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Uma estrutura de imagem multimodal para avançar a fenotipagem de células vivas de câncer de mama sem rótulos

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DOI:

10.3791/68498

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22 de agosto de 2025

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1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta uma abordagem multimodal que combina espectroscopia Raman e microscopia de fase tomográfica para fenotipagem não invasiva e sem marcação de células vivas de câncer de mama humano. Ele inclui um pipeline de análise fácil de usar e livre de viés humano para análise morfoquímica rápida e quantitativa, fornecendo insights moleculares e estruturais detalhados com aplicações em pesquisa de câncer e biologia celular.

Resumo

Apresentamos microespectroscopia Raman confocal multimodal (RS) e microscopia de fase tomográfica (TPM) para fenotipagem morfoquímica rápida de células de câncer de mama humano (MDA-MB-231). Aproveitando a natureza não perturbativa dessas técnicas avançadas de microscopia, capturamos dados morfomoleculares detalhados de células vivas e livres de marcadores em seu ambiente fisiológico nativo. Pipelines de processamento de dados livres de viés humano foram desenvolvidos para analisar imagens Raman hiperespectrais (abrangendo modos Raman de 600 cm-1 a 1800 cm-1, que caracterizam exclusivamente uma ampla gama de ligações moleculares e estruturas subcelulares), bem como dados morfológicos de tomografias de índice de refração tridimensionais (fornecendo medições de volume celular, área de superfície, pegada e esfericidade em resolução nanométrica, ao lado da massa seca e densidade). Ao decompor sistematicamente os ricos detalhes de célula única que o RS e o TPM fornecem, demonstramos, de maneira quantitativa, a vantagem de tal método de microscopia multimodal para fenotipagem de células tumorais de câncer de mama. Nossas ferramentas também fornecem mais informações sobre as informações subcelulares sem o uso de rótulos. Por fim, estudamos e discutimos qualquer informação exclusiva ou correlacionada que os conjuntos de dados derivados de RS e TPM apresentam. Acreditamos que nossas ferramentas e pipelines de análise quantitativa de dados podem revolucionar as tarefas de fenotipagem na pesquisa biomédica quando se precisa de um método rápido e não perturbativo em células vivas em cultura, com potencial para tradução futura em aplicações clínicas e diagnósticas.

Introdução

A caracterização celular e a fenotipagem são aspectos fundamentais da pesquisa biomédica1. Ser capaz de caracterizar células nos níveis morfológico e molecular é fundamental para entender a função, diferenciação e patologia celular 1,2,3. É particularmente interessante no campo da oncologia, onde o perfil celular preciso é necessário para o diagnóstico do tumor, determinação do estágio da doença e, finalmente, identificação de alvos terapêuticos2. Os métodos tradicionais de caracterização celular não podem fornecer dinâmica temporal e geralmente são baseados em técnicas invasivas, como coloração ou marcação, que podem interferir no estado nativo das células e introduzir possíveis vieses nos dados4. Portanto, estratégias não invasivas para fornecer fenotipagem precisa e completa de células vivas, em seu estado nativo e imperturbável, são cada vez mais procuradas.

Nesse contexto, os métodos de imagem multimodal sem rótulos revolucionaram a pesquisa em biologia celular ao combinar modalidades complementares para capturar informações morfológicas e moleculares 2,5. Essas abordagens permitem a caracterização integrada e não invasiva das células que as técnicas tradicionais individuais nem sempre são capazes de fornecer 2,5,6. Por exemplo, embora as técnicas de microscopia, como a microscopia de fluorescência, tenham sido amplamente utilizadas em imagens morfológicas e funcionais de células, elas possuem limitações inerentes. Os métodos de fluorescência geralmente sofrem de fotobranqueamento, fototoxicidade e baixas quantidades de moléculas direcionáveis, o que restringe o potencial analítico4. Além disso, essas abordagens geralmente requerem o uso de rótulos ou corantes exógenos, o que pode interromper o estado da célula nativa ou levar a artefatos7.

As plataformas de imagem multimodal, que combinam os pontos fortes de várias modalidades de imagem, superam essas limitações, permitindo a aquisição de diferentes tipos de dados de células vivas sem a necessidade de rotulagem. A integração da espectroscopia Raman (RS) com outras modalidades de imagem, como microscopia de contraste de fase ou microscopia de fase tomográfica (TPM), tem sido uma estratégia promissora para superar as limitações de técnicas únicas. De fato, a imagem multimodal fornece uma compreensão mais profunda dos fenótipos celulares, especialmente em condições biológicas complexas e patologias como o câncer, onde as propriedades moleculares e estruturais são cruciais para uma caracterização precisa 2,5.

O RS sem marcação é adequado para imagens químicas de células8. Ao detectar modos vibracionais moleculares, o RS fornece impressões digitais bioquímicas que podem revelar informações detalhadas sobre a composição molecular das células 9,10,11. Os espectros Raman adquiridos de amostras biológicas contêm informações sobre uma variedade de biomoléculas, como lipídios, proteínas, ácidos nucléicos e metabólitos, que desempenham papéis essenciais na compreensão da natureza molecular das células 9,12. Um dos principais pontos fortes do RS é que ele não é invasivo, permitindo a caracterização de células vivas em seu estado natural sem alterar sua condição fisiológica.

Apesar de suas muitas vantagens, o RS também apresenta algumas limitações. De fato, embora o RS forneça informações moleculares detalhadas, ele não permite informações quantitativas sobre a morfologia ou estrutura das células2. É aqui que técnicas de imagem complementares, como TPM, desempenham um papel crucial.

O TPM é uma forma de imagem quantitativa de fase (QPI) 13 , 14 e permite a visualização de informações quantitativas de alta resolução e sem rótulos sobre a morfologia celular15 , 16 . O TPM difere das técnicas tradicionais de microscopia por não exigir agentes de contraste; em vez disso, opera medindo mudanças de fase resultantes de variações no índice de refração (IR) da amostra17. As mudanças de fase fornecem informações sobre as propriedades estruturais da célula, incluindo seu volume, área de superfície, forma e estrutura interna 2,18. O TPM pode atingir alta resolução espacial, até o nível nanométrico e, portanto, é uma técnica ideal para registrar detalhes morfológicos de alta resolução de células vivas. Além disso, a capacidade de reconstruir tomogramas 3D RI possibilita a visualização de estruturas subcelulares em seu ambiente vivo18, fornecendo informações mais precisas em comparação com as projeções 2D. No entanto, uma das principais limitações do TPM é sua falta de especificidade química, pois fornece principalmente informações sobre a morfologia e distribuição de fases da célula, sem ser capaz de diferenciar entre componentes químicos distintos ou identificar características bioquímicas.

A combinação de RS e TPM em uma técnica multimodal oferece vantagens na fenotipagem celular. Enquanto o RS permite informações moleculares ricas, o TPM adiciona um aspecto estrutural, permitindo que a morfologia celular seja analisada em detalhes consideráveis. Recentemente, a combinação de SR com TPM foi demonstrada com sucesso em vários estudos focados na pesquisa do câncer 2,19,20. Por exemplo, trabalhos anteriores relataram que o co-registro da espectroscopia Raman com dados de microscopia de fase holográfica pode fornecer informações moleculares e morfológicas complementares, permitindo distinguir entre diferentes tipos de células e estágios de desenvolvimento do tumor2. Essas investigações destacaram o poder da imagem multimodal para aumentar a precisão da fenotipagem celular, particularmente no contexto do câncer, onde as características moleculares e estruturais das células estão intimamente ligadas à sua malignidade e comportamento 2,20.

Apesar do recente progresso na imagem multimodal, ainda há desafios a serem enfrentados, particularmente no processamento e análise de dados21. As grandes quantidades de dados que as técnicas de imagem multimodal produzem podem ser complicadas de analisar, e procedimentos simples devem ser empregados para extrair informações significativas. Para combater esse desafio, pipelines de processamento de dados fáceis de usar devem ser estabelecidos para lidar com a complexidade dos dados e minimizar o viés humano na análise. Tais pipelines são críticos para a obtenção de precisão e reprodutibilidade dos resultados e a possível tradução dessas abordagens em aplicações clínicas e diagnósticas.

O objetivo do presente trabalho é ilustrar o potencial da fusão de RS com TPM para fenotipagem sem marcadores, de alta velocidade e não perturbativa de células cancerígenas vivas únicas. Ao fundir essas duas abordagens de imagem robustas, fornecemos uma caracterização abrangente e quantitativa das propriedades moleculares e morfológicas das células de câncer de mama humano (MDA-MB-231). O trabalho também enfatiza a importância de estabelecer pipelines de processamento de dados livres de viés humano para garantir que as informações extraídas dos conjuntos de dados multimodais sejam corretas e confiáveis. Aqui, procuramos estabelecer uma plataforma robusta para a fenotipagem de células cancerígenas que possa ser generalizada para outros tipos de células. A versatilidade e a sensibilidade dessa abordagem a tornam uma candidata potencial para uma ampla gama de aplicações biomédicas, desde estudos fundamentais de biologia celular até diagnósticos.

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Protocolo

1. Preparação da amostra

  1. Semeie células MDA-MB-231 em placas de Petri de quartzo.
    1. Colocar células de câncer de mama humano MDA-MB-231 em placas de Petri com fundo de vidro de quartzo de 3,5 cm.
    2. Incubar as células a 37 °C num ambiente de 5% de CO2 até ficarem totalmente fixadas à superfície (pelo menos 12 h após a sementeira).
  2. Lave as células e prepare-se para a medição.
    1. Remova o meio de cultura das células depois de aderidas à placa de Petri.
    2. Lave as células suavemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio residual.
    3. Adicione meio de cultura de células frescas e mantenha as células cobertas com o meio durante todo o procedimento de medição para garantir sua viabilidade.
      NOTA: Como meio de cultura, este estudo empregou DMEM/F-12 livre de vermelho de fenol suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina (100 UI/mL)-estreptomicina (100 μg/mL).

2. Sistema de microscópio Raman de alto rendimento

NOTA: Os detalhes técnicos do microscópio Raman construído em casa empregado para o trabalho atual sobre imagens de células vivas de células MDA-MB-231 foram descritos anteriormente22. Resumidamente, o sistema de microscópio Raman de alto rendimento utilizado apresenta um laser Ti-Sapphire de 785 nm bombeado por um laser de 532 nm (Figura 1A). O laser de excitação Raman de 785 nm é acoplado a um corpo de microscópio de fluorescência IX83 invertido, com excitação direcionada à amostra através de uma objetiva de imersão em água de UPLSAPO60× 1,2 NA usando um espelho dicróico de 749 nm. Um polarizador ajusta a potência média do laser na porta traseira do microscópio. A imagem de campo claro é ativada pelo acoplamento da luz branca de maneira semelhante. O sistema alterna entre os modos Raman e campo claro alterando automaticamente os filtros dicróicos. O sistema combina varredura baseada em espelho de galvo e platina para imagens de alto rendimento. Um script MATLAB personalizado interage com software de controle de microscópio de código aberto, uma placa de aquisição de dados (DAQ) e sistemas de detecção de sinal para automatizar o processo de aquisição de dados. A luz Raman retroespalhada é coletada pela mesma objetiva, enquanto a luz visível é filtrada por um espelho dicróico de 785 nm e direcionada para um espectrógrafo NIR e um detector de dispositivo de carga acoplada (CCD). Essa configuração permite imagens multidimensionais, capturando sinais de campo claro, fluorescência e Raman em várias posições e pilhas z 2,22.

  1. Procedimento de imagem Raman
    1. Preparação da amostra e preservação das condições fisiológicas
      1. Instale a amostra na incubadora onstage para manter as condições fisiológicas. Certifique-se de que a incubadora esteja ajustada para 37 °C, com regulação de feedback em tempo real para controle de temperatura.
      2. Mantenha os níveis de umidade dentro da câmara em >95% usando a unidade de banho periférica interna cheia de água destilada. Configure o controlador de gás CO2 para misturar 5% de CO2 com 95% de ar e forneça-o à câmara da incubadora.
    2. Gerenciamento automatizado de imersão em água
      1. Ligue o alimentador de imersão em água automatizado construído em casa para fornecer água à lente objetiva a uma taxa de fluxo de 2 μL/min usando bombas de seringa e agulhas de seringa coladas na ponta da objetiva.
      2. Verifique regularmente os níveis de água para evitar a evaporação e garantir condições de imagem consistentes durante as medições.
    3. Aquisição de dados de espectroscopia Raman
      1. Ligue o laser da bomba e ajuste sua potência para atingir uma potência de laser no sample plano de 75 mW.
      2. Abra o software de controle de microscópio de código aberto Micro-manager. Nas definições de configuração, selecione BF e clique em Ao vivo no lado esquerdo da janela do software para visualizar a imagem de campo claro. Selecione a célula única desejada da qual o espectro Raman será adquirido. Em seguida, clique em Parar para encerrar a visualização de campo claro.
      3. Defina a coordenada Z do plano de imagem Raman maximizando as contagens de sinal na câmera CCD.
      4. Para isso, abra o software de controle da câmera CCD (LightField); na configuração do experimento, defina o tempo de exposição para 1.5 s. Em seguida, clique em Executar na barra de ferramentas Experimento e ative o feixe de laser.
      5. Em seguida, ajuste a posição Z para maximizar a contagem de sinais na região da impressão digital de 600 cm-1 a 1800 cm-1 para otimizar a visualização dos picos Raman associados às assinaturas biológicas. Em seguida, desligue o laser e clique em Parar na barra Experimento do software da câmera CCD e saia do software.
        NOTA: Observou-se que as contagens maximizadas de sinais Raman na câmera CCD correspondem à posição ao longo do eixo Z coincidindo com +8 μm em relação ao plano de imagem que não mostra nenhum vestígio de picos Raman relacionados à célula, devido a um ponto focal caindo bastante dentro do quartzo. Este valor pode variar de acordo com o tipo de célula e o status.
    4. Inicie o processo de aquisição de dados usando o script MATLAB, que manipulará automaticamente os canais Raman em medições multidimensionais e salvará os dados Raman hiperespectrais.
    5. Defina o campo de visão para 50 × 50 μm2, 40 × 40 pixels, com cada área de pixel correspondendo a 1,25 × 1,25 μm2. Defina o tempo de exposição para cada espectro Raman igual a 1.5 s.
      NOTA: Execute a calibração do número de onda regularmente usando acetamidofenol samples para anotar picos Raman conhecidos. Calibre o eixo de deslocamento Raman por meio de interpolação quadrática.
      CUIDADO: Manuseie os lasers com cuidado. Sempre use óculos de proteção apropriados classificados para o comprimento de onda do laser durante a configuração e operação.

3. Análise de dados de RS

  1. Mapas hiperespectrais Raman pós-processamento por meio da ferramenta baseada na web RamApp (https://ramapp.io/):
    1. Faça login na ferramenta baseada na web.
    2. Importe os dados hiperespectrais. Na guia Minhas análises , clique em Novo e carregue o arquivo .mat, contendo a variável de dados espaciais e espectrais e a variável do eixo x (ou seja, valores de deslocamento Raman).
    3. Para truncar o espectro para a(s) região(ões) especificada(s) no deslocamento Raman, no menu suspenso Recortar e girar , clique em Recorte espectral e defina a borda inferior e a borda superior da região de deslocamento Raman iguais a 600 cm-1 e 1800 cm-1, respectivamente.
      NOTA: Ao realizar este truncamento de espectro, o pico amplo e de alta amplitude relacionado ao material de quartzo da placa de Petri é excluído da análise.
    4. Para corrigir os espectros Raman para raios cósmicos, nas opções de redução de ruído, clique em Despike, selecione Z-score como um método e defina o limite igual a 8.
      NOTA: A função de pré-processamento Despike ajuda a resolver o problema de pixels contendo picos em seu sinal, que resultam de raios cósmicos.
    5. Marque a opção Use a primeira diferença para encontrar outliers usando a primeira diferença discreta de intensidades ao longo do espectro e marque a opção Corrigir picos. O espectro de cada pixel defeituoso será substituído pelo espectro mediano de seus pixels vizinhos.
    6. Clique em Executar para corrigir os picos.
    7. Para remover o ruído dos mapas correspondentes a cada número de onda, dentro das opções de redução de ruído , clique em Smooth Map, selecione Filtro mediano e defina o tamanho do lado do quadrado que é considerado ao aplicar o filtro em cada pixel do mapa igual a 3 pixels. Em seguida, clique em Executar.
    8. Para aplicar um filtro para suavizar o espectro de cada pixel, clique em Suavizar espectro nas seleções de redução de ruído . Selecione o filtro Savitzky-Golay como o Método e defina o comprimento da janela de filtro igual a 7 e a ordem polinomial do filtro igual a 2. Em seguida, clique em Executar.
      NOTA: Um filtro de Savitzky-Golay requer a especificação do comprimento da janela de filtro (um inteiro ímpar positivo) e a ordem do polinômio.
    9. Para remover o sinal de fundo médio do primeiro plano, abra o painel Remoção de substrato óptico e clique em Identificar substrato. Defina k-means como um método e o número de clusters igual a 2.
      NOTA: Esta função segmenta as células (o "primeiro plano") e seu substrato usando uma abordagem de agrupamento. Você poderá então remover o sinal de fundo médio do primeiro plano ou restringir algumas etapas para trabalhar apenas em pixels de primeiro plano. O número de clusters a serem selecionados pode variar dependendo do espécime específico.
    10. Nas opções avançadas, marque Limpeza morfológica para remover algumas pequenas bolhas do primeiro plano (por exemplo, partes de células espúrias, etc.). Em seguida, clique em Executar.
    11. No painel Remoção de substrato óptico , para subtrair o sinal de fundo médio, clique em Remover substrato, selecione Média global (média dos 95% dos valores centrais) e clique em Executar.
      NOTA: K-means é tipicamente mais rápido, embora não determinístico (no entanto, como a semente aleatória é fixa, o mesmo resultado será obtido em cada execução, todo o resto sendo igual). O número de clusters pode ser aumentado além de 2 se certas partes do primeiro plano ainda forem reconhecidas como plano de fundo. O cluster com o sinal médio mais baixo é definido como o plano de fundo.
    12. Para corrigir a fluorescência da linha de base, abra o painel Linha de base e clique em Corrigir linha de base. Selecione asPLS (Adaptive Smoothness PLS) e defina λ igual a 5000000. Em seguida, clique em Executar.
      NOTA: Existem 7 métodos disponíveis que podem ser selecionados, 5 dos quais são baseados em mínimos quadrados penalizados (PLS). Nesses métodos PLS, um parâmetro de suavização (λ) é necessário. Um valor mais alto de λ resultará em linhas de base mais suaves.
    13. Para normalizar cada mapa hiperespectral Raman dividindo-o por sua norma de Frobenius, clique em Diversos e selecione a opção Normalizar . Em seguida, selecione Frobenius como o Método e clique em Executar.
      NOTA: A norma de Frobenius é utilizada para normalizar toda a matriz de dados.
    14. Para obter uma imagem em cores falsas que ilustre a distribuição espacial de um componente subcelular, no painel Imagens do lado direito, na Imagem de intensidade, clique no símbolo do menu Abrir . Em seguida, clique na opção Editar imagem para abrir o painel de edição.
    15. No painel de edição, selecione Banda única e defina a faixa espectral (por exemplo, 715−725 cm-1 para o citoplasma). Selecione Cor dupla no mapa de cores, defina a cor, o limite de intensidade e a opacidade e clique em Confirmar.
    16. Para baixar um espectro de ponto único, clique no pixel de interesse na imagem para selecioná-lo. Em seguida, no painel Legenda espectral , na seção Cursor , clique em Baixar espectro. Repita o mesmo procedimento para diferentes componentes subcelulares.
    17. Para exportar os espectros Raman de primeiro plano e substrato, no painel Legenda espectral , na seção Identificação do substrato , clique em Baixar espectro para as seções Primeiro plano e Substrato .
      NOTA: No protocolo descrito anteriormente para análise de dados RS, etapas de pré-processamento e análise univariada foram descritas para gerar imagens em cores falsas ilustrando a distribuição espacial dos principais componentes subcelulares, espectros de intensidade Raman de primeiro plano e substrato e espectros de ponto único de estruturas subcelulares. Embora a análise a jusante seja frequentemente adaptada à questão biológica específica, este estudo agora destaca métodos multivariados e de classificação representativos acessíveis por meio da seção de análise de mapa da ferramenta baseada na web empregada. Isso inclui análise de cluster, análise de componentes principais (PCA), resolução de curva multivariada (MCR), N-FINDR e ajuste espectral. O ajuste espectral permite a quantificação e comparação de características espectrais usando abordagens baseadas em distância, como o Coeficiente de Correlação de Pearson ou o Spectral Angle Mapper. A análise de cluster pode ser conduzida usando algoritmos como k-means, mini-batch k-means ou clustering aglomerativo hierárquico, facilitando a segmentação de dados hiperespectrais com base na similaridade espectral. O PCA pode ser aplicado para reduzir a dimensionalidade dos dados e destacar os padrões de variância, enquanto o MCR permite a decomposição de sinais mistos em espectros de componentes puros. O algoritmo N-FINDR auxilia na extração de espectros de membros finais aplicando primeiro o PCA para reduzir a dimensionalidade, tornando-o particularmente adequado para conjuntos de dados hiperespectrais. Essas ferramentas fornecem uma estrutura robusta para a exploração a jusante de padrões biológicos codificados em dados espectrais Raman.

4. Protocolo de medição TPM

  1. Prepare a configuração do microscópio.
    1. Coloque uma gota de água destilada na lente objetiva do microscópio. Posicione a amostra no estágio de tradução do microscópio. Ajuste a posição da amostra para alinhá-la com a lente objetiva.
  2. Alinhe as lentes objetiva e condensadora.
    1. Ligue o microscópio e inicie o software de imagem TomoStudio. Clique no ícone do microscópio na barra de ferramentas. Após a inicialização, clique em Configuração. Selecione LiveCell no painel Trabalho e PBS como Mídia.
      NOTA: O valor de RI no painel Médio é definido automaticamente como 1,337 quando PBS é selecionado como médio.
    2. Acesse a guia Calibração no painel de controle do software de imagem. Defina as posições axiais das lentes objetiva e condensadora selecionando Foco e Superfície, respectivamente.
    3. Clique em Modo de digitalização para ajustar manualmente as lentes, garantindo que os padrões de iluminação estejam concentrados no centro do campo de visão e pareçam quase imóveis.
  3. Localize a amostra.
    1. Clique em Modo normal e ajuste o estágio de tradução para posicionar a célula no campo de visão. Foque na amostra ajustando a posição axial da lente objetiva até que o limite da amostra se torne quase invisível na tela.
    2. Ajuste o estágio de tradução para localizar uma região sem células, garantindo uma visão desobstruída.
  4. Calibre o sistema.
    1. Selecione Calibrar no software de imagem para capturar vários hologramas 2D em ângulos de iluminação variados.
  5. Adquira o tomograma 3D RI.
    1. Ajuste o estágio de tradução para centralizar a célula dentro do campo de visão. Navegue até a guia Aquisição e selecione Instantâneo 3D para capturar o tomograma da célula.
      NOTA: O tempo de aquisição para um tomograma 3D RI de uma única célula é significativamente menor (na ordem de segundos), em comparação com o tempo de aquisição exigido pelos dados RS; portanto, a adoção de uma incubadora no palco para TPM normalmente não é necessária. No entanto, se as medições em um grande número de células forem realizadas, ou em condições específicas, câmaras de incubação comerciais dedicadas que fornecem condições fisiológicas estão disponíveis e podem ser integradas ao sistema TPM.

5. Análise de dados do TPM

  1. Mapas TPM pós-processamento usando o software TomoStudio.
    1. Para visualizar os tomogramas holográficos, selecione os dados no painel Navegação de Dados , clique com o botão direito do mouse nos dados e clique em Abrir. A guia Pesquisa será aberta automaticamente para análise posterior. No painel Gerenciador de dados , clique em Tomografia de RI.
    2. No painel Visualização de volume , selecione RI e desenhe quatro caixas de cores retangulares na tela de RI.
      NOTA: Cada caixa de cores permite associar, no tomograma mostrado no painel Exibir , uma cor específica aos componentes da célula caracterizados pelo intervalo de RI identificado pela caixa na tela de RI. Depois de desenhar cada caixa de cores, as informações relacionadas aparecem automaticamente na tabela abaixo da tela de RI.
    3. No painel abaixo da tela de RI, defina os valores mínimo e máximo de Intervalo de RI para cada caixa de cores (ou seja, primeira caixa de cores: MinRI = 1,3450 e MaxRI = 1,3499, segunda caixa de cores: MinRI = 1,3506 e MaxRI = 1,3571, terceira caixa de cores: MinRI = 1,3586 e MaxRI = 1,3650, quarta caixa de cores: MinRI = 1,3688 e MaxRI = 1,3866). Associe um valor de opacidade e uma cor (clicando duas vezes em cada caixa e selecionando uma cor) a cada caixa. Isso permite a visualização dos tomogramas de acordo com as distribuições 3D do IR.
    4. Clique em Salvar para salvar os intervalos de RI e as caixas de cores definidos.
      NOTA: As faixas de RI devem ser ajustadas dependendo das amostras específicas.
    5. Para obter descritores quantitativos da morfologia celular (ou seja, volume [V], área de superfície [S], área projetada [A], RI médio, densidade [D], massa seca [DM] e esfericidade [Φ]), utilize a interface de análise .
      NOTA: Detalhes sobre o cálculo teórico dos parâmetros quantitativos podem ser encontrados aqui 2,23.
      1. Na barra de ferramentas, clique em Análise. No painel Análise à direita, selecione Manual no painel Segmentação e defina 1,3450 como Limite de RI. Em seguida, clique em Aplicar.
        NOTA: Certifique-se de que os valores do RII (fl/pg) e do RI basal sejam respectivamente 0,19 (o incremento de refração, que é amplamente estabelecido por investigações anteriores24) e 1,3370 (RI de PBS empregado para RI de calibração de fundo de PBS). O software de imagem realiza uma segmentação volumétrica da célula-alvo de acordo com o limite de RI definido e calcula os índices morfológicos (V, S, A, RI médio, D, DM e Φ) e os relata em uma tabela de saída no painel Medição .
      2. Clique em Salvar para salvar os índices morfológicos calculados.
        NOTA: Além do software empregado, várias ferramentas de código aberto podem ser usadas para quantificar características morfológicas de dados TPM. O CellProfiler (https://cellprofiler.org/) fornece ferramentas para análise de imagens, incluindo segmentação e extração de recursos, que são compatíveis com imagens de contraste de fase. Fiji (https://fiji.sc/) é um software de código aberto com plug-ins para segmentação e cálculo de parâmetros morfológicos25. O Napari (https://napari.org/) é um visualizador de imagens multidimensional com suporte para integração de modelos de aprendizado de máquina para segmentação e análise. O Ilastik (https://www.ilastik.org/) oferece ferramentas de segmentação baseadas em aprendizado de máquina e o DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) integra modelos de aprendizado profundo com o ImageJ/Fiji para análise avançada. Além disso, o MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) fornece ferramentas para operações morfológicas 2D e 3D em Fiji. O Cellpose326 é outra ferramenta baseada em aprendizado profundo para segmentação celular que pode ser aplicada à imagem de contraste de fase.

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Resultados

Descrevemos um fluxo de trabalho para a caracterização morfoquímica sem marcação de células vivas com base em RS e TPM confocais. Testamos a capacidade do fluxo de trabalho proposto para atingir a composição molecular e os parâmetros morfológicos da linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-231 (Figura 1).

As células MDA-MB-231 foram semeadas em placas de Petri com fundo de vidro de quartzo. Um microscópio Raman confocal personalizado (...

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Discussão

Apresentamos uma abordagem multimodal e um pipeline de análise direto integrando duas técnicas avançadas de imagem sem rótulos: RS e TPM. O fluxo de trabalho descrito permitiu a fenotipagem morfoquímica rápida e não invasiva de células únicas de câncer de mama humano vivo (MDA-MB-231) sem a necessidade de marcação externa.

A RS é uma técnica não destrutiva que permite a caracterização da composição bioquímica de amostras biológicas por meio da detecção dos mod...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Progetto Rocca da fundação MIT-Itália, bolsas do NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Seul, Coréia do Sul) e o National Cancer Center, Coréia (NCC-24H1170). Leonardo Bianchi reconhece a concessão de uma bolsa de pós-doutorado Progetto Rocca para realizar pesquisas colaborativas no Instituto de Tecnologia de Massachusetts e no Politecnico di Milano.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmera CCDInstrumentos de PrincetonPIXIS 100BR eXcelonDetector para sinal de dispersão Raman.
Software de controle de câmera CCDInstrumentos de PrincetonCampo de luz
Laser Ti-Sapphire de onda contínua (comprimento de onda: 785 nm)Espectro-Física3900 SÉ usado para excitação de microscopia Raman.
Espelho dicróicoThorLabsDMSP750BEspelho dicróico de 749 nm, desvia a excitação Raman de 785 nm para amostrar, filtra sinais de fluorescência e campo claro.
Soro fetal bovinoThermo Fisher CientíficoA5256701
Corpo do microscópio de fluorescênciaOlimpoIX83
Laser (comprimento de onda: 532 nm)Espectro-FísicaMilênios eVLaser de bomba para sistema de laser Ti-Sapphire de 785 nm.
Software MATLABObras de Matemática2023uma
Linha celular MDA-MB-231ATCCHTB-26
Espectrógrafo NIRAndrorHolospec HS-HSG-785-LFÉ usado para análise espectral de luz retroespalhada.
Lente objetiva (60 vezes; imersão em água de 1,2 NA)OlimpoUPLSAPO60&vezes;
Câmara de incubação no palcoSucesso de Tokaiconjunto stxg-welsx
Software de controle de microscópio de código abertoµ GerenteMicro-Manager-2.0
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Científico15140122
DMEM/F-12 livre de fenolThermo Fisher Científico21041025
Solução salina tamponada com fosfatoGibco10-010-023
Placas de Petri com fundo de vidro de quartzoTecnologia Waken BSF-S-D12
Software de análise de dados RamanAplicativo RamAppFerramenta baseada na Web para processamento de dados hiperespectrais Raman.
Câmera sCMOSFotônica de HamamatsuOrca Flash 4.0 v2
Bomba de seringaChemyxFusão 720
Microscópio de fase tomográficaTomocube, Inc.HT-2HSistema comercial para obtenção de imagens de fase quantitativa.
Software de análise de dados TPMTomocube, Inc.TomoStudioSoftware utilizado para análise de dados de microscopia de fase tomográfica (TPM).

Referências

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