Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir o sequenciamento do genoma completo de infecções bacterianas sexualmente transmissíveis a partir de amostras clínicas usando enriquecimento alvo. Este novo método baseado em painel sindrômico supera os desafios de DNA humano abundante e baixas cargas bacterianas, facilitando a vigilância genômica para Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium.

Resumo

A obtenção de genomas completos de infecções bacterianas sexualmente transmissíveis (DSTs) diretamente de amostras clínicas é um desafio devido à presença de DNA humano, microbiota e cargas muito baixas de patógenos bacterianos. A cultura muitas vezes não é uma opção, pois essas espécies são exigentes e a maioria das amostras é coletada em meios de transporte que lisam os microrganismos, tornando-as inviáveis para o cultivo. Para resolver esses problemas, usamos um painel de sonda projetado em quatro espécies para gerar sequências de genoma completo de DSTs bacterianas e realizamos o enriquecimento do alvo, um procedimento de hibridização de dois a três dias antes do sequenciamento do genoma. Nossos resultados iniciais produziram excelentes dados genômicos usando amostras para as quais o sequenciamento direto não foi bem-sucedido. O enriquecimento do alvo provou ser altamente eficaz para o sequenciamento de genomas de DSTs bacterianas, particularmente quando a carga de patógenos era alta (Ct < 30). As amostras testadas contendo Mycoplasma genitalium frequentemente apresentaram valores de Ct acima de 30, levando a menores taxas de sucesso na recuperação do genoma; melhorias foram observadas após a otimização da temperatura de hibridização de 65 °C para 62,5 °C. Além de permitir a vigilância genômica, a disponibilidade de genomas completos pode fornecer informações valiosas sobre a resistência antimicrobiana, como a identificação de determinantes de resistência adquirida associados a Neisseria gonorrhoeae. Este método já levou à identificação de uma nova linhagem de linfogranuloma venéreo de Chlamydia trachomatis em Buenos Aires, ompA-genótipo L4, destacando o potencial desta abordagem para descobrir uma nova diversidade genômica e melhorar a vigilância de IST.

Introdução

O advento das técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) facilitou o sequenciamento do genoma completo bacteriano (WGS), permitindo o sequenciamento de isolados clínicos dentro de muitas espécies de patógenos bacterianos humanos. A tecnologia permitiu inúmeros estudos comparativos por meio da geração de genomas completos em uma escala sem precedentes. Isso teve um grande impacto na microbiologia clínica e de saúde pública, pois o acesso a dados do genoma de amostras clínicas por meio do WGS permite a tipagem e a detecção de genes de resistência antimicrobiana. Além disso, as abordagens metagenômicas permitem a detecção direta de patógenos associados à doença a partir de amostras clínicas. Essas informações criam novas oportunidades para estratégias de tratamento personalizadas para os pacientes. Além disso, o WGS é uma ferramenta poderosa que fornece informações sobre a evolução das cepas circulantes de um patógeno específico, bem como seus padrões de transmissão, permitindo que as autoridades de saúde pública entendam e respondam melhor aos surtos de patógenos ^1,2,3.

Para obter qualidade de sequenciamento suficiente para WGS, o isolamento bacteriano por meio de cultura é normalmente necessário para obter as quantidades de DNA microbiano necessárias ^4,5,6. Isso representa um fator limitante para os organismos que são difíceis de cultivar, aqueles que não podem ser cultivados devido ao processamento de amostras diagnósticas não viáveis ou aqueles expostos a antibióticos durante o tratamento do paciente. Exemplos de tais microrganismos difíceis de cultivar incluem patógenos bacterianos sexualmente transmissíveis, como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Essas espécies são difíceis de cultivar devido a vários fatores, incluindo sua natureza intracelular, fragilidade, requisitos de crescimento exigentes e taxas de replicação lentas. Por essas razões, o desenvolvimento e a implementação de técnicas que permitem o WGS apesar do baixo conteúdo de DNA - como é frequentemente o caso em amostras de pacientes - é crucial para a realização de análises genômicas em ambientes clínicos.

O enriquecimento do alvo é o método mais promissor para o sequenciamento do genoma quando o DNA microbiano é escasso¹⁰. Por exemplo, no contexto de patógenos que causam infecções sexualmente transmissíveis (DSTs), apenas uma pequena fração do DNA presente em uma amostra de paciente se origina do patógeno. No caso de infecções por C. trachomatis, descobriu-se que o DNA do patógeno compreende até um máximo de 0,6% do DNA total, mas os valores são tipicamente muito mais baixos¹¹. O método de enriquecimento alvo consiste em capturar seletivamente o DNA microbiano de interesse antes do NGS. Isso é obtido usando sondas de RNA marcadas com biotina especificamente projetadas que são complementares ao DNA microbiano alvo. A ligação do adaptador é realizada para gerar uma biblioteca genômica, antes da hibridização, durante a qual essas sondas se ligam ao DNA microbiano complementar. Posteriormente, esferas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas para capturar os complexos de ácidos nucléicos marcados com biotina, explorando a forte interação biotina-estreptavidina. Finalmente, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) amplifica os fragmentos de DNA selecionados. Essas etapas conceituais importantes são necessárias para entender a estratégia de enriquecimento alvo. No entanto, etapas processuais adicionais, como lavagem e controle de qualidade, também estão envolvidas no protocolo completo^10,12.

Antes de iniciar o protocolo de sequenciamento, é importante avaliar a quantidade de DNA de entrada e garantir que as condições em todo o fluxo de trabalho preservem sua integridade. De acordo com as recomendações do fabricante, o protocolo padrão requer 10-200 ng de DNA em um volume de 7 μL, o que corresponde a uma faixa de concentração de aproximadamente 1,4 a 28,6 ng/μL. Quando a concentração de DNA é menor, recomenda-se uma versão modificada do protocolo usando 17 μL, permitindo concentrações entre 0,6 e 11,8 ng/μL, mantendo a quantidade de entrada necessária¹². Dadas as baixas concentrações frequentemente obtidas de amostras clínicas, implementamos rotineiramente a variante do protocolo de 17 μL. O desempenho da hibridização e do sequenciamento está associado à qualidade do DNA, ressaltando a importância de condições adequadas de armazenamento e transporte de amostras para preservar a integridade do ácido nucleico. Portanto, práticas de manuseio adequadas, como estabilização do meio de coleta, processamento rápido, manutenção das condições da cadeia de frio e minimização dos ciclos de congelamento e descongelamento, são medidas importantes para otimizar a qualidade do DNA. Assim como as concentrações de DNA necessárias, o comprimento do fragmento de DNA é um indicador de integridade. Recomendamos minimizar a degradação do DNA durante o manuseio e armazenamento da amostra para obter fragmentos mais longos e otimizar os resultados do sequenciamento. Isso é particularmente relevante em ambientes clínicos, onde a variabilidade nos métodos de coleta, meio e manuseio é comum. Aplicamos com sucesso este protocolo ao DNA extraído do meio 2-SP e do meio de transporte NAAT, com comprimentos médios de fragmentos de até 1kb, conforme detalhado nos resultados representativos. Finalmente, o sequenciamento bem-sucedido foi definido como alcançar mais de 95% de cobertura do genoma com uma profundidade média de leitura superior a 10x¹⁰.

Até o momento, o enriquecimento alvo tem sido aplicado com sucesso por vários grupos de pesquisa a uma ampla gama de microrganismos e vírus, incluindo patógenos causadores de DSTs, norovírus, vírus de gado e patógenos de plantas 10,13,14,15,16. No entanto, até agora, o projeto da sonda geralmente tem sido restrito a patógenos únicos, em vez de um painel direcionado a genomas completos de vários patógenos ligados sindrômicos. Os alvos ideais são organismos com genomas pequenos e conservados, que de fato incluem C. trachomatis, T. pallidum e M. genitalium. Embora N. gonorrhoeae tenha um genoma mais diversificado e um pan-genoma maior, as sondas para cobri-lo ainda podem ser racionalizadas em um projeto com as outras três bactérias. Há alguma divergência em %G+C entre essas bactérias e outras que podem estar sindrômicas ligadas, o que significa que as condições podem precisar ser otimizadas.

O objetivo deste protocolo é obter genomas completos diretamente de amostras clínicas para permitir análises filogenéticas e epidemiológicas. Demonstramos uma estratégia nova e eficaz usando um painel de sonda adaptado a C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium para recuperar genomas completos usando DNA extraído de amostras clínicas, como swabs urogenitais e anorretais. Essa abordagem tem se mostrado bem-sucedida e foi aplicada na caracterização do surto de linfogranuloma venéreo (LGV) em Buenos Aires, possibilitando a descrição de uma nova linhagem de C. trachomatis LGV^10,13.

O procedimento de enriquecimento do alvo será descrito, incluindo o uso de um método de captura de DNA disponível comercialmente com agrupamento pós-captura para sequenciamento de próxima geração (NGS) empregado para obter genomas completos diretamente de amostras clínicas de pacientes diagnosticados com C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e/ou M. genitalium Infecções. Para obter o sucesso ideal, recomenda-se selecionar amostras com um valor de Ct abaixo de 30, pois valores mais altos de Ct refletem cargas de patógenos mais baixas e são menos propensos a produzir genomas completos. O extrato de DNA para o método pode ser obtido a partir de amostras clínicas de vários tipos de amostras e meios de coleta. Os procedimentos de extração de DNA podem ser realizados manualmente ou com sistemas automatizados, usando kits projetados para o isolamento de DNA de patógenos ou vírus de amostras de swab humano (consulte a Tabela de Materiais).

O conjunto de sondas usado no procedimento de enriquecimento alvo (ver Tabela de Materiais) foi projetado especificamente para capturar a diversidade genômica de C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium. Sondas personalizadas foram geradas usando vários genomas completos para cada espécie, otimizando a cobertura de seus pan-genomas conhecidos¹⁰. Os critérios de projeto incluíram uma homologia mínima de sequência de 90% para as sequências de referência e uma frequência de ladrilhos de 1x-2x para aumentar a eficiência da captura do alvo. Para otimizar a relação custo-benefício, o algoritmo usado no projeto da sonda minimizou o número de sondas, mantendo uma representação genômica abrangente. O conjunto final de sondas consistiu em 242.000 sondas para os projetos multiplex direcionados a C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium e T. pallidum. Todo o protocolo de enriquecimento alvo pode ser realizado em 2 ou 3 dias. Indicações claras de pontos de parada são fornecidas para as opções de fluxo de trabalho de dois e três dias.

DECLARAÇÃO DE ÉTICA
Este estudo propõe melhorias metodológicas com base em protocolos publicados anteriormente^10,13. Os procedimentos descritos envolvem apenas amostras não identificadas e não incluem dados do paciente; portanto, não foi necessária aprovação ética específica para os aspectos metodológicos. Os resultados representativos foram obtidos a partir de dois conjuntos de amostras previamente estudadas: amostras argentinas coletadas sob o protocolo aprovado Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, aprovação nº 201723), com consentimento informado por escrito obtido de todos os participantes; e amostras finlandesas anônimas, para as quais nenhuma aprovação ética específica foi necessária. Antes do envio do banco de dados de quaisquer dados de sequenciamento resultantes, as leituras humanas precisam ser removidas.

Protocolo

NOTA: O espaço de trabalho deve ser dividido em uma zona pré-PCR (espaço de trabalho livre de amplicon) e uma zona pós-PCR (espaço de trabalho de manuseio de amplicon) para evitar contaminação. A menos que explicitamente declarado de outra forma, todas as etapas devem ser executadas em um dos dois espaços de trabalho controlados. Todas as misturas principais e misturas de reação de PCR devem ser preparadas no espaço de trabalho livre de amplicon, enquanto todas as etapas subsequentes envolvendo DNA amplificado devem ser conduzidas no espaço de trabalho de manuseio de amplicon. Todas as quantidades neste protocolo são calculadas para processar oito amostras.

1. Fragmentação do DNA

1. Medir a concentração de ADN dos extractos de ADN de amostras clínicas contendo ADN (ADN) do agente patogénico-alvo utilizando um método sensível, exacto e baseado em fluorescência (ensaio de ADN de fita dupla [dsDNA], utilizando 1 μL de amostra, com um intervalo de detecção até 120 ng/μL; ver Tabela de Materiais). Este método de quantificação é usado de forma consistente em todo o protocolo sempre que a concentração de DNA é medida.
2. Diluir cada amostra de DNA a uma concentração de 10 - 200 ng usando água livre de nuclease, garantindo um volume final de 17 μL em cada tira de tubo de PCR. Para obter os melhores resultados de sequenciamento, use a maior quantidade possível de DNA de entrada dentro do intervalo recomendado.
   NOTA: Nos casos em que a concentração total de DNA está abaixo do mínimo recomendado de 10 ng em 17 μL, a suplementação com DNA de fundo (por exemplo, DNA genômico humano) pode ser usada para atender aos requisitos de entrada, conforme sugerido pelo fabricante. Isso pode ajudar a estabilizar a reação de preparação da biblioteca e melhorar o desempenho do sequenciamento em amostras clínicas de baixa entrada.
3. Descongele o tampão de fragmentação (5x), o vórtice e coloque no gelo.
4. Programe o termociclador de acordo com a Tabela 1. Inicie o programa e pause imediatamente.
   NOTA: A duração da etapa de incubação de 37 °C pode variar dependendo do tamanho inicial do fragmento de DNA e do comprimento de leitura NGS desejado. Para amostras de DNA de alta qualidade, recomenda-se um tempo de incubação de 15 min para obter fragmentos de 150 a 200 pb adequados para 2 leituras de 100x e 10 min para obter fragmentos de 180 a 250 pb para 2 leituras de 150x.
5. Recupere os frascos necessários para a mistura mestre de fragmentação do armazenamento a -20 ° C. Prepare a mistura principal com base na Tabela 2. Sele o tubo e o vórtice em alta velocidade por 5 a 10 s. Gire brevemente para remover as bolhas e manter a mistura principal no gelo.
6. Adicione 3 μL de mistura mestre de fragmentação a cada poço contendo 17 μL de DNA de entrada. Misture pipetando para cima e para baixo 20x, sele a tira do tubo de PCR, vórtice em alta velocidade por 5-10 s e gire brevemente.
7. Coloque a tira do tubo PCR no termociclador (consulte a Tabela de Materiais) e retome o programa ilustrado na Tabela 1 no início da etapa 1.
8. Quando a etapa de retenção de 4 °C for atingida, remova a tira do tubo PCR do termociclador e adicione 30 μL de água livre de nuclease. Coloque a tira do tubo PCR no gelo.

Tabela 1: Programa termociclador para fragmentação enzimática. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Preparação do Master Mix de Fragmentação Clique aqui para baixar esta Tabela.

2. Preparação da biblioteca

1. Preparação do master mix de ligadura
   NOTA: A mistura master de ligadura deve ser preparada neste ponto porque precisa de 30-45 min para equilibrar a temperatura ambiente.
   1. Recupere o tampão de ligadura do armazenamento de -20 ° C e descongele no gelo. Recupere a DNA ligase T4 do armazenamento a -20 ° C, misture invertendo o frasco e mantenha no gelo.
   2. Prepare a mistura principal de ligação de acordo com a Tabela 3. Sele o tubo e o vórtice em alta velocidade por 10-20 s, gire brevemente e mantenha em temperatura ambiente por 30-45 min antes de usar.
2. Reparo final e fragmentos de cauda dA
   1. Programe o termociclador de acordo com a Tabela 4.
   2. Recupere o tampão de rejeito de reparo final do armazenamento de -20 °C e descongele no gelo. Depois de descongelado, vórtice em alta velocidade, gire brevemente. Recupere a mistura de enzimas de rejeito de reparo final, misture invertendo o frasco e mantenha no gelo.
   3. Prepare a mistura mestre de reparo final/rejeito de dA de acordo com a Tabela 5 (consulte a Tabela de Materiais). Misture selando firmemente o tubo e o vórtice em alta velocidade por 10-20 s, gire brevemente e mantenha no gelo.
   4. Pipetar 20 μL de mistura principal de reparo final/rejeito de dA em cada poço contendo 50 μL de fragmentos de DNA (das etapas 1.1-1.8). Sele a tira do tubo de PCR, misture bem por vórtice em alta velocidade por 5-10 s. Gire brevemente a tira do tubo PCR e coloque-a no termociclador. Retomar o programa da Tabela 4.
3. Ligação de adaptadores marcados com MBC
   1. Assim que o programa na Tabela 4 concluir sua etapa final, coloque a tira do tubo de PCR no gelo. Configure o termociclador de acordo com os parâmetros da Tabela 6. Inicie o programa e pause-o imediatamente.
   2. Adicionar 25 μL de mistura principal de ligação à temperatura ambiente a cada amostra preparada no passo 2.1. Sele a tira do tubo de PCR, vórtice por 5-10 s e gire brevemente.
   3. Recupere a mistura de oligo adaptador para bibliotecas marcadas com MBC (consulte Tabela de materiais) do armazenamento a -20 °C e descongele no gelo. Depois de descongelado, vórtice em alta velocidade por 5-10 s. Gire brevemente e mantenha no gelo.
   4. Adicione 5 μL de mistura de oligo adaptador para bibliotecas marcadas com MBC a cada amostra. Sele a tira do tubo PCR e o vórtice em alta velocidade por 5-10 s, gire brevemente. Coloque imediatamente a tira de tubo PCR no termociclador e continue executando o programa conforme especificado na Tabela 6.
4. Limpeza da ligadura
   1. Realize a purificação do DNA usando esferas magnéticas. Retire as esferas do armazenamento a 4 °C e deixe-as atingir a temperatura ambiente antes de usar.
   2. Prepare 4 mL de etanol a 70% usando água livre de nuclease. Mantenha em temperatura ambiente.
      NOTA: É altamente recomendável preparar uma solução de etanol a 70% para uso nas etapas de limpeza para garantir o desempenho ideal. Para preparação de etanol a 70%, use água sem nuclease imediatamente antes de usar.
   3. Vortex a suspensão do grânulo magnético completamente até que a mistura esteja uniforme e a cor pareça consistente.
   4. Quando o programa na Tabela 6 atingir a etapa de retenção de 4 °C, transfira a tira de tubo PCR do termociclador para a temperatura ambiente. Adicione 80 μL de suspensão de grânulos a cada poço. Sele a tira do tubo PCR e o vórtice por 5-10 s, gire brevemente.
   5. Incube as suspensões de esferas por 5 min em temperatura ambiente. Transfira a tira do tubo PCR para um suporte magnético (consulte a Tabela de Materiais) e aguarde 5-10 min até que a solução fique límpida.
   6. Enquanto mantém a tira do tubo de PCR no suporte magnético, remova e descarte cuidadosamente a solução limpa de cada poço, evitando o contato com os grânulos.
   7. Com a tira do tubo PCR no suporte magnético, realizar duas lavagens com etanol a 70% da seguinte forma: adicionar 200 μL de etanol a 70% a cada amostra. Aguarde 1 min e remova o etanol 70%. Evite tocar nas esferas ao remover a solução.
   8. Após a segunda lavagem, sele a tira do tubo de PCR e gire brevemente as amostras para coletar o etanol residual. Coloque a tira do tubo PCR no suporte magnético por 30 s.
   9. Remova o etanol coletado, evitando tocar nas contas. Para remover o etanol residual, remova a tira do tubo PCR do suporte magnético e mantenha sem vedação (de preferência dentro de uma coifa) por até 5 min. Certifique-se de que as contas estejam totalmente secas, mas não rachadas na aparência; Isso reduziria a eficiência do processo de eluição.
   10. Eluir o DNA adicionando 35 μL de água livre de nuclease a cada poço de amostra. Misture bem pipetando para cima e para baixo 10x-15x, sele os tubos e vortex por 5-10 s. Confirmar a ausência de aglomerados visíveis. Caso haja algum, vórtice até dissolver.
   11. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque a tira do tubo PCR em um suporte magnético e espere aproximadamente 5 minutos até que a solução desapareça.
   12. Remova cuidadosamente o sobrenadante limpo (~ 34 μL) de cada poço e transfira para um poço correspondente em uma nova tira de tubo de PCR. Mantenha as amostras no gelo e descarte as contas.
       NOTA: Para um protocolo de 3 dias, isso marca o fim do Dia 1. Conservar as amostras a 4 °C durante a noite.
5. Amplificação e índice duplo
   NOTA: Selecione o par de primers de índice apropriado para cada amostra para garantir a identificação adequada durante o sequenciamento. Cada sequência de índice consiste em uma tag de 8 pb incorporada aos primers usados para a amplificação das bibliotecas de pré-captura.
   1. Recupere o tampão de DNA polimerase de alta fidelidade com dNTPs (5x) do armazenamento a -20 °C e descongele no gelo. Recupere os primers de sequenciamento indexados selecionados do armazenamento a -20 ° C e mantenha no gelo.
      NOTA: Certifique-se de registrar o código de barras específico atribuído a cada amostra para identificação e rastreabilidade precisas durante todo o processo de sequenciamento.
   2. Programe o termociclador de acordo com a Tabela 7. Inicie o programa e pause imediatamente.
      NOTA: O fabricante recomenda a realização de 8 a 14 ciclos de PCR pré-captura, dependendo da qualidade e quantidade do DNA de entrada. Nesse protocolo, foram implementados 11 ciclos seguindo as recomendações do fabricante, resultando em dados de sequenciamento de alta qualidade^10,12.
   3. Recupere a enzima de fusão de alta fidelidade para amplificação por PCR do armazenamento a -20 °C. Pipete a enzima para cima e para baixo para misturar, evitando agitação excessiva, e vortex o tampão DNA polimerase de alta fidelidade para garantir a homogeneidade. Preparar a mistura de reação PCR pré-captura (conforme descrito no quadro 8). Vortex a mistura final e gire brevemente para baixo, mantenha no gelo.
   4. Dispense 11 μL da mistura de reação de PCR pré-captura (preparada conforme descrito na Tabela 8) em cada poço de amostra contendo a biblioteca de DNA purificada. Adicione 5 μL do par de primers índice selecionado a cada reação. Sele a tira do tubo PCR e o vórtice por 5 s e, em seguida, gire rapidamente para baixo.
   5. Retome o programa do termociclador conforme especificado na Tabela 7. Quando a temperatura atingir 98 °C, coloque a tira do tubo PCR no termociclador e feche bem a tampa.
6. Limpeza da biblioteca
   1. Deixe os grânulos magnéticos se equilibrarem à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos antes de usar. Prepare 4 mL de etanol a 70% usando água livre de nuclease. Mantenha em temperatura ambiente.
   2. Vortex a suspensão do grânulo magnético completamente até que a mistura esteja uniforme e a cor pareça consistente.
   3. Quando o programa na Tabela 7 atingir a etapa de retenção de 4 °C, transfira a tira de tubo PCR do termociclador para a temperatura ambiente. Adicione 50 μL de suspensão de cordão a cada amostra. Sele a tira do tubo PCR e o vórtice por 5-10 s, gire brevemente (sem peletizar as esferas magnéticas).
   4. Incube as suspensões de esferas por 5 min em temperatura ambiente. Transfira a tira do tubo PCR para um suporte magnético e espere 5-10 min até que a solução fique clara.
   5. Enquanto mantém a tira do tubo PCR no suporte magnético, remova e descarte cuidadosamente a solução transparente de cada poço. Evite tocar nas esferas ao remover a solução.
   6. Com a tira do tubo PCR no suporte magnético, faça duas lavagens com etanol a 70% da seguinte maneira. Adicione 200 μL de etanol a 70% a cada amostra. Aguarde 1 min e remova o etanol 70%. Evite tocar nas esferas ao remover a solução.
   7. Após a segunda lavagem, sele a tira do tubo de PCR e gire-a brevemente para coletar o etanol residual. Coloque a tira do tubo PCR no suporte magnético por 30 s. Remova o etanol residual, evitando tocar nos grânulos.
   8. Para remover o etanol residual, remova a tira do tubo PCR do suporte magnético e mantenha sem vedação (de preferência dentro de uma coifa) por até 5 min. Certifique-se de que as esferas estejam totalmente secas, mas não rachadas, pois isso reduziria a eficiência do processo de eluição.
   9. Eluir o DNA da biblioteca adicionando 15 μL de água livre de nuclease a cada tubo de amostra. Misture bem pipetando para cima e para baixo 10x-15x, sele a tira do tubo PCR e vore por 5-10 s. Confirmar a ausência de aglomerados visíveis. Caso haja algum, vórtice até dissolver.
   10. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque a tira do tubo PCR em um suporte magnético e espere aproximadamente 5 minutos até que a solução desapareça.
   11. Remova cuidadosamente o sobrenadante limpo (~ 15 μL) de cada poço e transfira para um poço correspondente em uma nova tira de tubo de PCR. Mantenha as amostras no gelo e descarte as contas.
7. Controle de qualidade
   1. Meça a concentração de DNA do DNA purificado da biblioteca. Devido à maior sensibilidade, use um método baseado em fluorescência para quantificar o DNA em 1 μL.

Tabela 3: Preparação do master mix de ligadura. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Programa de termociclador para reparo final / rejeito dA. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Preparação do reparo final/mistura mestre de rejeitos dA. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 6 Programa termociclador para ligadura. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 7: Programa termociclador de PCR pré-captura. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 8: Preparação da mistura de reação de PCR pré-captura. Clique aqui para baixar esta tabela.

3. Hibridização/captura de amostras

1. Bibliotecas de hibridização para sondar
   1. Programe o termociclador de acordo com a Tabela 9. Inicie o programa e pause imediatamente.
      NOTA: O fabricante recomenda uma temperatura de hibridização de 65°C. Essa temperatura foi reduzida para 62,5 °C, resultando em melhores resultados.
   2. Recupere o tampão de hibridização do armazenamento a -20 °C, descongele no gelo e mantenha em temperatura ambiente até o uso. Recupere o bloqueador de RNase e a mistura de bloqueadores de oligonucleotídeos do armazenamento a -20 ° C e descongele no gelo. Mantenha esses frascos no gelo até o uso.
   3. Calcule o volume necessário para que cada amostra contenha 500-1000 ng de biblioteca de DNA, com base na concentração de DNA medida na etapa 2.7. Transfira o volume calculado para uma nova tira de tubo de PCR e ajuste o volume total para 12 μL com água livre de nuclease.
   4. Vórtice e gire rapidamente a mistura de bloqueadores de oligonucleotídeos. Adicionar 5 μL a cada tubo de amostra. Sele a tira do tubo PCR e transfira para o termociclador. Retome o programa de ciclagem térmica descrito na Tabela 9 e execute até a Etapa 3, onde reagentes adicionais precisam ser adicionados diretamente aos poços de amostra no termociclador.
   5. Prepare a solução em bloco de RNase a 25% de acordo com a Tabela 10. Sele o tubo e o vórtice em alta velocidade por 10-20 s, gire brevemente e mantenha no gelo até o uso.
      NOTA: Evite a exposição prolongada de soluções contendo sonda à temperatura ambiente. Mantenha em temperatura ambiente apenas durante as etapas de preparação.
   6. Recupere o frasco da sonda do armazenamento a -80 °C e mantenha o frasco em um rack de resfriamento enquanto não estiver em uso. Transfira para o gelo para descongelar. Recomenda-se que as sondas sejam usadas conforme fornecidas, mas podem ser diluídas se testadas^10,13.
   7. Quando todos os reagentes listados na Tabela 11 atingirem a temperatura ambiente, combine-os para preparar a mistura de hibridização da sonda. Misture a solução por vórtice em alta velocidade por 5 s, gire para baixo brevemente e prossiga imediatamente para a próxima etapa.
   8. Quando o termociclador atingir a Etapa 3 do programa descrito na Tabela 9, adicione 13 μL da mistura de hibridização da sonda à temperatura ambiente a cada poço de amostra, mantendo os tubos no termociclador durante todo o processo. Misture bem pipetando para cima e para baixo lentamente 8x-10x.
   9. Sele com segurança a tira do tubo PCR, faça um vórtice breve e gire os tubos. Certifique-se de que não haja bolhas e, em seguida, devolva imediatamente os tubos de tira ao termociclador. Verifique novamente se os tubos estão devidamente selados.
   10. Retome o programa de ciclagem térmica para realizar a hibridização das amostras de DNA da biblioteca preparadas com as sondas. A hibridização prossegue durante a noite
       NOTA: Para um protocolo de 2 dias, isso marca o fim do Dia 1. Para um protocolo de 3 dias, isso marca o fim do Dia 2.
2. Preparação de grânulos de estreptavidina
   1. Retirar as esferas magnéticas revestidas de estreptavidina (esferas de estreptavidina) do armazenamento a 4 °C. Vortex o frasco completamente para garantir que as contas sejam totalmente ressuspensas. A suspensão deve ser homogénea.
   2. Para cada amostra de hibridização, transfira 50 μL dos grânulos totalmente ressuspensos para tubos individuais de uma nova tira de tubo de PCR.
   3. Lave as esferas de estreptavidina da seguinte maneira: adicione 200 μL de tampão de ligação a cada tubo, misture pipetando para cima e para baixo. Sele os tubos, vortex em alta velocidade por 5-10 s e gire para baixo brevemente. Coloque a tira de tubo PCR em um suporte magnético. Deixe a solução repousar durante 5 min, depois retire e elimine cuidadosamente o sobrenadante. Repita as etapas 2x, completando um total de três lavagens.
   4. Ressuspenda os grânulos em 200 μL de tampão de ligação.
3. Captura de bibliotecas hibridizadas
   1. Assim que o programa de ciclagem térmica de hibridização indicado na Tabela 9 tiver concluído sua etapa final, transfira a tira do tubo PCR para a temperatura ambiente.
   2. Transfira todo o volume (~ 30 μL) de cada tubo para os tubos correspondentes contendo 200 μL de grânulos de estreptavidina pré-lavados. Misture bem pipetando para cima e para baixo 5x-8x e, em seguida, feche bem o tubo de tira.
   3. Coloque o tubo de tira em um misturador de placas de 96 poços e misture vigorosamente a 1800 rpm por 30 min em temperatura ambiente. Garanta a mistura adequada do líquido dentro dos poços.
      NOTA: Se um misturador de placas de 96 poços não estiver disponível ou as amostras não estiverem se misturando de forma eficaz, considere métodos alternativos, como prender os tubos de tira horizontalmente na superfície superior do misturador ou usar um agitador com temperatura controlada (com opção de aquecimento desligada) para garantir a agitação completa da amostra.
   4. Durante este tempo de incubação, prepare seis alíquotas de 200 μL de tampão de lavagem de alta temperatura para cada amostra (ou seja, neste caso, 6 x 8 tubos de tiras cada um com 200 μL). Selar os tubos e incubar no termociclador mantido a 70 °C até que seja necessário.
   5. Quando a incubação de captura de 30 minutos estiver concluída, gire brevemente a tira do tubo de PCR para coletar o líquido. Coloque a tira do tubo PCR em um suporte magnético para coletar as contas. Aguarde até que a solução fique límpida (aproximadamente 2 min) e, em seguida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante, evitando tocar nas contas.
   6. Depois de remover a tira do tubo PCR do suporte magnético, adicione 200 μL de tampão de lavagem em temperatura ambiente. Pipete para cima e para baixo até que as esferas de estreptavidina sejam totalmente ressuspensas (15x-20x).
   7. Coloque a tira do tubo PCR no suporte magnético e espere que a suspensão desapareça (aproximadamente 1 min). Em seguida, remova e descarte o sobrenadante.
      NOTA: Para garantir a especificidade da captura, é crucial manter a suspensão do cordão a 70 °C durante todo o procedimento de lavagem descrito abaixo. Portanto, verifique se o tampão de lavagem de alta temperatura está pré-aquecido a 70 °C antes de usar.
   8. Lave os grânulos de estreptavidina 6x com aliquota e pré-aquecidos a 70 °C tampão de lavagem de alta temperatura conforme descrito abaixo.
      1. Remova o tubo de tira PCR contendo os grânulos do suporte magnético. Adicione 200 μL de tampão de lavagem de alta temperatura pré-aquecido a 70 °C a cada tubo que contém os grânulos. Pipete para cima e para baixo até que as contas sejam totalmente ressuspensas (15x-20x). Sele cuidadosamente a tira do tubo PCR, vórtice em alta velocidade por 8 s e gire rapidamente sem peletizar os grânulos.
      2. Colocar o tubo de tiras de recolha contendo os cordões ressuspensos no bloco termociclador a 70 °C durante 5 min. Transfira o tubo de tira do termociclador para o suporte magnético à temperatura ambiente.
      3. Aguarde 1 minuto para que a solução desapareça. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Repita 5x para um total de seis lavagens.
   9. Certifique-se de que todo o tampão de lavagem foi completamente removido e, em seguida, adicione 25 μL de água livre de nuclease a cada sample tubo. Ressuspenda lentamente as contas pipetando para cima e para baixo 8x, tentando evitar a formação de bolhas.
   10. Manter a tira de PCR contendo as amostras em gelo até que estejam prontas para serem utilizadas nas reações de PCR descritas abaixo.
4. Bibliotecas enriquecidas com amplificação
   1. Programe o termociclador de acordo com a Tabela 12. Inicie o programa e pause imediatamente.
      NOTA: O fabricante recomenda realizar de 10 a 16 ciclos de PCR pós-captura, dependendo do tamanho do projeto da sonda. Neste protocolo, 22 ciclos foram implementados, resultando na recuperação bem-sucedida do genoma do patógeno^10,12.
   2. Recupere o tampão DNA polimerase de alta fidelidade com dNTPs (5x) e a mistura de primer pós-captura (consulte a Tabela de Materiais) do armazenamento a -20 °C, descongele e mantenha no gelo. Vórtice em alta velocidade e gire rapidamente antes de usar.
   3. Recupere a enzima de fusão de alta fidelidade para amplificação por PCR (consulte a Tabela de Materiais) do armazenamento a -20 °C. Para misturar adequadamente a solução enzimática, pipete para cima e para baixo no líquido para evitar agitação excessiva. Em seguida, prepare a mistura de reação de PCR pós-captura combinando todos os reagentes de acordo com a Tabela 13. Vortex a mistura final e gire brevemente para baixo, mantenha no gelo.
   4. Adicione 25 μL da mistura de reação de PCR pós-captura a cada tubo de amostra (cada um contendo 25 μL de DNA enriquecido com alvo ligado a esferas). Pipete para cima e para baixo para misturar as reações até que a suspensão do cordão fique uniforme. Sele firmemente a tira do tubo de PCR. Não gire a tira do tubo de PCR neste stage.
   5. Coloque a tira de tubo PCR no termociclador e retome o programa do termociclador conforme especificado na Tabela 12. Quando o programa atingir sua etapa final, gire a tira do tubo de PCR brevemente. Coloque a tira do tubo PCR no suporte magnético, aguarde aproximadamente 2 min para que a solução seja limpa.
   6. Transfira aproximadamente 50 μL de sobrenadante de cada tira de tubo de PCR para o poço correspondente de uma nova tira de tubo de PCR. O tubo de tira contendo as esferas de estreptavidina pode ser descartado.
5. Limpeza de bibliotecas finais
   1. Deixe os grânulos magnéticos se equilibrarem à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos antes de usar. Prepare 4 mL de etanol a 70% usando água livre de nuclease. Mantenha em temperatura ambiente.
   2. Vortex a suspensão do grânulo magnético completamente até que a mistura esteja uniforme e a cor pareça consistente.
   3. Adicione 50 μL de suspensão de cordão a cada tubo de amostra. Sele os tubos e o vórtice por 5-10 s, gire brevemente (sem peletizar as esferas magnéticas).
   4. Incube as suspensões de esferas por 5 min em temperatura ambiente. Transfira a tira do tubo PCR para um suporte magnético e espere 5-10 min até que a solução fique clara.
   5. Enquanto mantém a tira do tubo PCR no suporte magnético, remova e descarte cuidadosamente a solução transparente de cada poço. Evite tocar nas esferas ao remover a solução.
      1. Com a tira do tubo PCR no suporte magnético, realizar duas lavagens com etanol a 70% da seguinte forma: adicionar 200 μL de etanol a 70% a cada amostra. Aguarde 1 minuto para permitir que as esferas perturbadas assentem e remova o etanol a 70%. Evite tocar nas esferas ao remover a solução.
   6. Após a segunda lavagem, sele os tubos e gire brevemente a tira do tubo de PCR para coletar o etanol residual. Coloque a tira do tubo PCR no suporte magnético por 30 s.
   7. Para remover o etanol residual, remova a tira do tubo PCR do suporte magnético e mantenha-a sem vedação (de preferência dentro de uma coifa) por no máximo 5 min. Certifique-se de que as esferas estejam totalmente secas, mas não rachadas na aparência, isso reduziria a eficiência do processo de eluição.
   8. Eluir o DNA da biblioteca adicionando 25 μL de água livre de nuclease a cada tubo de amostra. Misture bem pipetando para cima e para baixo 10x-15x, sele a tira do tubo PCR e vore por 5-10 s. Confirmar a ausência de aglomerados visíveis.
   9. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque a tira do tubo PCR em um suporte magnético e espere aproximadamente 5 minutos até que a solução desapareça.
   10. Remova cuidadosamente o sobrenadante limpo (aproximadamente 25 μL) de cada poço e transfira para um poço correspondente em uma nova tira de tubo de PCR. Mantenha as amostras no gelo e descarte as contas.
6. Controle de qualidade
   1. Meça a concentração de DNA do DNA purificado da biblioteca. Para obter uma melhor sensibilidade, use um método baseado em fluorescência para quantificar o DNA em 1 μL.
7. Sequenciamento de próxima geração
   NOTA: Dependendo da capacidade da plataforma usada e da quantidade de dados de sequenciamento necessários por amostra, bibliotecas indexadas de vários lotes podem ser multiplexadas em uma única execução de sequenciamento.
   1. Antes de agrupar as amostras, ajuste a concentração de DNA de cada amostra para 5 ng/μL. Agrupe as bibliotecas em quantidades equimolares para manter uma representação equilibrada.
   2. Sequencie as bibliotecas preparadas usando um sistema de sequenciamento de leitura curta de alto rendimento com, por exemplo, configuração de leitura de extremidade emparelhada de 150 bp (consulte a Tabela de Materiais).

Tabela 9: Programa de termociclador para hibridização. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 10: Preparação da solução em bloco de RNase. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 11: Preparação da mistura de hibridização da sonda. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 12: Programa de termociclador de PCR pós-captura. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 13: Preparação da mistura de reação de PCR pós-captura. Clique aqui para baixar esta tabela.

Resultados

Um estudo sobre o surto de LGV de C. trachomatis em Buenos Aires, Argentina, mostrou algumas características novas nas amostras, a saber, 10 substituições de nucleotídeos no gene ompA em comparação com o genótipo ompA L1 e uma sequência incomum de tipagem de sequência multilocus (MLST) tipo 2 17,18,19. Nosso objetivo foi investigar os genomas dessas amostras clínicas, colocando-os no contexto de dados globais. Para conseguir isso, comparamos o desempenho de uma abordagem de enriquecimento alvo com sequenciamento metagenômico direto para WGS de DSTs bacterianas de amostras clínicas, na tentativa de superar os desafios impostos por baixas cargas bacterianas e DNA humano e microbiano abundante.

O DNA usado foi de amostras de swab retal coletadas entre 2017 e 2023 em Buenos Aires, Argentina, colocadas em meio 2-SP (meio sacarose-fosfato) suplementado com 2% de soro fetal de bezerro (FCS) e antibióticos (gentamicina 25 μg/mL, vancomicina 0,5 mg/mL e anfotericina B 2,5 μg/mL) e armazenados a -80 °C, ou uretral, anorretal, e swabs faríngeos coletados no Hospital Universitário de Zurique (USZ) em tampão NAATs (Testes de Amplificação de Ácido Nucleico). O DNA das amostras de Buenos Aires foi extraído usando um kit de extração manual à base de sílica, enquanto o DNA das amostras da USZ foi extraído usando um sistema automatizado baseado em esferas magnéticas.

Todas as amostras clínicas incluídas neste estudo foram confirmadas como positivas por um ensaio de PCR multiplex em tempo real desenvolvido internamente (ver Tabela de Materiais) com valores de limiar de ciclo de qPCR (Ct) variando da seguinte forma: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 e M. genitalium:  30-37. A concentração de DNA foi quantificada usando um ensaio fluorométrico de alta sensibilidade antes do sequenciamento para caracterizar o material de entrada das amostras clínicas (ver Tabela de Materiais).

Para comparar o sequenciamento metagenômico direto com o enriquecimento alvo, usamos 32 amostras, das quais 29 foram positivas para C. trachomatis, nove para N. gonorrhoeae, cinco para T. pallidum e três para M. genitalium. O sequenciamento metagenômico direto não resultou em genomas completos e, de fato, mal alcançou os dados alvo acima da linha de base observada em amostras negativas. O enriquecimento do alvo com hibridização a 65 ° C resultou em resultados muito melhores para cada patógeno, e genomas bem-sucedidos foram obtidos em muitos casos a partir desse método (Figura 1).

Para avaliar a seleção ideal da amostra para enriquecimento do alvo, avaliamos a relação entre os valores de QPCR Ct de diagnóstico e a eficiência da recuperação do genoma, medida pela porcentagem de leituras no alvo (%OTR). Essa métrica reflete a proporção de leituras de sequenciamento que mapeiam o genoma do organismo alvo e é comumente usada para avaliar o desempenho do enriquecimento. Uma correlação significativa foi encontrada entre a carga do patógeno e o sucesso do sequenciamento para C. trachomatis, com um corte de Ct para sucesso em torno de Ct30. Embora os dados para os outros patógenos alvo tenham sido limitados, uma tendência semelhante foi observada, onde o sucesso do sequenciamento do genoma ocorreu predominantemente em amostras com carga de patógenos abaixo de Ct30 (Figura 2).

Este experimento com uma temperatura de hibridização de 65 °C deu taxas de sucesso de sequenciamento do genoma com enriquecimento alvo de 75% -80% para C. trachomatis, N. gonorrhoeae e T. pallidum, com base em amostras com valores de Ct abaixo de 30. As três amostras positivas para M. genitalium apresentaram valores de Ct de 30-37 e alcançaram menor cobertura do genoma e profundidade média de leitura. Para melhorar esses resultados, experimentamos reduzir a temperatura de hibridização, o que melhora a hibridização devido ao baixo teor de %G+C no genoma de M. genitalium . Usando temperaturas de hibridização mais baixas, como a temperatura agora recomendada de 62,5 ° C, podemos melhorar a recuperação de genomas de M. genitalium sem comprometer a recuperação de outros genomas (Figura 3). Esses resultados demonstram que o enriquecimento de alvos é uma abordagem eficaz para obter informações genômicas valiosas de amostras clínicas e pode ser adaptado a uma ampla gama de genomas, também em um projeto baseado em painel.

A análise filogenética dos genomas de C. trachomatis enriquecidos com sucesso mostrou que a maioria das amostras de Buenos Aires se agrupa dentro do clado L2b do genótipo ompA, sugerindo uma linhagem bem-sucedida com circulação global. A análise também revelou a presença de uma linhagem nova e distinta na Argentina, causando LGV. As amostras deste clado diferem em aproximadamente 600 SNPs das outras linhagens LGV, e esta linhagem é proposta como ompA-genótipo L4 (Figura 4). Uma descrição detalhada das amostras usadas na Figura 1, Figura 2 e Figura 4 é fornecida na Tabela Suplementar 1.

Essas descobertas ressaltam o valor do enriquecimento do alvo no estudo da diversidade de patógenos e demonstram um alto grau de sucesso no sequenciamento do genoma a partir de amostras clínicas.

Figura 1: Enriquecimento de genomas usando enriquecimento alvo em comparação com sequenciamento metagenômico direto. A porcentagem de leituras no alvo (%OTR), definida como a porcentagem de leituras de sequenciamento mapeadas para o genoma do organismo alvo, mostra o grau de enriquecimento alcançado com o enriquecimento do alvo. A linha representa a mediana de todos os pontos de dados e a caixa indica o intervalo interquartil de 50% (IQR). As cores dos pontos de dados correspondem à fonte da amostra: azul claro para a Argentina e vermelho para a Suíça. O sucesso do sequenciamento do genoma, definido como cobertura >95% e profundidade média de leitura >10, é representado por pontos grandes, enquanto a falha é indicada por pontos pequenos. Observe as diferentes escalas no eixo y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Este número foi modificado de¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Correlação de %OTR do enriquecimento alvo com valores diagnósticos de qPCR Ct. As cores dos pontos de dados representam a fonte da amostra: azul claro para a Argentina e vermelho para a Suíça. O sucesso do sequenciamento do genoma, definido como cobertura >95% e profundidade média de leitura >10, é indicado por pontos grandes, enquanto a falha é representada por pontos pequenos. Observe as diferentes escalas no eixo y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Este número foi modificado de¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito da temperatura de hibridização na recuperação de genomas completos em todos os patógenos bacterianos IST em dez amostras. O DNA humano na faixa do que em amostras clínicas foi enriquecido com concentrações conhecidas de DNA bacteriano alvo separadamente (único) e também para representar uma amostra com múltiplas infecções (agrupadas). Dois experimentos, cada um com os cinco patógenos/combinações, foram realizados: 0,01% e 0,03% para representar a porcentagem aproximada de DNA de cada microrganismo em relação ao DNA total da amostra (o DNA restante corresponde ao DNA humano). A recuperação de M. genitalium é melhorada em temperaturas mais baixas. C. trachomatis O DNA foi enriquecido em baixa concentração; experimentos posteriores mostram que as temperaturas não afetaram a recuperação dos genomas de C. trachomatis (dados não mostrados). Abreviaturas: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Filogenia ajustada por recombinação de cepas LGV da Argentina. A análise inclui todos os genomas LGV disponíveis com dados publicados. Os metadados exibidos à direita da filogenia incluem amostras duplicadas de pacientes, Análise Bayesiana da Estrutura Populacional (BAPS; cluster = clado, com o cluster BAPS polifilético 6 representando a diversidade genética da população), método de sequenciamento do genoma (dados deste estudo), genótipo ompA , país e ano, conforme indicado na chave no canto superior esquerdo. Os dados ausentes são mostrados em branco. Os nomes do genoma deste estudo são destacados em azul claro para a Argentina e azul escuro para a Finlândia (não obtidos por enriquecimento alvo). Essas cores são usadas apenas para distinguir os genomas gerados neste estudo. Os valores de bootstrap de 1000 bootstraps ultrarrápidos são exibidos como porcentagens nas ramificações principais. Este número foi modificado de¹³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Descrição dos materiais, reagentes, instrumentos e equipamentos utilizados no estudo. A tabela inclui informações detalhadas sobre o nome comercial, fabricante e número de catálogo dos componentes usados para extração de DNA, preparação de biblioteca, enriquecimento de alvo e sequenciamento. Também inclui itens usados para ensaios internos de qPCR e procedimentos gerais de biologia molecular. Alternativas equivalentes podem ser usadas para itens marcados com um asterisco (*). Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Gerar dados completos do genoma bacteriano a partir de amostras clínicas é particularmente desafiador. No entanto, precisamos desses dados para obter informações sobre clones circulantes e investigar perfis de resistência antimicrobiana, particularmente em bactérias exigentes e difíceis de cultivar. Usando métodos alternativos, como sequenciamento profundo ou sequenciamento adaptativo com a Oxford Nanopore Technologies, dados suficientes para a análise da sequência do genoma completo não podem ser obtidos. Em casos como amostras de IST, o enriquecimento alvo é a técnica ideal para acessar o genoma completo, e esse método pode ser usado em um painel de patógenos bacterianos de IST. Embora não seja um procedimento barato, os resultados que ele pode oferecer não podem ser obtidos de outra forma¹⁰.

Amostras apropriadas devem ser cuidadosamente selecionadas, idealmente para responder a perguntas relevantes e importantes em diagnósticos e pesquisas. O meio usado para coleta não desempenha necessariamente um papel crítico, com sequências bem-sucedidas obtidas de meios 2-SP e NAAT. O armazenamento de amostras é importante, com o objetivo de manter a integridade do DNA. O fator mais importante foi a carga diagnóstica, visando valores aproximados de Ct sob Ct30. Para amostras com valores de Ct acima de 30, o sucesso do sequenciamento completo do genoma é menos provável, mas dados parciais podem fornecer informações relevantes em alguns casos.

O procedimento não é trivial, envolvendo muitas etapas, incluindo ciclos de PCR, hibridização e muitas lavagens de contas. É necessária muita atenção ao procedimento para obter os melhores resultados. As etapas críticas do protocolo - fragmentação de DNA, hibridização com sondas de captura e captura baseada em esferas magnéticas com lavagem - requerem execução cuidadosa e manuseio adequado. O protocolo pode ser aprendido por pesquisadores e técnicos após algumas tentativas. Nas primeiras rodadas, durante o aprendizado, o protocolo de 3 dias pode ser uma vantagem; Com usuários mais experientes, o protocolo de 2 dias pode acelerar os resultados. Como os reagentes são caros, pode valer a pena executar um teste sem os componentes caros, por exemplo, as sondas. Para conjuntos alternativos de iscas, a temperatura de hibridização pode ser ajustada, o que pode melhorar a sensibilidade ou especificidade do enriquecimento. Se forem gerados dados suficientes e uma proporção considerável de duplicatas de PCR for observada, o número de ciclos de PCR pré-captura e pós-captura também pode ser ajustado.

Os dados obtidos desses experimentos podem ser usados para digitação, com MLST e outros alvos relevantes extraídos. Pode ainda ser analisado em um contexto epidemiológico, global ou local, em comparação com genomas relevantes para insights contemporâneos. A recombinação e a análise de elementos móveis em todo o genoma também inferem mudanças ao longo do tempo e sob pressão seletiva e possíveis coinfecções. Com dados suficientes e metadados associados, cálculos temporais podem ser feitos e a inferência dos ancestrais de características e linhagens específicas, bem como possíveis rotas e mecanismos de transmissão. Todos esses avanços em nosso conhecimento de um importante grupo de patógenos podem informar estratégias de saúde pública. Nosso protocolo e resultados representativos mostram o uso de conjuntos de sondas de alvo de painel sindrômico, que são eficazes em amostras de IST bacterianas e podem ser estendidos a outros tipos de amostras.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pipeta de 8 canais 0,5-10 µ L	Eppendorf	3125000010	Eppendorf Research  mais, 8 canais, 0.5-10 e micro; L, cinza médio, volume variável.
pipeta de 8 canais 10-100 µ L	Eppendorf	3125000036	Eppendorf Research  mais, 8 canais, 10-100 e micro; L, amarelo, volume variável.
Adaptador Oligo Mix para bibliotecas marcadas com MBC	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Sistema automatizado de extração de ácido nucleico usando um kit de extração de DNA viral/patógeno	Qiagen	937036 (Kit) / 9001297 (Instrumento)	Instrumento QIAsymphony SP/AS usado com o QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit para extração automatizada de DNA.
Buffer de ligação	Tecnologias Agilent	5190-9687	Parte do kit de enriquecimento de alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (pós-PCR).
Kit de extração de DNA e instrumento automatizado	Corporação de Pesquisa Zymo	D3024/D3025	Kit Miniprep Quick-DNA usado para extração total de DNA de amostras clínicas. Compatível com fluxo de trabalho manual ou automatizado.
Reparo final - uma mistura de enzimas de rejeito	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Buffer de rejeito de reparo final	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Etanol	VWR Chemicals BDH	20816.298	Etanol absoluto ≥ 99,5% Ph. Eur., USP
Fluorômetro com ensaio de dsDNA de alta sensibilidade / método baseado em fluorescência para quantificar o DNA	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Fluorômetro Qubit 4 com 1X dsDNA Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade (HS).
Buffer de fragmentação	Tecnologias Agilent	5191-4080	Parte do Kit de Fragmentação Enzimática SureSelect com o nome ''5X Fragmentation Buffer''.
Enzima de Fragmentação	Tecnologias Agilent	5191-4080	Parte do Kit de Fragmentação Enzimática SureSelect.
Tampão DNA polimerase de alta fidelidade	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do Kit de Preparação de Biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (Pré PCR) com o nome ''Herculase II Buffer''.
Tampão DNA polimerase de alta fidelidade com dNTPs (5X)	Tecnologias Agilent	5190-9687	Parte do Kit de Enriquecimento de Alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) com o nome ''Herculase II Buffer''.
Enzima de fusão de alta fidelidade para amplificação por PCR	Tecnologias Agilent	5191-5688	Parte do SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) com o nome ''Herculase II''.
Tampão de lavagem de alta temperatura	Tecnologias Agilent	5190-9687	Parte do Kit de Enriquecimento de Alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Pós-PCR) com o nome ''Tampão de lavagem 2''.
Buffer de Hibridização	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Primers de sequenciamento indexados	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte dos pares de primers de índice SureSelect XT HS2 de 1 a 96 para ILM (pré-PCR).
Ensaio interno de PCR multiplex em tempo real	Tib Molbiol	N/A	Ensaio desenvolvido e credenciado internamente com base em kits Lightmix para detecção de DSTs
Tampão de ligação	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Grânulos magnéticos para limpeza	Tecnologias Agilent	5191-5740	Contas SureSelect DNA AMPure XP.
Suporte magnético	Material de laboratório permagen	MSRLV08	Separador Magnético de 8 Tiras PCR 0.2mL 5 µ L ~0.2mL Volume.
Sequenciamento de próxima geração (NGS): Sistema de sequenciamento de leitura curta de alto rendimento	Illumina, Inc.	N/A	Sequenciamento de 150 pb de extremidade emparelhada (PE150) realizado nas plataformas Illumina NextSeq1000 e MiSeq.
Água livre de nuclease	BioConceito	3-07F04-H	Água para Biologia Molecular, livre de DNA/DNAse/RNase, estéril, livre de inibidores de PCR.
Mistura de Bloqueadores de Oligonucleotídeos	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Tira de tubo PCR	avantor, entregue pela VWR	732-3608	Tiras de tubos PCR com tampas planas anexadas.
Mistura de primer pós-captura	Tecnologias Agilent	5190-9687	Parte do kit de enriquecimento de alvo SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (pós-PCR).
Sonda de RNA	Tecnologias Agilent	5191-6916	Sonda SureSelect Custom Tier4 de 6 Mb a 11,9 Mb, por exemplo, ID do design S3465164).
Bloqueador de RNase	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR).
Tampão de lavagem à temperatura ambiente	Tecnologias Agilent	5190-9687	SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) com o nome ''Wash buffer 1''.
Contas de estreptavidina	Tecnologias Agilent	5191-5742	Contas de Streptavidin SureSelect.
T4 DNA Ligase	Tecnologias Agilent	5500-0147	Parte do kit de preparação de biblioteca SureSelect XT HS2 para ILM (pré-PCR) .
Método de enriquecimento alvo / método de captura de DNA	Tecnologias Agilent	G9983-90000	Kit de DNA SureSelect XT HS2 com preparação de biblioteca, enriquecimento de alvo Fast-Hyb e fluxo de trabalho de pool pós-captura. Versão do protocolo F0, maio de 2023. Para a plataforma Illumina NGS
Sonda de enriquecimento alvo definida para C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium	Agilent Technologies / Laboratório de Microbiologia Enriquecedora (IMM, UZH)	ID do projeto S3465164	Conjunto de sondas com design personalizado (~242.000 sondas) para captura multiplex de quatro patógenos STI. Design baseado em múltiplos genomas de referência.
Termociclador	Thermofischer	4375305	Termociclador Veriti de 96 poços.