Este estudo se concentra na indução subcutânea in vivo de células cancerígenas colorretais luminescentes em um modelo murino e na subsequente medição de luminescência usando um sistema de imagem. O procedimento visa estabelecer um modelo de crescimento tumoral reprodutível para monitoramento em tempo real e avaliação terapêutica.
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Artigo de método
Injeção subcutânea de células de câncer colorretal humano em camundongos nus atímicos para avaliar a eficácia antitumoral
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer colorretal (CCR) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, destacando a necessidade urgente de modelos pré-clínicos aprimorados para avaliar possíveis terapias. Modelos animais são essenciais para elucidar a biologia tumoral e avaliar novas intervenções terapêuticas. Os modelos de camundongos oferecem vantagens importantes sobre os modelos existentes, incluindo manipulabilidade genética, reprodução rápida, custo-benefício e disponibilidade de cepas imunocompetentes e imunodeficientes, permitindo a modelagem precisa de cânceres humanos.
Este protocolo se concentra na indução subcutânea da linha celular de câncer colorretal bioluminescente HCT-116 em um modelo murino imunodeficiente, seguido por imagens de bioluminescência não invasivas usando o sistema IVIS e paquímetro para monitorar a progressão e o crescimento do tumor. O uso de células luminescentes fornece uma abordagem quantificável em tempo real para rastrear o desenvolvimento do tumor e a resposta a intervenções terapêuticas, reduzindo a necessidade de procedimentos invasivos. Uma coorte de camundongos (n = 12) é necessária para a implantação de células tumorais, e a intensidade da luminescência é medida para estabelecer um modelo padronizado para testes terapêuticos. O volume do tumor é normalmente calculado usando apenas medidas de comprimento e largura ou largura.
A metodologia atual garante o estabelecimento consistente do tumor, minimizando° a variabilidade, aumentando a confiabilidade da avaliação pré-clínica. Os resultados deste estudo contribuirão para refinar os modelos de tumores para testes de drogas e melhorar o potencial translacional da pesquisa pré-clínica em aplicações clínicas. Ao empregar técnicas avançadas de imagem e um desenho experimental reprodutível, este estudo visa melhorar a precisão e a eficiência da avaliação in vivo de medicamentos para o tratamento do câncer colorretal.
Introdução
O câncer colorretal (CCR) é um grande fardo para a saúde global, classificando-se entre as neoplasias malignas mais prevalentes e mortais1. O desenvolvimento de modelos pré-clínicos confiáveis é essencial para avaliar novas abordagens terapêuticas, pois os ensaios in vitro tradicionais não conseguem capturar totalmente a complexidade do crescimento do tumor e da resposta a medicamentos em um sistema vivo. Modelos in vivo , particularmente modelos murinos, têm sido usados para fornecer informações valiosas sobre a biologia do tumor, permitindo que os pesquisadores avaliem a eficácia de possíveis tratamentos em um ambiente controlado.
O uso de células luminescentes do CCR em modelos murinos representa um avanço significativo na pesquisa pré-clínica, permitindo o monitoramento não invasivo e em tempo real da progressãotumoral 2. Este estudo tem como objetivo estabelecer um protocolo padronizado para indução de tumor subcutâneo e imagem IVIS para rastrear o crescimento do tumor dinamicamente. Um modelo de injeção subcutânea foi selecionado devido à sua simplicidade técnica, reprodutibilidade e facilidade de monitoramento longitudinal do tumor. Ao alavancar a imagem de bioluminescência, os pesquisadores podem obter dados precisos e quantificáveis sobre o desenvolvimento do tumor e as respostas terapêuticas sem a necessidade de sacrificar animais em vários pontos de tempo3.
O sistema de imagem IVIS é uma ferramenta poderosa para avaliar a carga tumoral com alta sensibilidade e especificidade, aumentando a reprodutibilidade e a precisão dos estudos in vivo . Este estudo servirá como base para futuras avaliações terapêuticas, fornecendo uma abordagem padronizada e eficiente para testes pré-clínicos de drogas para o tratamento do câncer colorretal. Ao refinar os métodos de indução tumoral e implementar técnicas avançadas de imagem, esta pesquisa contribui para preencher a lacuna entre as aplicações pré-clínicas e clínicas em oncologia4.
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Protocolo
Os animais foram mantidos em condições específicas livres de patógenos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo comitê de ética do Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Múrcia) (No A13240502). As inspeções foram realizadas semanalmente por pessoal qualificado em conformidade com o R. D. 1201/2005.
1. Animais
NOTA: Todos os animais devem ser contidos com segurança antes da injeção. Se estiver trabalhando com camundongos imunodeficientes (ou seja, camundongos atímicos nus, como Crl: NU(NCr)-Foxn1nu), é essencial manter a esterilidade. O presente estudo utilizou 12 camundongos nus atímicos, com 5 semanas de idade (20-22 g para fêmeas e 22-26 g para machos) no início do experimento (50% machos). Todos os procedimentos anestésicos e experimentais foram realizados no Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación do centro, com aprovação do comitê de ética institucional (Protocolo nº A13240502) e em conformidade com a legislação espanhola (R.D. 1201/2005).
- Antes de iniciar o ensaio, aclimatar os camundongos, com 4 semanas de idade, ao centro animal por aproximadamente 1 semana. Posteriormente, execute os seguintes procedimentos.
2. Preparação de estoque de D-luciferina
- Prepare uma solução de trabalho de 15 mg / mL de substrato bioluminescente de sal de potássio D-lucferina em solução salina tamponada com fosfato pré-aquecida (PBS) em um tubo cônico dentro de um gabinete de biossegurança. Inverter o tubo várias vezes para homogeneizar bem a solução.
- Transfira a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm para esterilização.
- Aliquotar a solução esterilizada em microtubos opacos de 1 mL e armazenar a -20 °C.
NOTA: A luciferina é sensível à luz.
3. Preparação da matriz extracelular
- Descongele o hidrogel comercial de matriz extracelular (MEC) sem vermelho de fenol durante a noite no gelo dentro de uma geladeira entre 2 ° C e 8 ° C5.
- No dia da injeção, mantenha a ECM em gelo e, usando uma micropipeta P1000 pré-resfriada, alíquota de 200 μL de ECM em tubos estéreis.
NOTA: Recomenda-se o uso de microtubos de diâmetro largo. Minimize as mudanças de temperatura e evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. - Pré-resfrie as seringas e agulhas no gelo antes de preparar as injeções para evitar mudanças bruscas de temperatura do ECM.
4. Descolamento e contagem de células
- Plaquear células bioluminescentes HCT-116 (linha celular ATCC CCL-247-LUC2) em frascos T75 alguns dias antes da indução do tumor para garantir um número suficiente de células. Manter a cultura celular a 37 °C, 5% de CO2 e, se necessário, substituir o meio6.
- No dia da experiência, aspirar cuidadosamente o meio de cultura para evitar perturbar as células aderentes.
- Lave as células com 8 ml de PBS estéril (pré-aquecido a 30 °C em banho-maria) para remover o soro residual.
- Adicione 2 ml por frasco de tripsina-EDTA quente (0,05%) e incube a 37 °C durante 4-5 min. Monitore o descolamento celular sob um microscópio invertido. Se as células permanecerem presas, bata suavemente na lateral do frasco para ajudar no descolamento.
- Neutralize a tripsina adicionando 10 mL de meio de crescimento completo contendo soro fetal bovino (FBS).
- Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Lave os frascos com mais 2 mL de meio fresco para coletar as células restantes e adicione as lavagens no tubo de 15 mL.
- Centrifugue a suspensão da célula a 200 × g por 5 min em temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
- Ressuspenda suavemente o pellet celular em 3 mL de meio de semeadura para obter uma suspensão homogênea.
- Conte as células em uma câmara Neubauer ou em um contador automático de células. Determine a viabilidade celular misturando 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e conte as células viáveis sob um microscópio invertido.
NOTA: Preparar um número suficiente de células para o estudo: pelo menos 3 × 106 células viáveis por ratinho. - Ressuspender as células em PBS estéril (pré-aquecidas a 30 °C em banho-maria) e modificar a concentração de células viáveis para uma concentração final de 2 × 107 células/ml com PBS. Preparar alíquotas de 200 μl.
5. Configure itens de equipamento e anestesie os animais.
- Ligue o sistema de imagem pelo menos 4 h antes de fazer a imagem.
NOTA: Siga as instruções do sistema para permitir a etapa de inicialização, incluindo o ajuste das configurações de intensidade da luz e tempo de exposição da câmera, dependendo da relação sinal-ruído. Essa configuração deve ser definida manualmente com base nas condições experimentais. - Pesar os animais e calcular o volume de D-luciferina que deve ser administrado (200 μL de uma solução de 15 mg/ml por 20 g do animal).
- Limpe e desinfete as câmaras de imagem e o gabinete.
- Identifique e contenha com segurança cada camundongo para anestesia.
NOTA: Use dois pares de luvas para proteger as mãos de picadas acidentais de agulhas durante a injeção subcutânea. - Anestesiar camundongos com isoflurano a 2% em oxigênio a 1,8-2,0 L/min de fluxo. Ligue a bomba de sucção simultaneamente com a bomba de anestesia.
6. Preparação das células para injeção
- Misture 200 μL de 2 × 107 células CRC bioluminescentes/mL com 200 μL de ECM em um criovial dentro de um gabinete de biossegurança. Pipete suavemente com uma pipeta P1000 para evitar a formação de bolhas de ar e dissociação.
- Transfira a mistura de 400 μL para uma seringa de 1 ml, remova as bolhas de ar e proceda imediatamente à injeção.
- Destampe a agulha com segurança, mantendo sempre a esterilidade da agulha.
NOTA: Recomenda-se o uso de agulhas individuais para cada animal para minimizar a contaminação. Uma nova agulha é usada para cada camundongo para prevenir a infecção cruzada do camundongo. - Coloque uma agulha de 25 G e ajuste o conteúdo da seringa para 200 μL, removendo quaisquer bolhas de ar.
NOTA: As injeções geralmente são feitas com 200 μL, levando a 2 × 106 células por injeção. - Deslize a agulha de volta para dentro da tampa frouxamente, sem manusear a tampa ou a agulha enquanto o animal estiver contido.
7. Indução de tumor subcutâneo
- Remova o camundongo da câmara depois de anestesiado e coloque o focinho do animal em uma saída que forneça o mesmo anestésico.
NOTA: No nosso caso, o bico foi feito com uma luva. - Coloque o animal do lado direito em uma superfície plana. Usando as pontas dos dedos da mão não dominante, aperte suavemente e levante a pele do animal no quadrante inferior esquerdo.
- Antes de injetar, aspire primeiro para garantir a colocação adequada da agulha. Insira o chanfro da agulha com a mão dominante, dois terços na pele levantada, paralela ao corpo, tomando muito cuidado para não picar os dedos ou perfurar as luvas duplas.
NOTA: A colocação adequada deve produzir pressão negativa e nenhuma aspiração no cubo da agulha. - Injete o conteúdo da seringa (200 μL) na pele levantada, bem entre os dois dedos. Segure brevemente antes de retirar a agulha lentamente. Remova a agulha após a injeção subcutânea e descarte-a com segurança em um recipiente para objetos cortantes.
8. Injeção intraperitoneal de D-luciferina
- Antes de retornar o animal à câmara de anestesia, administrar D-luciferina por via intraperitoneal (IP) na concentração de 150 mg/kg de peso corporal com a solução-mãe de 15 mg/mL em uma seringa de insulina de 30 G (200 μL por 20 g do animal).
NOTA: A injeção de até 0,5 mL é bem tolerada. - Conter manualmente, decúbito dorsal (lado do abdômen para cima), com a extremidade cranial (cabeça) do animal apontada para baixo. Deixe o conteúdo intestinal se mover para baixo.
- Mantendo a agulha com o lado chanfrado para cima e ligeiramente inclinada a 15-20°, empurre a agulha para dentro da cavidade abdominal de modo que a ponta da agulha penetre na parede abdominal do quadrante abdominal inferior esquerdo do animal.
- Injete lentamente a D-luciferina na cavidade intraperitoneal, remova a agulha e descarte-a com segurança.
- Coloque o mouse na câmara de anestesia e deixe-o estabilizar por aproximadamente 5 min. Após 15 min, prossiga com a imagem in vivo .
NOTA: Construa uma curva cinética de D-luciferina para cada novo modelo animal para determinar o tempo de pico do sinal. No nosso caso, a emissão de luz atingiu o pico em aproximadamente 15 minutos em imagens in vivo .
9. Análise de imagem in vivo
- Coloque o animal totalmente anestesiado na câmara do sistema de imagem, no flanco direito. Certifique-se de que o animal esteja devidamente alinhado com a câmera e a fonte de luz para capturar a área do tumor.
- Abra o software vinculado. Escolha o modo de imagem visual ou fotográfica para confirmar a posição do animal. Salve os dados e altere o nome da pasta.
- Escolha o modo de imagem de bioluminescência e defina-o como automático. Capture imagens de bioluminescência e monitore a luz do tumor na tela do computador.
- Assim que a imagem estiver concluída, devolva o animal à gaiola e observe quaisquer complicações.
- Execute o pós-processamento, primeiro dimensione a luz bioluminescente para que todos os tumores de camundongos apresentem a mesma escala, geralmente entre 1e6 e 1e8.
- Configure uma região de interesse (ROI) ao redor do tumor para análise e copie-a para análises posteriores. Meça a luz do ROI e exporte esses resultados para análise posterior. Cole o ROI criado e copiado anteriormente do mesmo tamanho para tumores subsequentes.
- Desligue o sistema de acordo com as instruções do fabricante e limpe a câmara de imagem. Desligue as bombas de extração e anestesia, juntamente com o fluxo de oxigênio.
10. Medição do volume do tumor
- Anestesiar animais com isoflurano para medição do tumor. Coloque o animal em uma posição estável e cubra sua cabeça. Imobilize rapidamente o animal.
- Meça o comprimento, a largura e a profundidade do tumor usando um paquímetro digital calibrado.
NOTA: Realize as medições rapidamente, pois o animal começará a acordar aproximadamente 1 min após a retirada da câmara de anestesia. - Repita as medições e calcule uma média.
- Calcule o volume de acordo com a fórmula para tumores esféricos ou elípticos:
Para tumores esféricos 7
(1)
Para tumores elipsóides 8
(2)
NOTA: Para minimizar o viés de medição, todas as medições do tumor dentro do estudo devem ser realizadas pelo mesmo operador. Além disso, deve-se notar que, no dia da indução do tumor, a medição precisa costuma ser um desafio porque a massa tumoral ainda não está totalmente solidificada.
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Resultados
Este protocolo permite a introdução de células humanas em um modelo de camundongo imunodeficiente, possibilitando o crescimento dessas células tumorais in vivo, o que é sempre mais fisiologicamente relevante do que in vitro. É crucial garantir que as condições experimentais sejam o mais reprodutíveis possível, que os tumores contenham um número semelhante de células viáveis e que sejam implantados em um local comparável e consistentemente acessível.
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Discussão
O protocolo para a indução subcutânea de células cancerígenas colorretais luminescentes em um modelo de camundongo nu atímico apresenta uma abordagem padronizada e reprodutível para a formação de tumores e monitoramento em tempo real. Em primeiro lugar, é importante observar que esses estudos são normalmente realizados ao longo de 28 dias, com medições de luminescência realizadas no dia da indução do tumor e, posteriormente, semanalmente. Por outro lado, as medições do volume do tumor nã...
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam influenciar o trabalho relatado neste estudo.
Agradecimentos
A ACS e a CNN pertencem ao "Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Espanha" e são titulares de bolsas de doutoramento da UCAM. Os autores agradecem às plataformas do Biotério do IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Múrcia), onde o ensaio pré-clínico foi realizado.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microtubos opacos de 1 mL | Eppendorf | 30125215 | Armazenamento de D-luciferina |
| Tubo cônico de 15 mL | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Material de cultura celular |
| Dulbecco Avançado' s Eagle Medium Modificado (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | Reagente de cultura celular |
| Rato nu Atímico | Rio Charles | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | Camundongo nu imunodeficiente |
| Células bioluminescentes do câncer de cólon humano HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 é ideal para bioluminescência in vivo |
| D-luciferina Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | Para medição de bioluminescência |
| Matriz Extracelular (ECM) | Corning | 356231 | Matriz Matrigel para invasão celular |
| Soro Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Reagente de cultura celular |
| Pontas de Pipeta de Filtro | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Para evitar a formação de bolhas de ar |
| Seringa de insulina 25 g 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | Para implantação de linhagem celular com HCT-116 |
| Seringa de Insulina 30 G 0,5 mL | DH Material médico | 9.41652E+15 | Para a administração da D-luciferina |
| Sistema de imagem IVIS com software Living Image | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Scanner de bioluminescência e fluorescência |
| Agulha Estericana Heparina | VWR | 612-0153 10 | Administração de D-luciferina e implantação de HCT-116 |
| Soro Tamponado com Fosfato (PBS) | VWR | 392-0042P | Solução de suspensão celular para o descolamento e implantação de HCT-116 |
| Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | Reagente de cultura celular |
| Frasco T-75, Tratado com TC | STARLAB | CC7682-41 | Material de cultura celular |
Referências
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Reimpressões e permissões
