Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento

Summary

Descrevemos um protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle), que permite a transferência de fragmentos de DNA de interesse entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA.

Abstract

O desenvolvimento de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma usando repositórios genômicos existentes serve como um pré-requisito fundamental para a caracterização funcional sistemática de genes em diversos processos biológicos. As metodologias atuais de alto rendimento para transferência de fragmentos de DNA entre vetores, no entanto, exigem amplificação por PCR de sequências-alvo antes da clonagem, tornando a geração de coleções de plasmídeos em escala genômica tecnicamente exigente e demorada. Ao alavancar um CRISPRshuttle, desenvolvemos um novo método de clonagem de alto rendimento, a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle), que facilita a transferência de muitos fragmentos de DNA de plasmídeos doadores que compartilham sequências de backbone idênticas para um vetor compatível com CRISPRshuttle sem amplificação de PCR dos fragmentos de DNA. Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRshuttle. Este protocolo envolve duas reações sequenciais em tubo de ensaio antes da transformação bacteriana. Primeiro, os fragmentos de DNA alvo são extirpados dos plasmídeos doadores por clivagem mediada por Cas9 de sua sequência de esqueleto vetorial compartilhada. Em segundo lugar, os fragmentos de DNA excisados são inseridos em vetores linearizados compatíveis com CRISPRshuttle por meio da montagem de Gibson. Nossos resultados demonstram que a eficiência do CRISPRshuttle excede 94% e que dois pesquisadores podem gerar cerca de 300 plasmídeos em 7 dias usando o CRISPRshuttle. O CRISPRshuttle facilita a transferência eficiente, adaptável e econômica de fragmentos de DNA entre vetores, simplificando significativamente a geração de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma.

Introduction

A construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma a partir dos recursos disponíveis é a base e o pré-requisito para empregar a genômica funcional para dissecar processos biológicos. Os métodos atuais de clonagem de alto rendimento, incluindo os sistemas de clonagem Gateway, In-Fusion, Creator e Univector, requerem amplificação por PCR de fragmentos de DNA alvo 1,2,3,4,5. Esse pré-requisito envolve fluxos de trabalho de processamento específicos de fragmentos que ab....

Protocol

1. Determinação dos locais ideais de clivagem de Cas9 / sgRNA flanqueando cDNA / ORF

1. Preparação de plasmídeos cDNA/ORF
   1. Obtenha clones de cDNA/ORF de repositórios públicos.
      NOTA: Este protocolo usa os clones ORF baseados em vetor pLX304 da biblioteca de expressão lentiviral CCSB humana⁸.
   2. Isole o plasmídeo usando um kit miniprep de plasmídeo e meça sua concentração com um espectrofotômetro.
2. Projeto de sgRNA
   1. Acesse o site do CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Cole a região de 20-100 pb do backbone vetorial pLX304 flanquean....

Results

Utilizamos o CRISPRshuttle para construir uma coleção de plasmídeos UAS-cDNA/ORF cobrindo 1.397 genes humanos que são conservados em Drosophila⁷. A análise de restrição revelou que o CRISPRshuttle atinge uma eficiência de 94,5% para o uso de vetores de destino compatíveis com o CRISPRshuttle contendo duas sequências repetitivas e 96,1% para o uso de vetores de destino sem sequências repetitivas⁷. Nossos dados demonstraram que geralmente ~ 300 plasmídeos podem ser c.......

Discussion

Uma etapa crítica no protocolo CRISPRshuttle é a preparação de vetores de destino linearizados compatíveis com CRISPRshuttle. Para garantir a digestão completa, use um excesso de enzimas de restrição para digerir os vetores, e a purificação em gel dos vetores digeridos é fortemente recomendada. Outra etapa crucial é a digestão de plasmídeos cDNA/ORF com Cas9. Se a construção do plasmídeo falhar, use eletroforese em gel de agarose para verificar se pelo menos cDNAs / ORFs parciais foram l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ágar em pó	Base química	KBS-001H
Agarose	Sangon	A600014-0100
Sistema automatizado de análise de imagem de gel digital	Tanon	Tanon-2500B
Cloranfenicol	Sangon	A100230-0010
Kit de extração de gel EZNA	Ômega	D2500-02
E.Z.N.A. Mini Kit de DNA de Plasmídeo I	Ômega	D6942-02
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Kit de síntese de RNA HiScribe T7 Quick High Yield	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621X
Termociclador PCR	Gene Longo	T20
Polimerase de DNA SuperFi II Platinum	Thermo Científico	12361010
PvuII-HF	NEB	R3151L
Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Incubadora de agitação	Zhichu	ZQLY-180V
Espectrofotômetro	Shimadzu	BioSpec-nano
DNA ligase T4	Promega	M1801
Trans 10 Célula quimicamente competente	TransGen	CD101-02
Triptona	Oxóide	LP0042
XbaI	NEB	R0145S
Extrato de levedura	Oxóide	LP0021