	Invitrogen	AM9640G	componente tampão; necessário para o dobramento correto do domínio aptâmero de luz fluorescente da sonda
Fluorômetro Quântico	Promega	E6150	fluorômetro portátil de baixo custo que pode ser usado para medições de fluorescência
Cubeta de quartzo	Starna	16.50F-Q-10/Z15	a ser usado para medição de fluorescência usando o fluorômetro Cary Eclipse
Taq DNA Polimerase com Tampão Taq Padrão	BioLabs da Nova Inglaterra	M0273S	para amplificação de um fragmento de gene a ser analisado com o ensaio SLAS
Tampão Tris-HCl (pH 7,4)	Boston Bioprodutos	R-314	componente de buffer
Lâmpada UV	UVP	95-0016-14	para excitar AO para observação de sinal visual
Misturador de vórtice	VWR	10153-838	usado para misturar as amostras