Artigo de método

In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia

1.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

12 de setembro de 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresenta um método para ligação covalente in vivo de biotina a proteínas com base em sua proximidade a uma biotina ligase fundida a uma proteína de interesse. Essa modificação permite um enriquecimento seletivo das proteínas usando grânulos de estreptavidina, conforme necessário em estudos de interação proteica.

Resumo

O paramécio é um importante organismo modelo para o estudo de mecanismos moleculares envolvidos em rearranjos genômicos programados e eliminação de transposons durante a reprodução meiótica. Muitos detalhes desse processo permanecem enigmáticos devido à complexidade da maquinaria molecular envolvida e às interações proteína-proteína transitórias. Aqui, apresentamos um método para marcação resolvida no tempo de proteínas com biotina localizada perto de uma proteína alvo de interesse. O método pode ser facilmente adaptado a diferentes alvos, uma vez que a biotinilação é obtida pela injeção de um DNA que codifica uma proteína-alvo fundida a uma biotina ligase projetada. A construção de fusão é expressa a partir do promotor do gene endógeno, permitindo um perfil de expressão específico do estágio semelhante ao da proteína nativa. Notavelmente, a porção de biotina ligada covalentemente permite o enriquecimento seletivo das proteínas marcadas usando esferas revestidas com estreptavidina. Além disso, com a coloração por imunofluorescência, mostramos que a marcação eficiente requer a suplementação da cultura com biotina. O vetor de expressão projetado plug-and-play, combinado com o procedimento de injeção eficiente demonstrado aqui, permite a rápida geração de linhagens de Paramecium expressando uma proteína modificada. O procedimento de biotinilação aqui demonstrado pode ser seguido com espectrometria de massa para a identificação das proteínas enriquecidas que contêm os parceiros de interação da proteína alvo. A biotinilação de proximidade tem o potencial de simplificar e acelerar a descoberta de interações proteína-proteína em Paramecium e aumentar os esforços para entender seu maquinário de edição de genoma.

Introdução

O organismo unicelular ciliado Paramecium tetraurelia abriga dois tipos distintos de núcleos: um núcleo germinativo para o armazenamento de informações genéticas a longo prazo e um núcleo somático para as funções fisiológicas da célula1. A reprodução sexuada neste organismo requer a formação de um novo genoma somático. Este processo inclui a excisão irreversível de mais de 45.000 fragmentos de DNA do genoma somático2, que incluem elementos transponíveis3 e outras repetições. Particularmente impressionante é que os eventos de excisão são executados com uma precisão até o único par de bases1. Essa precisão é biologicamente necessária, uma vez que os fragmentos de DNA excisados interrompem as regiões codificadoras de proteínas4 e qualquer excisão defeituosa pode evocar mutações de mudança de quadro, códons de parada prematuros ou alterar a sequência codificadora de proteínas. Um intrincado mecanismo de comparação de RNA permite que a célula diferencie as sequências necessárias no novo genoma somático. É iniciado com a transcrição de todo o genoma germinativo5, seguido de corte para um tamanho de 25 pb6, transporte para o antigo genoma somático7, onde todos os RNAs complementares são descartados8. Os sRNAs restantes que não possuem sequências complementares no antigo genoma somático são transportados para o novo genoma somático em desenvolvimento, onde se alinham a quaisquer sequências limitadas pela linha germinativa e direcionam sua excisão9. Este complexo processo de várias etapas requer uma interação precisa e oportuna de muitos componentes celulares e, notavelmente, interações fracas transitórias à medida que os pequenos RNAs transitam entre os diferentes núcleos10,11. Anteriormente, tentativas de entender a mecânica molecular do processo foram feitas usando experimentos de knockdown para determinar se os componentes putativos são essenciais para o processo, seguidos por abordagens de imunoprecipitação para descobrir as interações de proteínas essenciais12 , 13 , 14 . Embora este método seja útil para a detecção de ligação forte e contínua que também resiste às condições não fisiológicas durante o pulldown, a detecção de interações fracas e transitórias pode exigir uma otimização tediosa. Devido à natureza potencialmente transitória de muitas interações envolvidas no processo de edição do genoma, os métodos in vivo podem melhorar a detecção de tais interações. Além disso, algumas proteínas não podem ser eficientemente solubilizadas em condições extracelulares15, o que representa um problema que pode ser resolvido por meio de modificações proteicas baseadas em interação in vivo, como a marcação de proximidade com biotina.

Aqui, descrevemos um novo método que permite uma biotinilação in vivo específica de proteínas localizadas próximas à proteína-alvo desejada. A modificação da biotina covalente pode ser usada para enriquecimento eficiente usando abordagens pulldown baseadas em estreptavidina. O desenvolvimento deste método foi alcançado utilizando a biotina ligase TurboID16 para a realização dos estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia. Nossa abordagem pode ser facilmente aplicada a qualquer proteína-alvo seguindo as etapas descritas no protocolo. Portanto, este artigo fornece uma estratégia eficiente e escalável para biotinilação de proximidade que pode ser usada para estudos proteômicos de alto rendimento em um organismo modelo de protozoário proeminente.

Protocolo

1. Métodos gerais

  1. Obtenha tampões, reagentes e outros materiais conforme listado na Tabela 1.
  2. Cultive linhas monoclonais de Paramecium conforme descrito anteriormente17. Em resumo, transfira uma célula para um novo poço de lâmina de depressão que contenha meio leve bacterizado (0,8 μg / mL β-sitosterol) para que a densidade celular permaneça inferior a 500 células / mL, para evitar o início prematuro do ciclo meiótico. Em 50 divisões celulares, transfira as células para uma cultura de meio rico bacterizado (com 0,8 μg/mL de β-sitosterol) e deixe até que todas as bactérias sejam consumidas, induzindo assim a reprodução sexuada (autogamia)18.
    NOTA: Após a conclusão do ciclo de reprodução sexuada, as células permanecerão em um estado pós-autogâmico sem divisão até que uma nova fonte de nutrientes seja fornecida.
  3. Construa proteínas de fusão dos genes-alvo usando um vetor contendo uma sequência 3x HA turboID otimizada para códon com locais de corte de enzima de restrição a montante.
    1. Realize a amplificação por PCR do gene alvo e sua região promotora a partir do DNA genômico, usando primers projetados com saliências que codificam locais de restrição adequados.
    2. Insira o produto usando a digestão de restrição padrão nos locais de corte compatíveis com o chassi19 a montante das regiões de codificação turboID.
  4. Sequencie, verifique e amplifique o DNA do plasmídeo construído em E.coli DH5α. Isole o plasmídeo usando um kit de midiprep de plasmídeo e linearize 100 μg de DNA de plasmídeo por digestão por restrição.
  5. Purificar por meio de extração de fenol-clorofórmio e, em seguida, filtrar através de um filtro centrífugo12. Realizar a precipitação de etanol e dissolver o sedimento de ADN em água para obter uma concentração de 5 mg/ml.
    NOTA: O DNA pode ser introduzido nos núcleos somáticos das células de Paramecium usando o seguinte procedimento de microinjeção.

2. Microinjeção no núcleo somático (MAC)

  1. Transferir uma célula da cultura pós-autógama obtida na etapa 1.2 para uma lâmina de depressão fresca com meio leve bacterizado com 0,8 μg/mL de β-sitosterol. Incubar a 27 °C durante dois dias antes da injeção para recuperar as células.
  2. Use um estereomicroscópio para transferir as células da cultura recuperada para uma lâmina de depressão recém-preparada preenchida com o meio de lavagem.
  3. Enquanto as células estão no meio de lavagem, adicione 20 μL de ddH2O em uma lâmina de vidro e cubra com uma tampa de vidro.
  4. Adicione 200 μL de óleo mineral em cima da lamínula.
  5. Depois disso, transfira as células lavadas individuais como gotículas sob o óleo mineral usando o mínimo de volume de líquido possível. Coloque até 20 bolhas contendo uma única célula por lâmina e, em seguida, posicione a lâmina preparada no pedestal do microscópio de injeção.
  6. Conecte a agulha de aspiração e mova-a para a posição, depois ligue o braço robótico e a máquina de injeção.
  7. Usando uma ponta de pipeta de microcarregador, adicione 2-3 μL da solução de DNA preparada na etapa 1.5 na agulha de injeção. Conecte a agulha ao braço robótico e mova-a para a posição, depois conecte-a à válvula de pressão da máquina de injeção.
  8. Use o braço robótico para posicionar a agulha de injeção em uma gota de água vazia na lâmina. Em seguida, pressione Limpar para purgar o ar restante na agulha de injeção até que o fluxo de DNA seja observado.
  9. Passe para uma gotícula que contenha uma célula e, em seguida, abaixe a agulha de aspiração. Remova suavemente o líquido (água) desta gota até que a célula seja imobilizada.
  10. Levante a agulha de aspiração e abaixe a agulha de injeção e, em seguida, mude para uma ampliação maior.
  11. Certifique-se de que o núcleo somático (CAM) agora esteja visível como uma região mais escura desprovida de vacúolos alimentares (consulte a Figura 1c) na qual a agulha de injeção precisa ser inserida.
  12. Procure penetrar completamente no CAM com a agulha de injeção e retraia lentamente a agulha ao longo de vários segundos.
    NOTA: Quando a agulha está localizada dentro do MAC, o DNA fluirá no MAC devido à pressão de ar constante aplicada pela máquina de injeção. Um vacúolo difuso consistindo do DNA injetado pode se tornar visível dentro dos limites do MAC.
    NOTA: É possível injetar a mesma célula várias vezes para garantir uma injeção bem-sucedida.
  13. Após a injecção das células, baixar a agulha de aspiração que contém a água aspirada no passo 2.9. Inverta o fluxo para retornar água suficiente para a gotícula até que a célula comece a se mover novamente.
  14. Continue até que todas as gotículas que contêm uma célula tenham sido processadas.
  15. Recupere cada célula injetada coletando as gotículas da lâmina e transferindo cada uma delas para um poço separado preenchido com meio leve bacterizado, com 0,8 μg / mL de β-sitosterol.
  16. Incubar a 27 °C durante a noite, transferir uma única célula de cada poço para um novo poço e manter o poço original a 18 °C como backup.
  17. Cultive as células transferidas durante a noite a 27 °C por 1 dia e, em seguida, transfira 5 células de cada poço monoclonal para um tubo de PCR. Use primers específicos para a amplificação para verificar a presença do DNA injetado nas células.

3. Coloração de imunofluorescência para verificação da localização correta de proteínas e função da biotina ligase

  1. Cultivar os clones positivos para PCR selecionados em 20 mL de meio bacterizado com 0,8 μg/mL de β-sitosterol.
  2. Depois que o meio se tornar menos turvo, colete uma amostra de 50 μL da cultura. Adicione 1 μL de solução DAPI (0,1 mg / mL) e 1 μL de EDTA (0,5 mM) para coloração de DNA para verificar o início da autogamia.
    NOTA: A autogamia geralmente começa com uma densidade celular de 2.000 células / mL.
  3. Se se desejar biotinilação, suplementar o meio de cultura com biotina até uma concentração final de 500 μM durante pelo menos 1 h antes de colher as células.
  4. Colha as células no estágio de desenvolvimento apropriado usando uma centrífuga de medição de óleo equipada com tubos em forma de pêra a 280 x g por 2 min. Descarte o meio de cultura e adicione PBS aos tubos, depois centrifugue novamente e remova o PBS.
  5. Ressuspenda o pellet celular em PBS e transfira para um tubo de microcentrífuga transparente de 1,5 mL.
  6. Prepare uma diluição de PFA a 3,7% em PBS a partir da solução estoque a 37%.
  7. Ressuspenda o pellet celular em 0,5 mL de PFA a 3,7% e incube por 30 min em temperatura ambiente em um rotador de tubo.
  8. Centrifugue a 600 x g por 1 min até formar um pellet visível. Descarte a solução de PFA no recipiente de resíduos especial designado.
  9. Ressuspenda o pellet em 1 mL de glicina 50 mM em PBS. Incube por 5-10 min em um rotador de tubo.
  10. Centrifugue a 600 x g por 1 min. Remova o sobrenadante e adicione 0,8 mL de 1x PBS. Opcionalmente, lave mais uma vez com PBS.
    NOTA: Neste ponto, as células podem ser armazenadas a 4 °C, se necessário.
  11. Centrifugue a 600 x g por 1 min, remova o PBS e adicione 500 μL de Triton X-100 a 0,5% em PBS. Incubar por 20 min em um rotador de tubo.
  12. Centrifugue até que o pellet se torne visível (1.000 x g por 2 min), remova a solução Triton X-100 e ressuspenda as células em PBS.
  13. Prepare uma solução de BSA a 5% em PBS de acordo com o volume de anticorpos necessário.
  14. Remova a lavagem de PBS das células e adicione 100 μL do anticorpo primário diluído em 5% de BSA em PBS às células. Ajustar o tempo de incubação de acordo com o anticorpo utilizado.
    NOTA: A incubação por 2 h em temperatura ambiente é suficiente para a maioria dos anticorpos.
  15. Centrifugue a 600 x g, remova a diluição primária do anticorpo e lave as células com 500 μL de PBS.
  16. Adicione 100 μL do anticorpo secundário diluído em 5% de BSA em PBS. Ajuste o tempo de incubação; Geralmente, 1 h em temperatura ambiente é suficiente. Cubra o tubo com papel alumínio para proteger o fluoróforo da luz.
  17. Adicione 1 μL de solução de DAPI (0,1 mg / mL) durante os últimos 10 minutos de incubação com o anticorpo secundário.
  18. Centrifugue a 600 x g por 1 min, remova a solução de coloração e lave duas vezes com PBS. Deixe 20 μL da segunda lavagem no tubo e ressuspenda as células.
  19. Monte 10 μL em uma lâmina para inspeção ao microscópio.

4. Enriquecimento seletivo de proteínas biotiniladas

  1. Colher 1 x 106 células na fase correcta de desenvolvimento, conforme descrito no ponto 3.4.
  2. Ressuspenda o pellet em 3 mL de tampão de lise.
  3. Transfira para um homogeneizador dounce e lise as células com 100 pinceladas.
  4. Transferir o lisado para dois tubos de microcentrífuga e centrifugar a 21.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  5. Equilibre os grânulos magnéticos revestidos com estreptavidina misturando 20 μL (por amostra) de pasta de grânulo ressuspenso de vórtice de pulso com 1 mL do tampão de lise em um tubo de microcentrífuga e incubando por 2 min.
  6. Remova o tampão de lise dos grânulos usando um suporte magnético e ressuspenda no tampão de lise.
  7. Repita a etapa 4.6.
  8. Remover o tampão de lise e misturar os grânulos equilibrados com o sobrenadante (lisado clarificado) do passo 4.4.
    NOTA: As concentrações ideais de sal e a porcentagem de detergentes para ligação às esferas podem diferir e precisam ser validadas experimentalmente. Além disso, é possível incubar o pellet de 4,4 em 50 μL de SDS a 2% por 10 min a 60 °C para extrair proteínas da fração insolúvel, seguido de centrifugação a 21.000 x g por 10 min. Adicione este extrato ao lisado clarificado e às contas.
  9. Incube por 1-2 h em temperatura ambiente em um rotador de tubo.
  10. Centrifugue brevemente (<1s) o tubo para recuperar todo o líquido para o fundo do tubo, colete as esferas em um suporte magnético e, em seguida, substitua o sobrenadante (fluxo) pelo tampão de lavagem 1.
  11. Incube por 5 min em um rotador de tubo e repita como na etapa 4.10 para uma segunda lavagem.
  12. Troque o tampão de lavagem 1 pelo tampão de lavagem 2 por duas lavagens adicionais (lavagem 3 e 4).
  13. Troque o tampão de lavagem 2 pelo tampão de lavagem 3 por duas lavagens finais (lavagem 5 e 6).
  14. Depois de remover a lavagem final, armazene os grânulos a -20 °C antes do processamento a jusante.
    NOTA: Os grânulos podem ser eluídos com tampão Laemmli para análise de western blot e submetidos a serviços de espectrometria de massa para uma preparação de peptídeo no grânulo para identificação de proteínas.

Resultados

Nosso protocolo descreve um método simplificado para a introdução de uma modificação covalente da biotina nas proteínas nas proximidades de uma proteína alvo em Paramecium (Figura 1A). Essas proteínas biotiniladas podem então ser enriquecidas usando um pulldown de estreptavidina e identificadas usando espectrometria de massa20. Para demonstrar um caso de uso prático do método, aplicamos o protocolo à proteína Nowa1. Essa proteína é essencial para o processo de rearranjo genômico e apresenta alterações dinâmicas em sua localização12. Nos estágios iniciais, permanece no antigo núcleo somático e se fragmenta, mas depois está localizado no novo núcleo em desenvolvimento. Notavelmente, nossas tentativas anteriores de um enriquecimento mediado por tags das proteínas de interação Nowa1 não tiveram sucesso (resultados não publicados). Isso provavelmente se deveu às repetições complexas com semelhança com a proteína príon PrP27 que poderia causar autoagregação em condições não ideais durante o procedimento de pulldown21. A PCR amplificou a região codificante Nowa1 junto com sua região não codificante upstream contendo o promotor. O produto foi então inserido no quadro com uma sequência de codificação turboID otimizada para códon (Figura 1B). Para evitar o silenciamento induzido por transgênicos causado pela injeção de DNA circular em Paramecium, o vetor foi linearizado antes da injeção. O DNA linearizado e purificado foi então microinjetado no núcleo somático (MAC) conforme descrito neste protocolo. Uma gotícula dispersa confinada na região mais escura do núcleo somático tornou-se visível em algumas das injeções bem-sucedidas (Figura 1C). A injeção bem-sucedida e a amplificação do DNA pelas células durante a divisão celular foram então verificadas por PCR. Como esperado, 40-50% das células foram positivas para o DNA injetado da construção Nowa1 (tamanho esperado do produto 685 pb) (Figura 2). O próximo passo foi verificar a presença da proteína codificada pelo DNA injetado. Como o vetor receptor contém a sequência turboID ladeada por uma etiqueta tripla de HA, usamos coloração de imunofluorescência para detectar a marca. Isso nos permitiu verificar se as células injetadas estão expressando a proteína de fusão e se ela estava devidamente localizada. Usamos células em estágio avançado que mostraram localização da proteína de fusão nos dois novos núcleos em desenvolvimento, como observado anteriormente para a proteína Nowa1 do tipo selvagem12. As linhagens celulares individuais injetadas apresentaram diferentes níveis da proteína de fusão (Figura 3). Um nível de expressão mais baixo pode ser benéfico para aplicações onde o fundo reduzido é desejável, mas, neste caso, optamos pelo sinal máximo e prosseguimos com o clone 2, que apresentou a expressão mais alta. Em seguida, coletamos amostras durante diferentes estágios de desenvolvimento para rastrear a localização da proteína de fusão. A proteína foi inicialmente localizada nas meadas formadas a partir do antigo núcleo somático e nos fragmentos nucleares separados durante os estágios iniciais da autogamia. Após o aparecimento da anlagen nuclear, a proteína de fusão fez a transição para esses novos núcleos em desenvolvimento (Figura 4). Para promover a biotinilação do proteoma proximal nos diferentes estágios, suplementamos a cultura com 500 μM de biotina por 2 h antes da colheita das células para IF. Visualizamos as proteínas marcadas com biotina por meio de uma coloração IF usando uma estreptavidina marcada com fluorescência. O sinal observado correspondeu à localização da proteína de fusão marcada com HA. É importante ressaltar que foi possível obter uma localização de biotinilação específica para os diferentes estágios de desenvolvimento nuclear, pois mesmo uma incubação curta com biotina é suficiente para alcançar uma biotinilação significativa (Figura 4). Além disso, sem a adição de biotina suplementar, apenas a biotinilação insignificante foi detectável nas células injetadas. Em células do tipo selvagem, a adição de biotina suplementar não causou biotinilação detectável (Figura 5A). Notavelmente, a biotina não estava apenas se acumulando no núcleo em desenvolvimento, pois mesmo em condições de desnaturação, ela permanece ligada às proteínas. (Figura 5B). Usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina, foi possível enriquecer seletivamente as proteínas biotiniladas (Figura 6). As proteínas enriquecidas podem ser identificadas usando espectrometria de massa. Nesses experimentos subsequentes de identificação de proteínas, a cultura não suplementada, bem como as células que expressam uma proteína turboID não fundida, podem ser usadas como grupos de controle de fundo.

figure-results-1
Figura 1: Visão geral do procedimento de biotinilação por proximidade em P. tetraurelia. (A) Esboço generalizado do protocolo. (B) Princípio de clonagem para o vetor receptor turboID plug-and-play e a construção resultante para a proteína de fusão Nowa1. A região 3'UTR usada neste plasmídeo é derivada de CenH3a. (C) Gotícula difusa visível contida na área mais escura correspondente ao núcleo somático (MAC) após uma injeção bem-sucedida de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Teste de PCR para injeção bem-sucedida. Análise em gel de agarose da reação de PCR para um produto com um primer direto específico para a região a montante, codificação para resistência à ampicilina (amp start) e um primer reverso complementar ao Nowa1. A ponta da seta mostra o tamanho esperado do produto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Coloração por imunofluorescência para validar a localização correta da proteína de fusão turboID. Coloração por imunofluorescência usando anticorpo primário anti-HA de coelho (1:100) e anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 568 de cabra (1:1000) de linhagens monoclonais de Paramecium com sinal de PCR positivo para o DNA que codifica uma proteína de fusão Nowa1-HA-turboID. Escala 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Biotinilação específica de Nowa1 em diferentes estágios de desenvolvimento. Coloração por imunofluorescência da linha monoclonal 2 em estágios progressivos durante a formação do novo núcleo somático. O meio de cultura foi suplementado com 500 μM de biotina para atividade ideal de turboID. A marca HA foi detectada como na Figura 3, e a biotina foi detectada usando Streptavidin-FITC (1:200). Escala 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: A marcação de proximidade eficiente por turboID requer biotina suplementar na cultura. (A) Coloração por imunofluorescência de células wt e injetadas no estágio final de desenvolvimento mostrando a expressão de Nowa1-HA-turboID e a biotinilação observada com 500 μM de biotina suplementar. HA-tag e biotina foram detectados como na Figura 4. Escala 20 μm. (B) Análise de Western blot para biotina usando HRP-estreptavidina de células wt cultivadas com 500 μM de biotina e células injetadas turboID com e sem biotina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Enriquecimento de proteínas biotiniladas com esferas magnéticas de estreptavidina. Análise de Western blot para biotina de amostras de um experimento pulldown usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. As amostras são: Nowa1-HA-turboID lisado de células (entrada), a fração não ligada (fluxo), as etapas de lavagem (lavagem 1-6) e as proteínas ligadas aos grânulos (saída). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve uma técnica para anexar uma porção de biotina às proteínas nas proximidades da proteína de interesse. Com base na forte afinidade da estreptavidina pela biotina, isso permite o enriquecimento rápido e eficiente das proteínas modificadas. Aliado à rápida adaptabilidade para diferentes proteínas de interesse, o método apresentado pode facilitar os estudos de interações multiproteicas em Paramecium. Este organismo modelo está bem estabelecido para pesquisas sobre as interações transposon-hospedeiro durante a reprodução meiótica3. Além disso, pode oferecer novas ferramentas moleculares para edição precisa do genoma, pois extirpa mais de 45.000 sequências durante seus rearranjos genômicos programados. O processo é orquestrado por uma maquinaria complexa de vários componentes que permite uma excisão precisa direcionada por RNA desses fragmentos de DNA com um local de clivagem reproduzível a cada geração. O método apresentado aqui oferece duas grandes vantagens para o estudo desse processo. Simplifica a descoberta de interações proteína-proteína transitórias. Além disso, o vetor receptor plug-and-play permite a criação rápida de muitas proteínas de fusão funcionais. Como vários fatores provavelmente estão envolvidos no processo em diferentes estágios, a adaptabilidade permite a descoberta dos interactomas de muitas proteínas que podem fazer parte da maquinaria de excisão. É importante ressaltar que as construções de fusão são expressas a partir do promotor do gene endógeno e, portanto, correspondem estreitamente ao curso do tempo de expressão nativa. Além disso, o uso demonstrado de microinjeção para a entrega de material genético exógeno a este organismo modelo permite a geração de populações monoclonais homogêneas. Tais populações permitem uma iniciação mais síncrona do processo de autogamia, durante o qual ocorre o desenvolvimento de um novo núcleo somático.

Embora o procedimento demonstrado para introduzir as construções de fusão turboID seja robusto, uma otimização específica pode ser necessária nos protocolos de enriquecimento de proteínas a jusante, devido ao mecanismo de biotinilação. Uma vez que a enzima turboID fundida gera porções reativas de biotina-AMP que se difundem para longe da enzima, elas podem potencialmente reagir com qualquer porção nucleofílica nas proximidades. Assim, uma etapa essencial nesta metodologia é a identificação dos verdadeiros parceiros de interação a partir dos hits de fundo e das proteínas localizadas na vizinhança geral da proteína de fusão turboID, que não são os parceiros de interação reais. Para isso, uma variação de parâmetros pode ser ajustada, como a duração da incubação com biotina16. Além disso, uma configuração experimental que inclui um grupo de controle sem biotina suplementar no meio pode indicar a ligação de fundo. Conforme demonstrado, esse grupo de controle será geneticamente idêntico ao experimento real, mas a biotinilação por turboID é fortemente reduzida devido à baixa abundância de biotina. Grupos de controle importantes adicionais podem incluir uma proteína turboID não fundida, bem como um grupo do tipo selvagem, ambos cultivados no meio suplementado com biotina. Além disso, embora a forte afinidade da estreptavidina pela biotina seja uma vantagem significativa sobre os pulldowns baseados em anticorpos, diferentes concentrações de sal e detergente provavelmente influenciam a pureza e a eficiência do enriquecimento.

Abordagens proteômicas superiores podem aumentar nossa compreensão das máquinas moleculares únicas do Paramécio e, potencialmente, de outros ciliados. Componentes moleculares com novas funções prometem ser reaproveitados como ferramentas em biologia sintética e, assim, podem promover desenvolvimentos biotecnológicos22,23. As proteínas sintéticas projetadas geralmente consistem em combinações de domínios funcionais com novas propriedades que permitem aplicações terapêuticas anteriormente impraticáveis. As proteínas modificadas também podem ser usadas em processos de produção farmacêutica24. O sistema de excisão do genoma dirigido por RNA de Paramecium é de particular interesse para tais desenvolvimentos. Este sistema consegue a excisão dependente de RNA de milhares de fragmentos de DNA, com uma precisão de até o único nucleotídeo25. Tais parâmetros tornam interessante melhorar a precisão da edição do genoma em células humanas. O método de biotinilação de proximidade apresentado pode ser usado para acelerar e promover a descoberta de novos componentes proteicos e suas interações dentro de máquinas moleculares multiproteicas.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa DigiK da Universidade de Berna e uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências da Suíça 229074 concedida a B.-A.S. e 214853 de subsídios da Fundação Nacional de Ciências da Suíça concedidos a M.N.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio Axiovert 40 CFL (lentes 10x, 40x)Zeissna
b-sitosterolSigma Aldrich567152
albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichRolamento A9647
Óleo CellTramEpendorfna
sequência de DNA 3xHA-turboID otimizada para códonsBiociência de torçãonaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTCTCCTTTTTTbr
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPISigma AldrichD9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
Pontas do microcarregador epT.I.P.S.Ependorf5242956003
EtanolGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfna
Femtotip IICalibre Científico5242957000
Solução de formaldeídoSigma AldrichRolamento F8775
GlicinaAplicação10021259
Anticorpo IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
mAB de coelho HA-tag (C29F4)sistemas celulares3724
InjectMan NI 2Ependorfna
médio claronana0,2x solução de pó de grama de trigo em 2,5 mM Na2HPO4
Óleo mineralSigma AldrichM8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Fenol-clorofórmio-isoamilalkoholSigma Aldrich77617
solução salina tamponada com fósforoFischer Scientific10722497
Kit de plasmídeo mais midiprepQiagene12945
meio riconana1x solução de pó de grama de trigo em 2,5 mM Na2HPO4
Estreptavidina-FITCThermo Fisher Científico11-4317-87
Filtro centrífugo Ultrafree-MC GV EMD MiliporeUFC30GV00
solução de lavagemnana0,1% BSA em água Volvic;
solução de grama de trigo em póPinheiros internacionaisnaPrepare como um caldo 20x do pó conforme descrito anteriormente (0,5g / 10mL)
Streptavidin-HRPabcamAB7403
Grânulos magnáticos revestidos com estreptavidinaSigma AldrichLSKMAGT02
Tampão de lise para pulldownnana50 mM Tris pH 8; NaCl 150 mM; 0,5% de desoxicolato de sódio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x inibidor de protease completa (Roche);  
Tampão de lavagem 1 para pulldownnana50 mM Tris pH 8; NaCl 150 mM; 0,5% de desoxicolato de sódio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;
Tampão de lavagem 2 para pulldownnana10 mM Tris pH 7,4; NaCl 150 mM; 0,01% NP40; 1 mM MgCl2
Tampão de lavagem 3 para pulldownnana10 mM Tris pH 7,4; NaCl 150 mM;

Referências

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Marca o com BiotinaLigase TurboIDMicroinje o de DNAColora o por Imunofluoresc nciaEsferas de EstreptavidinaWestern BlotEnriquecimento Proteico
In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.