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Artigo de método

Investigando os efeitos da terapia infravermelha no osso após treinamento físico em esteira de alta intensidade

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DOI:

10.3791/68502

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22 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport, 2College of Athletic Performance, Shanghai University of Sport, 3Institute of Orthopedic Surgery, Xijing Hospital, Air force Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O treinamento prolongado de exercícios em esteira de alta intensidade inibe a formação óssea e promove a reabsorção óssea em camundongos, resultando em diminuição da massa óssea. Aqui, apresentamos um protocolo para examinar os efeitos da terapia infravermelha nas alterações induzidas pelo exercício de alta intensidade no metabolismo ósseo. Mais estudos mecanísticos são necessários para elucidar as vias moleculares subjacentes.

Resumo

O tecido ósseo é um importante órgão de suporte de carga do corpo humano. O exercício moderado aumenta a massa óssea por meio da carga mecânica, enquanto o exercício de alta intensidade pode suprimi-la. A terapia infravermelha melhora a circulação, reduz a dor/inflamação e auxilia no reparo dos tecidos. Este artigo apresenta um protocolo para elucidar os efeitos modulatórios da terapia infravermelha em distúrbios metabólicos esqueléticos induzidos por exercícios de alta intensidade e seus mecanismos moleculares. Neste estudo, 24 camundongos de 6 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em grupos de controle (CTR, N = 8), treinamento de exercícios em esteira de alta intensidade (HIT, N = 8) e terapia infravermelha após exercícios em esteira de alta intensidade (IRT, N = 8). Os dois últimos grupos foram treinados por 8 semanas. Na primeira semana, os camundongos foram submetidos a treinamento de aclimatação em esteira. Na segunda semana, os camundongos se exercitaram a uma taxa de 24 m/min por 50 min, que aumentou a uma taxa de 1 m/min e 10 min a cada semana até atingir 28 m/min por 80 min, com um gradiente de 5° por 6 dias. Na quinta semana, os camundongos do grupo TIH foram submetidos à intervenção de terapia infravermelha de corpo inteiro, com a temperatura controlada entre 42 °C e 45 °C. Todo o processo de tratamento durou ~ 40 min, 3x por semana. Os resultados mostraram que no grupo HIT em comparação com os do grupo CTR, o volume ósseo / volume total e o número trabecular foram significativamente diminuídos, a separação trabecular foi significativamente aumentada, os genes relacionados aos osteogênicos de Atf4, Runx2 e Ocn foram regulados negativamente e os genes relacionados aos osteoclastos de Ctsk e Mmp9 foram regulados positivamente. Os resultados da micro-CT dos camundongos do grupo IRT não mostraram diferença significativa, mas os genes relacionados à osteogênese Alp, Atf4, Runx2, Ocn e Osx foram regulados positivamente no fêmur. Além disso, o gene Ctsk relacionado ao osteoclasto foi regulado negativamente. O exercício de esteira de alta intensidade a longo prazo pode reduzir a massa óssea. Embora a terapia infravermelha não afete a densidade mineral óssea, ela pode melhorar o metabolismo ósseo.

Introdução

A osteoporose (PO) é uma das doenças ósseas metabólicas sistêmicas mais comuns, particularmente prevalente entre os idosos, e representa um importante problema de saúde global1. A PO é caracterizada principalmente pela diminuição da densidade mineral óssea (DMO), qualidade óssea e resistência óssea, o que aumenta o risco de fraturas ósseas2. A prevenção e o tratamento da PO são cruciais para a melhoria da qualidade de vida humana, englobando abordagens como terapia farmacológica, ingestão adequada de cálcio e vitamina D, redução do tabagismo e do consumo de álcool e exercício físico precoce para aumentar e manter o nível máximo de massa óssea 3,4.

O osso, como estrutura estrutural do corpo, fornece forma fundamental e protege os órgãos internos. Sob a regulação do sistema nervoso, o osso facilita vários movimentos durante as contrações musculares. Ao longo da vida, o osso sofre formação, reabsorção e remodelação contínuas. Os osteoclastos reabsorvem continuamente o osso velho, enquanto os osteoblastos formam e mineralizam o osso novo. Esses processos são fortemente acoplados e mutuamente regulados, mantendo um equilíbrio dinâmico na renovação óssea5. Numerosos estudos têm demonstrado que o exercício físico adequado (como exercícios aeróbicos e treinamento resistido) pode efetivamente prevenir e tratar a PO6. O exercício influencia o metabolismo ósseo modulando o estresse mecânico no esqueleto (como impacto no solo, choque e tensão no local de inserção muscular) e fatores bioquímicos na circulação sanguínea (como hormônios e citocinas), promovendo assim a saúde óssea7. No entanto, exercícios prolongados de alta intensidade podem afetar negativamente a saúde óssea, levando à perda óssea. Por exemplo, após 8 semanas de corrida em esteira em intensidades altas, moderadas e baixas (a uma velocidade de 15 m/min) em um modelo de camundongo com lesão do manguito rotador, o volume ósseo/volume total (BV/TV), número trabecular (Tb.N) e espessura trabecular (Tb.Th) foram mais baixos no grupo de alta intensidade em comparação com aqueles nos grupos controle e moderado/baixo enquanto a separação trabecular (Tb.Sp) foi maior. Esse achado sugere que o treinamento de alta intensidade tem efeitos prejudiciais na recuperação do manguito rotador e na massa óssea8.

A terapia infravermelha (IRT) é um dos princípios mais amplamente utilizados em dispositivos de fisioterapia de reabilitação na China. Promove a circulação sanguínea local, acelera a absorção de substâncias inflamatórias e aumenta o fornecimento de nutrientes 9,10. Como fisioterapia não invasiva, a TRI ganhou ampla atenção nos campos da medicina esportiva, ciência da reabilitação e pesquisa do metabolismo ósseo nos últimos anos. A TRI é mais comumente usada em ambientes clínicos do que outras intervenções. Estudos têm demonstrado que a cicatrização do tecido ósseo é um processo complexo, incluindo a resolução da inflamação e regeneração celular, que pode ser dividido em três estágios: inflamação, proliferação e remodelação. A fase inflamatória é caracterizada principalmente pela angiogênese; a fase proliferativa envolve a proliferação de osteoblastos e a formação de novo osso; e a fase de remodelação é marcada pelo aumento gradual de trabéculas recém-formadas dentro do calo, com o calo da ponte através da lacuna da fratura completamente sofrendo ossificação11. Após uma fratura, o sangue que flui dos vasos para os tecidos precisa ser rapidamente absorvido, o que estimula a proliferação de osteoblastos e a formação óssea. Esses processos vitais requerem um ambiente interno favorável e nutrientes suficientes para suporte. Um certo grau de termoterapia pode efetivamente facilitar essas funções12. Na prática clínica, a terapia infravermelha pode ser usada como um meio auxiliar para tratar a osteoporose e ajudar a aliviar os sintomas relacionados, mas sua pesquisa sobre a massa óssea é relativamente limitada. Este artigo apresenta um protocolo para elucidar os efeitos modulatórios da terapia infravermelha em distúrbios metabólicos esqueléticos induzidos por exercícios de alta intensidade e seus mecanismos moleculares. Portanto, este trabalho, baseado em pesquisas anteriores13, constrói um modelo de exercício em esteira de alta intensidade em camundongos para observar mudanças na massa óssea e investigar ainda mais se a termoterapia pode mitigar a perda óssea induzida por exercícios em esteira de alta intensidade. O objetivo é fornecer uma referência para a prevenção e tratamento da PO baseada no exercício.

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Protocolo

Este estudo recebeu aprovação ética do Comitê de Ética em Animais de Laboratório da Universidade de Xangai (nº 102772023DW016) e cumpriu os regulamentos nacionais/institucionais de pesquisa com animais. Vinte e quatro camundongos C57BL / 6 machos de 5 semanas de idade foram alojados em uma instalação de animais de grau SPF na Universidade de Esportes de Xangai. Os camundongos foram alojados a 22 ± 2 °C, 40-70% de umidade com ciclos claro/escuro de 12 h e receberam comida/água ad libitum . Todos os materiais biológicos, incluindo ossos, sangue e amostras tratadas com reagente de extração de RNA, devem ser coletados em sacos de autoclave de risco biológico nível II, esterilizados a 121 ° C por 60 minutos antes do descarte, com a devida documentação em registros de resíduos de laboratório.

1. Animais

  1. Após 1 semana de aclimatação, estratificar os camundongos pelo peso corporal e atribuí-los aleatoriamente a três grupos: o controle (grupo CTR, N = 8), treinamento de exercícios em esteira de alta intensidade (HIT, N = 8) e terapia infravermelha após exercícios em esteira de alta intensidade (IRT, N = 8).

2. Treinamento de exercícios em esteira de alta intensidade e protocolo de intervenção de termoterapia

  1. Alimente o grupo CTR em condições estáticas sem intervenção.
  2. Após 1 semana de aclimatação, submeta os camundongos dos grupos HIT e IRT a 8 semanas de treinamento em esteira de alta intensidade. A primeira semana é considerada a fase de adaptação: fazer com que os ratos do grupo da esteira corram a velocidades de 12, 15 e 18 m/min por 20, 30 e 40 min, respectivamente, com inclinação de 0°. Na segunda semana, faça os ratos se exercitarem a uma taxa de 24 m/min por 50 min e, em seguida, aumente o exercício a uma taxa de 1 m/min e 10 min a cada semana até atingir 28 m/min por 80 min, com um gradiente de 5°. Realizar esse regime de exercícios 6 dias por semana, com descanso aos domingos (Tabela 1).
  3. Para o grupo TRI, após 4 semanas de exercícios em esteira, introduza a terapia infravermelha (TRI) na quinta semana.
    NOTA: Durante a irradiação infravermelha, mantenha rigorosamente a temperatura corporal do mouse entre 42 °C e 45 °C.
    1. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal para induzir a inconsciência.
    2. Irradiar todo o corpo dos ratinhos utilizando o aparelho terapêutico de infravermelhos, garantindo que a temperatura dos ratinhos é mantida entre 42 °C e 45 °C (detetada por um detetor de temperatura). Realize todo o processo de tratamento por ~40 min, 3x por semana (segunda, quarta e sábado), por 4 semanas até que as amostras sejam coletadas.

3. Coleta de tecidos

NOTA: As amostras de osso de camundongo dissecadas devem ser imediatamente preservadas em nitrogênio líquido ou a -80 ° C para manter a integridade do RNA.

  1. Coleta e preservação de amostras de soro
    1. Pese todos os ratos usando uma balança eletrônica.
    2. Anestesiar os camundongos por meio de uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol.
      NOTA: Ao manusear tribromoetanol, sempre prepare soluções novas sob uma capela de exaustão química usando luvas de nitrilo e proteção para os olhos, armazene a 4 ° C em frascos âmbar protegidos contra luz e descarte as porções não utilizadas através de canais de resíduos químicos aprovados.
    3. Colete amostras de sangue assepticamente usando punção cardíaca para obter 0,5-0,6 mL de sangue. Primeiro, raspe os pelos do peito do mouse e desinfete com iodóforo. Em seguida, palpe o ponto de pulsação cardíaca máxima e insira uma agulha 4-5 G presa a uma seringa na cavidade torácica esquerda entre o terceiro e o quarto espaços intercostais. Finalmente, quando se observar que o sangue flui espontaneamente para a seringa, aplique uma aspiração suave para completar o procedimento de colheita de sangue.
    4. Deixe as amostras de sangue coagularem por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugue a 1.000 × g por 15 min. Alíquota e conservar o sobrenadante (soro) a -80 °C.
  2. Coleta e preservação de amostras ósseas
    1. Use microtesouras e pinças estéreis para dissecar fêmures e tíbias. Retire suavemente os músculos e tendões da superfície óssea ao longo do eixo longitudinal, sem raspar o periósteo, e preste atenção especial à proteção da placa de crescimento.
    2. Enxágue todas as amostras com 1x PBS (pH 7,4). Fixe o fêmur esquerdo em paraformaldeído a 4% (PFA) por 24 h. Use o fêmur esquerdo para medição da densidade mineral óssea antes de uma análise mais aprofundada.
    3. Coloque o fêmur direito em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL pré-rotulados e armazene a -80 °C.
    4. Use o fêmur direito e ambas as tíbias para ensaios de metabolismo ósseo.

4. Medição de parâmetros

  1. Medição do nível de glicose no sangue
    1. Antes da coleta de tecido, obtenha amostras de sangue da veia da cauda dos camundongos. Meça os níveis de glicose no sangue usando um analisador de glicose portátil.
  2. Medição do nível de lactato sanguíneo
    1. Imediatamente após a última sessão de exercícios em esteira, colete amostras de sangue da veia da cauda. Determine os níveis de lactato no sangue usando um analisador de lactato portátil.
  3. Teste de Rotarod
    NOTA: Após a conclusão de todas as intervenções, realizamos testes de rotarod em camundongos de cada grupo. Ao realizar testes de rotarod, escolhemos diferentes grupos de camundongos a serem testados simultaneamente para garantir um tempo de descanso consistente, em vez de testar um grupo de camundongos primeiro, para que possamos excluir as diferenças causadas pelo tempo de descanso.
    1. Coloque os camundongos em um aparelho rotarod com a cabeça voltada para a direção oposta de rotação, permitindo uma tentativa de adaptação.
    2. Defina a velocidade da haste rotativa para 30 rpm; Após a partida, o aparelho acelera uniformemente até a velocidade definida.
    3. Registre o tempo até que o mouse caia pela primeira vez. Use esta medida para avaliar a capacidade de coordenação motora dos ratos.
  4. Medição da massa óssea trabecular femoral
    1. Remova o músculo e o tecido conjuntivo presos aos ossos usando microtesouras e pinças estéreis e lave com PBS.
    2. Realizar microtomografia computadorizada para avaliar os parâmetros do osso trabecular no fêmur esquerdo usando os seguintes parâmetros de varredura: a microtomografia computadorizada foi realizada a 55 kVp/145 μA (8 W) em modo de rotação contínua com voxels isotrópicos de 9 μm, FOV de 31,0 mm, exposição de 250 ms, resolução nativa (388 camadas/segmento) e calibração BH de 1.200 mgHA/cc.
    3. Meça os seguintes resultados da microarquitetura trabecular e cortical.
      1. Importe as imagens reconstruídas para o CT-vox para renderização e visualização tridimensional (3D).
      2. Usando incidências multiplanares (planos coronal, sagital e transversal), separe e extraia o osso cortical e trabecular em regiões distintas do tecido para permitir a análise independente de suas características morfométricas.
      3. Quantifique os principais parâmetros microestruturais, incluindo Volume Ósseo/Volume Total (BV/TV), Número Trabecular (Tb.N) e Espessura Trabecular (Tb.Th) Separação Trabecular (Tb.Sp), para avaliar o desenvolvimento ósseo e o estado de mineralização.
  5. Seccionamento em parafina e coloração histológica
    1. Lave três fêmures esquerdos de cada grupo com PBS e descalcifique-os em EDTA a 10% (pH 7,15) até que ocorra a descalcificação completa.
    2. Desidrate as amostras por meio de concentrações graduadas de etanol (70%, 90%, 95% e 100%), limpe com xileno, infiltre com parafina e incorpore-as (consulte a Tabela 2).
    3. Corte seções seriais de 5,0 μm de espessura.
    4. Coloração de hematoxilina e eosina (HE)
      1. Submeta as fatias primeiro à desparafinação de xileno, reidratação com etanol gradiente e, em seguida, mergulhe-as em hematoxilina por 5 min.
      2. Lave para remover o excesso de mancha, diferencie em álcool de ácido clorídrico a 1% por 3 s, core com eosina por 3 min, desidrate com etanol graduado, limpe com xileno e monte com goma neutra (consulte a Tabela 3).
      3. Capture imagens microscópicas para observar a estrutura do tecido ósseo e a morfologia e distribuição celular na cavidade da medula óssea.
    5. Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)
      1. Desparafine as fatias com xileno e reidratar com etanol gradiente.
      2. Incubar as fatias com o reagente TRAP numa estufa a 37 °C durante 1 h, desidratá-las e torná-las transparentes (ver quadro 4).
      3. Aplique uma gota de resina neutra na lâmina de vidro e, em seguida, abaixe cuidadosamente a lamínula em um ângulo de 45° a partir de uma borda para minimizar a formação de bolhas. Deixe a corrediça montada secar completamente em uma capela antes de prosseguir com a observação microscópica e a imagem.
  6. Análise da expressão gênica no tecido ósseo tibial
    1. Isolamento da medula óssea
      1. Disseque as tíbias do camundongo e remova o excesso de músculo/fáscia usando ferramentas estéreis.
      2. Coloque as tíbias limpas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Corte as duas extremidades do osso com uma tesoura estéril.
      4. Lave a medula óssea em um tubo de moagem contendo esferas de moagem estéreis usando 1x PBS.
        NOTA: Lave a cavidade da medula óssea com PBS até que a cavidade pareça pálida e todo o tecido visível da medula óssea seja removido.
    2. Extração de RNA
      NOTA: Os resíduos de clorofórmio/isopropanol devem ser separados em recipientes de solvente halogenado designados e nunca misturados com alvejante devido à formação de gás tóxico.
      1. Adicione 1 mL de reagente de extração de RNA por tubo. Homogeneizar as amostras com um homogeneizador de bancada (impulsos de 30 s, 4 °C). Incubar os lisados à temperatura ambiente durante 5 min.
      2. Adicione 200 μL de clorofórmio, vórtice por 15 s e incube a 4 ° C por 30 min.
      3. Centrifugue a 12.000 × g por 30 min a 4 °C.
      4. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione 500 μL de isopropanol, inverta 10x para misturar e incube a 4 °C por 20 min.
      5. Centrifugar a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante com cuidado, sem perturbar o pellet de RNA.
      6. Lave o pellet com 1 mL de etanol a 75% (preparado com água tratada com DEPC). Agitar brevemente e centrifugar a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C.
      7. Seque o pellet ao ar por 5-10 min em uma capela (evite secar demais).
      8. Dissolva o RNA em 20-50 μL de água tratada com DEPC.
      9. Medir a concentração e a pureza (relação A260/A280 ≥ 1,8) utilizando um espectrofotómetro.
    3. síntese de cDNA
      1. Sintetize cDNA usando 1 μg de RNA total e um kit de transcrição reversa.
      2. Armazene o cDNA a -20 °C para análise de qPCR.
    4. Análise de qPCR
      1. Analisar a expressão gênica para marcadores osteogênicos: Alp, Atf4, Runx2, Ocn, Osx; marcadores de osteoclastos: Nfatc1, Mmp9, Ctsk; citocinas: Tnf-α, Il-1β, Il-10 (ver Tabela 5).
      2. Use as sequências de primers listadas na Tabela 6 (inclua temperaturas de recozimento).

5. Análise estatística

  1. Apresente todos os dados como média ± erro padrão da média (média ± EPM).
  2. Use Bonferroni e Tamhani para testes post-hoc.
  3. Realize uma análise de variância unidirecional para avaliar as diferenças entre os grupos.
  4. Considere P < 0,05 estatisticamente significativo.

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Resultados

Fadiga devido ao treinamento prolongado de exercícios em esteira de alta intensidade
Estabelecemos um modelo de exercício de corrida de plataforma de alta intensidade de longo prazo para estudar as alterações esqueléticas durante o exercício e os efeitos da terapia infravermelha nos ossos (Figura 1A). Ao final da intervenção, os camundongos foram observados quanto a alterações no peso corporal. Em comparação com o peso corporal dos camundongos no grupo CTR, nenhuma mudanç...

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Discussão

De todas as doenças ósseas metabólicas, a PO é a mais comum e um importante problema de saúde pública mundial11. A PO surge quando as funções osteoblásticas e osteoclásticas são disfuncionais, e sua prevalência éalta18. O exercício tem sido cada vez mais enfatizado por médicos e pesquisadores como uma estratégia potencial para a prevenção e tratamento da PO, considerando seu baixo custo e poucos efeitos adversos e seu grande potencial no fu...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a relatar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nºs 82172475, 82222046, 82272608); Laboratório Chave de Xangai de Desenvolvimento e Manutenção de Competências Esportivas Humanas (Universidade de Esporte de Xangai) (No. 11DZ2261100).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumento de terapia de infravermelho distante  Tecnologia Médica CofoeA radiação infravermelha foi então aplicada como fonte de calor para aquecer o sangue na rede capilar subcutânea. A temperatura da terapia foi controlada entre 42 &graus; C e 45 &graus; C, e todo o tratamento durou aproximadamente 40 min, 3 vezes por semana
Microtomografia computadorizadaSCANCO Medical AGVIVACT80A microtomografia computadorizada foi realizada para avaliar os parâmetros do osso trabecular no fêmur esquerdo, incluindo BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp e espessura cortical (Ct.Th). 
Esteira do ratoAnhui Zhenghua Instalações de Aparelhos Biológicos Co., LtdCorrida em esteira de alta intensidade em camundongos
Máquina de embutir parafinaLeicaA máquina de inclusão de parafina pode incorporar tecidos
fatiador de parafinaLeicaO micrótomo de parafina pode cortar tecidos
Kit de reagentes PrimeScript RT
SPSS 
Tribromoetanol Avertin
TRIzol Biologia PrecisaAG21101/AG21102

Referências

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