Method Article

Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle), que permite a transferência de fragmentos de DNA de interesse entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma usando repositórios genômicos existentes serve como um pré-requisito fundamental para a caracterização funcional sistemática de genes em diversos processos biológicos. As metodologias atuais de alto rendimento para transferência de fragmentos de DNA entre vetores, no entanto, exigem amplificação por PCR de sequências-alvo antes da clonagem, tornando a geração de coleções de plasmídeos em escala genômica tecnicamente exigente e demorada. Ao alavancar um CRISPRshuttle, desenvolvemos um novo método de clonagem de alto rendimento, a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle), que facilita a transferência de muitos fragmentos de DNA de plasmídeos doadores que compartilham sequências de backbone idênticas para um vetor compatível com CRISPRshuttle sem amplificação de PCR dos fragmentos de DNA. Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRshuttle. Este protocolo envolve duas reações sequenciais em tubo de ensaio antes da transformação bacteriana. Primeiro, os fragmentos de DNA alvo são extirpados dos plasmídeos doadores por clivagem mediada por Cas9 de sua sequência de esqueleto vetorial compartilhada. Em segundo lugar, os fragmentos de DNA excisados são inseridos em vetores linearizados compatíveis com CRISPRshuttle por meio da montagem de Gibson. Nossos resultados demonstram que a eficiência do CRISPRshuttle excede 94% e que dois pesquisadores podem gerar cerca de 300 plasmídeos em 7 dias usando o CRISPRshuttle. O CRISPRshuttle facilita a transferência eficiente, adaptável e econômica de fragmentos de DNA entre vetores, simplificando significativamente a geração de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma a partir dos recursos disponíveis é a base e o pré-requisito para empregar a genômica funcional para dissecar processos biológicos. Os métodos atuais de clonagem de alto rendimento, incluindo os sistemas de clonagem Gateway, In-Fusion, Creator e Univector, requerem amplificação por PCR de fragmentos de DNA alvo 1,2,3,4,5. Esse pré-requisito envolve fluxos de trabalho de processamento específicos de fragmentos que abrangem várias operações padronizadas, incluindo, entre outros, design de primer de oligonucleotídeos, purificação de gel e validação de sequência por meio de sequenciamento. Como resultado, a construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma (por exemplo, bibliotecas de superexpressão de cDNA/ORF) tornou-se trabalhosa e demorada, impedindo o avanço da genômica funcional.

Anteriormente, desenvolvemos o CRISPRmass, um método de clonagem de alto rendimento projetado para integrar fragmentos de DNA específicos (por exemplo, o módulo UAS) em vários plasmídeos que compartilham backbones vetoriais idênticos6. Usando o CRISPRmass, construímos mais de 5.500 plasmídeos UAS-cDNA/ORF baseados em GAL4/UAS a partir de uma biblioteca de cDNA/ORF de Drosophila, a Coleção de Ouro6 do Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). No entanto, o CRISPRmass não tem a capacidade de transferir fragmentos de DNA entre vetores, restringindo sua aplicação na clonagem de alto rendimento.

Para resolver essas limitações, desenvolvemos a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (CRISPRshuttle), um novo método de alto rendimento que facilita a transferência de vários fragmentos de DNA alvo para vetores de destino de plasmídeos doadores7. Este processo requer apenas duas reações sequenciais em tubo de ensaio, contornando assim a necessidade de manuseio específico de fragmentos de alvos discretos de DNA7.

O protocolo CRISPRshuttle envolve duas reações sequenciais em tubo de ensaio (Figura 1). Primeiro, sequências de esqueleto vetorial compartilhadas de plasmídeos doadores são clivadas por Cas9 / sgRNA para liberar fragmentos de DNA alvo. Esses fragmentos são então transferidos para o CRISPRshuttle de um vetor compatível com CRISPRshuttle via montagem Gibson para gerar os plasmídeos finais. Um CRISPRshuttle compreende uma sequência de esqueleto vetorial de ~ 20-40 pb que flanqueia as extremidades 5 'e 3' dos fragmentos de DNA originários de plasmídeos doadores e um ou dois locais exclusivos de reconhecimento de enzimas de restrição localizados entre essas sequências flanqueadoras. Um vetor compatível com CRISPRshuttle é construído inserindo um CRISPRshuttle em um vetor de destino, que é posteriormente linearizado digerindo os locais de restrição dentro do. O vector de destino deve ser portador de um gene de resistência aos antibióticos distinto dos existentes nos plasmídeos dadores; Se idêntico, o gene de resistência deve ser substituído por um distinto antes da utilização.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado utilizando o CRISPRshuttle para construir uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF. Este processo envolve a transferência de ORFs humanas da CCSB-Broad Lentiviral Expression Library para o vetor de transgênese de Drosophila pBID-UASC 8,9. O CRISPRshuttle agiliza a construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma, facilitando assim os estudos de genômica funcional.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Determinação dos locais ideais de clivagem de Cas9 / sgRNA flanqueando cDNA / ORF

  1. Preparação de plasmídeos cDNA/ORF
    1. Obtenha clones de cDNA/ORF de repositórios públicos.
      NOTA: Este protocolo usa os clones ORF baseados em vetor pLX304 da biblioteca de expressão lentiviral CCSB humana8.
    2. Isole o plasmídeo usando um kit miniprep de plasmídeo e meça sua concentração com um espectrofotômetro.
  2. Projeto de sgRNA
    1. Acesse o site do CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Cole a região de 20-100 pb do backbone vetorial pLX304 flanqueando a extremidade ORF 3' no campo de destino.
    2. Selecione Drosophila melanogaster como a espécie e clique em Localizar locais de destino. Selecione candidatos a sgRNA com previsão de eficiência superior a 80%.
  3. Preparação de sgRNA
    1. Sintetize um primer direto (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′) onde (N)20 representa a sequência alvo do sgRNA e um primer reverso sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      NOTA: Recomenda-se o uso de primers purificados por PAGE.
    2. Gere um molde de DNA para transcrição in vitro de sgRNA (IVT) via PCR. Prepare uma reação de 100 μL contendo 5 μL de cada modelo pX330 (plasmídeo Addgene 42230; 0,1 ng/μL), primer direto (10 μM) e primer sgRNA-REV (10 μM); 50 μL de master mix de PCR de alta fidelidade 2x; e 35 μL de água ultrapura tratada com dietilpirocarbonato (DEPC).
    3. Amplificar em um termociclador PCR usando o seguinte programa: 98 °C por 30 s; 5 ciclos de 98 ° C por 8 s, 52 ° C por 15 s, 72 ° C por 5 s; 30 ciclos de 98 °C durante 8 s, 72 °C durante 20 s; 72 °C durante 2 min.
    4. Resolva os produtos de PCR em um gel de agarose a 0,8%. Extirpar a banda de ~ 120 pb e purificar usando um kit de extração de gel.
    5. Prepare uma reação IVT de 10 μL contendo 300 ng de fragmento de DNA purificado, 3,33 μL de mistura tampão NTP, 0,67 μL de mistura de RNA polimerase T7 e água ultrapura tratada com DEPC. Incubar a 37 °C durante 4 h.
    6. Quantifique o sgRNA não purificado por espectrofotometria, dilua a 20 ng/μL com água ultrapura tratada com DEPC e congele a -80 °C em pequenas alíquotas.
      NOTA: O tratamento com DNase é desnecessário, pois o DNA residual não interfere nas reações a jusante.
  4. Avaliação de sgRNA
    1. Digerir um plasmídeo cDNA/ORF contendo a estrutura do vetor pLX304 utilizando uma enzima de restrição. Resolva os fragmentos de DNA resultantes por meio de gel de agarose a 0,8%. Purifique o substrato de DNA usando um kit de extração de gel.
    2. Prepare uma mistura de reação de clivagem Cas9 de 5 μL contendo 0,2 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,5 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,015 pmol de substrato de DNA, 0,5 μL de tampão Cas9 10x e água ultrapura tratada com DEPC. Incubar a reação a 37 °C durante 1 h.
    3. Resolva os produtos de clivagem usando gel de agarose a 0,8%. Inclua o substrato de DNA não clivado como um controle negativo.
    4. Visualize os padrões de clivagem usando um sistema de imagem digital e selecione o sgRNA com substrato residual não clivado mínimo para experimentos subsequentes (Figura 2).

2. Troca do gene de resistência a antibióticos do vetor de destino

NOTA: Neste protocolo, usamos o exemplo de troca do gene de resistência à ampicilina do vetor de destino pBID-UASC pelo gene de resistência ao cloranfenicol, gerando assim o vetor de destino portador de cloranfenicol pBIDC-UASC.

  1. Remova o gene de resistência à ampicilina do pBID-UASC.
    NOTA: O gene de resistência à ampicilina do pBID-UASC foi removido pela digestão de Cas9 em conjunto com dois sgRNAs, f1Ori5-G4 (sequência alvo: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') e Amp3-G2 (sequência alvo: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), resultando em uma estrutura vetorial pBID-UASC linear de 7.687 pb. Esses dois sgRNAs têm como alvo o 5' a montante e 3' a jusante do gene de resistência à ampicilina, respectivamente.
    1. Prepare uma reação de clivagem de 10 μL contendo 0,03 pmol de pBID-UASC, 0,25 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 20 ng de f1Ori5-G4, 20 ng de Amp3-G2, 1 μL de tampão Cas9 10x e água ultrapura tratada com DEPC. Incubar a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: O plasmídeo clivado por Cas9, sem purificação, é submetido diretamente à montagem de Gibson.
  2. Amplifica o gene de resistência ao cloranfenicol por PCR.
    NOTA: Um gene de resistência ao cloranfenicol de 840 pb foi amplificado a partir do plasmídeo pMartini-Cam6 por PCR usando o f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATGTGTATGATGATACATAAGGTT-3') e Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') primers.
    1. Preparar o gene de resistência ao cloranfenicol por PCR amplificando o gene de resistência ao cloranfenicol de 840 pb. Configure uma reação de PCR de 20 μL contendo 2 μL de pMartini-Cam (0,1 ng/μL), 1 μL de f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL de Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL de tampão 5x, 0,4 μL de dNTPs (10 mM), 0,4 μL de DNA polimerase de alta fidelidade (2,5 unidades/μL), 11,2 μL de água ultrapura.
    2. Realize a PCR usando as seguintes condições de termociclagem: 1 ciclo de 95 °C por 1 min; 5 ciclos de 95 °C durante 15 s, 46 °C durante 15 s, 72 °C durante 20 s; 30 ciclos de 95 °C durante 15 s, 61 °C durante 15 s, 72 °C durante 20 s; 1 ciclo de 72 °C durante 2 min. Execute a reação em um termociclador.
    3. Resolva os produtos de clivagem com gel de agarose a 0,8% e purifique um fragmento de DNA de 840 pb usando um kit de extração de gel.
  3. Insira o gene de resistência ao cloranfenicol na estrutura linearizada do vetor pBID-UASC, resultando em pBIDC-UASC.
    1. Execute uma reação de montagem Gibson de 2 μL: 0,008 pmol do gene de resistência ao cloranfenicol de 840 pb, 0,002 pmol do pBID-UASC linearizado (etapa 2.1.1), 1,0 μL de 2x master mix de montagem Gibson. Efectuar a reacção a 50 °C durante 1 h.
    2. Transforme 10 μL de células competentes de E. coli com 1 μL de produto de reação de ligação. Selecione os transformantes em uma placa LB suplementada com 15 μg / mL de cloranfenicol.
    3. Escolha uma única colônia e submeta-a à cultura bacteriana subsequente e à minipreparação de plasmídeo. Verificar o vetor de destino contendo cloranfenicol pBIDC-UASC por análise de restrição e sequenciamento de DNA.

3. Construção de vetor de destino compatível com CRISPRshuttle

NOTA: Um CRISPRshuttle compreende sequências de backbone vetorial de cerca de 20-40 pb que flanqueiam as extremidades 5 'e 3' dos fragmentos de DNA alvo, com um ou dois locais de restrição exclusivos localizados entre eles.

  1. Recozer oligonucleotídeos usando um termociclador com o seguinte programa: 94 °C por 2 min; 70 ciclos de 52 s a (95-N) °C, onde N representa o número do ciclo.
    NOTA: O CRISPRshuttle recozido contém saliências de 5' complementares ao EcoRI e XbaI.
  2. Ligue o CRISPRshuttle recozido no vetor de destino digerido por EcoRI/XbaI pBIDC-UASC para gerar o vetor de destino compatível com CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
    NOTA: Esta ligação elimina os locais EcoRI e XbaI originais dentro dos vários locais de clonagem, tornando os locais EcoRI e XhoI no meio do CRISPRshuttle únicos no vetor final. Os locais de restrição exclusivos no CRISPRshuttle permitem a linearização do vetor de destino compatível com CRISPRshuttle.
    1. Prepare uma reação de ligação de 5 μL contendo 14 ng de 8.451 pb EcoRI / XbaI digerido pBIDC-UASC, 0,02 pmol do CRISPRshuttle recozido, 0,5 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 0,3 μL de T4 DNA ligase. Incubar a reação durante a noite a 16 °C.
    2. Transforme 10 μL de células competentes para E. coli com 1 μL do produto da reação de ligação. Selecione transformantes em uma placa LB suplementada com 15 μg / mL de cloranfenicol e incube durante a noite a 37 ° C.
    3. Escolha uma única colônia e submeta-a à cultura bacteriana subsequente e à minipreparação de plasmídeo. Verifique o vetor de destino compatível com CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect por análise de restrição e sequenciamento de DNA.

4. Geração de plasmídeos UAS-cDNA/ORF usando CRISPRshuttle

NOTA: O protocolo CRISPRshuttle envolve reações de tubo de ensaio em duas etapas sendo realizadas em paralelo antes da transformação bacteriana (Figura 1).

  1. Etapa 1 da reação do tubo de ensaio
    1. Extirpar ORFs de plasmídeos pLX304-ORF clivando o esqueleto vetorial usando Cas9 em conjunto com dois sgRNAs, pLX304-CMV-G16 (sequência alvo: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', localizada na espinha dorsal do vetor pLX304 flanqueando a extremidade ORF 5') e pLX304-3'-G1 (sequência alvo: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', localizada na espinha dorsal do vetor pLX304 flanqueando a extremidade ORF 3').
      1. Prepare uma mistura principal para um determinado número (N) de reações de digestão da seguinte forma: (N + 1) x 0,4 μL de 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N + 1) x 0,5 μL de 80 ng / μL pLX304-CMV-G1, (N + 1) x 0,5 μL de 80 ng / μL pLX304-3'-G1, (N + 1) x 0,4 μL de 10x Cas9 Buffer e (N + 1) x 1,45 μL de água ultrapura tratada com DEPC.
      2. Misture bem e diminua a mixagem master. Alíquota de 3,75 μL da mistura principal para cada tubo. Adicione 0,75 μL de plasmídeo pLX304-ORF 0,03 μM a cada tubo. Misturar bem e incubar as reacções a 37 °C durante 1 h.
        NOTA: Dilua cada plasmídeo pLX304-ORF a uma concentração de 0,03 μM com água ultrapura tratada com DEPC. Se a concentração for inferior a 0,03 μM, adicione DNA de plasmídeo diretamente à reação. Os plasmídeos clivados por Cas9 não precisam ser purificados após reações de clivagem e podem ser usados diretamente para montagem subsequente de Gibson.
  2. Etapa 2 de reação do tubo de ensaio
    1. Insira as ORFs excisadas no vetor de destino compatível com CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect via montagem Gibson, resultando em plasmídeos UAS-cDNA/ORF.
      1. Digest pBIDC-UASC-pLXvect com EcoRI e XbaI. Separe o pBIDC-UASC-pLXvect linearizado por eletroforese em gel de agarose e purifique usando um kit de extração em gel.
      2. Prepare uma master mix para um determinado número (N) de reações de montagem Gibson da seguinte forma: (N+1) x 0,14 μL de 3,36 μM linearizado pBIDC-UASC-pLXvect e (N+1) x 1,8 μL de master mix de montagem Gibson.
      3. Misture bem e diminua a mixagem master. Alíquota de 1,94 μL da mistura principal para cada tubo. Adicione 1,66 μL de plasmídeo clivado por Cas9 a cada tubo. Misturar bem e incubar as reacções a 50 °C durante 1 h.
        NOTA: Mantenha a mistura principal e os tubos congelados antes da incubação a 50 °C.
  3. Transforme E. coli com produtos de montagem Gibson.
    NOTA: Os produtos da montagem Gibson não requerem purificação antes da transformação de E. coli .
    1. Descongele as células bacterianas competentes no gelo. Alíquota de 10 μL de células para cada tubo pré-resfriado de 1,5 mL.
      NOTA: Recomenda-se a utilização de células bacterianas competentes com uma eficiência de transformação de pelo menos 1 × 108 UFC/μg de ADN pUC19.
    2. Misture suavemente 10 μL de células competentes com 1 μL de produtos de montagem Gibson. Coloque no gelo por 30 min.
    3. Choque térmico a 42 °C por 1 min e depois leve à geladeira por 2 min.
    4. Adicione 100 μL de meio SOC pré-aquecido (37 °C) em cada tubo. Agitar a 250 rpm durante 1 h a 37 °C.
    5. Colocar as células em placas LB contendo 15 μg/ml de cloranfenicol. Incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: A realização desses procedimentos em grande escala normalmente requer várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as configurações de reação no gelo.
  4. Verificação de plasmídeos UAS-cDNA/ORF.
    1. Inocular uma única colónia em 4,5 ml de meio LB com 15 μg/ml de cloranfenicol. Agitar a 250 rpm durante a noite a 37 °C.
    2. Isole o DNA do plasmídeo usando um kit de mini-preparação de plasmídeo.
    3. Prepare uma reação de digestão de restrição de 20 μL para cada plasmídeo contendo 300-500 ng de DNA de plasmídeo, 0,3 μL de PvuII, 2 μL de tampão 10x e água ultrapura. Efectuar as reacções a 37 °C durante 1 h.
    4. Resolva fragmentos de DNA com gel de agarose a 0,8%. Imagem sob luz UV (Figura 3).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizamos o CRISPRshuttle para construir uma coleção de plasmídeos UAS-cDNA/ORF cobrindo 1.397 genes humanos que são conservados em Drosophila7. A análise de restrição revelou que o CRISPRshuttle atinge uma eficiência de 94,5% para o uso de vetores de destino compatíveis com o CRISPRshuttle contendo duas sequências repetitivas e 96,1% para o uso de vetores de destino sem sequências repetitivas7. Nossos dados demonstraram que geralmente ~ 300 plasmídeos podem ser c...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma etapa crítica no protocolo CRISPRshuttle é a preparação de vetores de destino linearizados compatíveis com CRISPRshuttle. Para garantir a digestão completa, use um excesso de enzimas de restrição para digerir os vetores, e a purificação em gel dos vetores digeridos é fortemente recomendada. Outra etapa crucial é a digestão de plasmídeos cDNA/ORF com Cas9. Se a construção do plasmídeo falhar, use eletroforese em gel de agarose para verificar se pelo menos cDNAs / ORFs parciais foram l...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado por uma doação da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32071135) e um fundo inicial do Hospital Afiliado Nanhua, Escola de Medicina de Hengyang, Universidade do Sul da China. Somos gratos ao Prof. Feng Zhang por gentilmente fornecer o plasmídeo pX330 e ao Dr. Xiaohui Cai pela assistência técnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ágar em póBase químicaKBS-001H
AgaroseSangonA600014-0100
Sistema automatizado de análise de imagem de gel digitalTanonTanon-2500B
CloranfenicolSangonA100230-0010
Kit de extração de gel EZNAÔmegaD2500-02
E.Z.N.A. Mini Kit de DNA de Plasmídeo IÔmegaD6942-02
EcoRI-HFNEBR3101S
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Kit de síntese de RNA HiScribe T7 Quick High YieldNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621X
Termociclador PCRGene LongoT20
Polimerase de DNA SuperFi II PlatinumThermo Científico12361010
PvuII-HFNEBR3151L
Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Incubadora de agitaçãoZhichuZQLY-180V
EspectrofotômetroShimadzuBioSpec-nano
DNA ligase T4PromegaM1801
Trans 10 Célula quimicamente competenteTransGenCD101-02
TriptonaOxóideLP0042
XbaINEBR0145S
Extrato de leveduraOxóideLP0021

References

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