Method Article

Imagens 3D de alta resolução e sem rótulos e análise de aprendizado de máquina de organoides intestinais por meio de holotomografia de baixa coerência

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um protocolo passo a passo para imagens tridimensionais de alta resolução, sem rótulos e tridimensionais usando holotomografia de baixa coerência. Este protocolo detalha a preparação da cultura de organoides, aquisição de imagens e análise computacional de imagens, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica estrutural e respostas a medicamentos em organoides vivos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagens precisas e sem rótulos de organoides intestinais são cruciais para estudar sua morfologia, dinâmica de crescimento e respostas a estímulos ambientais. A holotomografia (HT) fornece visualização tridimensional (3D) de alta resolução de organoides vivos sem a necessidade de marcadores fluorescentes, minimizando assim a fototoxicidade e preservando a integridade da amostra. A imagem baseada em fase em tempo real permite o rastreamento contínuo e sem rótulos de mudanças estruturais e funcionais. Ao usar o índice de refração como um contraste de imagem intrínseco, este método permite a quantificação de propriedades biofísicas, como volume, densidade de proteína e conteúdo de proteína. Os dados de imagem são processados posteriormente por meio de segmentação orientada por aprendizado de máquina e extração de recursos para oferecer suporte a análises consistentes e de alto rendimento. Este protocolo detalha o fluxo de trabalho experimental completo para empregar HT de baixa coerência na pesquisa de organoides, abrangendo preparação de organoides, aquisição de imagens e análise de dados baseada em aprendizado de máquina. Ao integrar segmentação computacional e avaliações quantitativas, essa abordagem permite uma avaliação imparcial das principais propriedades dos organoides, incluindo viabilidade, organização estrutural e resposta a medicamentos. A capacidade de capturar mudanças morfológicas em tempo real na resolução subcelular torna este protocolo altamente aplicável a estudos baseados em organoides em medicina regenerativa, modelagem de doenças e triagem farmacêutica. A metodologia passo a passo descrita aqui facilita a reprodutibilidade e ampla adaptação em diferentes sistemas organoides.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os organoides são versões miniaturizadas tridimensionais (3D) de órgãos cultivados a partir de células-tronco, capazes de recapitular as principais características estruturais e funcionais de órgãos reais in vitro1. Os pesquisadores desenvolveram sistemas organoides para uma ampla gama de tecidos - incluindo intestino, cérebro, pulmão, fígado e rim - cada um demonstrando a arquitetura auto-organizada e a diversidade de tipos de células que lembram sua contraparte in vivo . Ao espelhar a arquitetura do órgão nativo e a complexidade multicelular, os organoides servem como poderosos sistemas modelo para estudar o desenvolvimento humano, a regeneração de tecidos e os mecanismos de doenças1. Eles se tornaram ferramentas essenciais para modelagem de doenças e descoberta de medicamentos, permitindo que os pesquisadores explorem os caminhos da doença e testem novas terapias em tecidos 3D específicos do paciente no laboratório2. Notavelmente, os organoides também são promissores na medicina regenerativa3: tecidos derivados de organoides podem ser enxertados in vivo para reparar danos, como demonstrado com organoides intestinais e hepáticos, ressaltando seu potencial para restaurar a função do órgão4. Essa versatilidade torna os organoides indispensáveis na pesquisa biomédica moderna e na medicina personalizada.

Dada a sua composição multicelular e complexidade estrutural 3D, capturar e analisar a dinâmica organoide é crucial. No entanto, as técnicas convencionais de imagem enfrentam limitações significativas na resolução de estruturas e dinâmicas organoides, muitas vezes produzindo instantâneos 2D que não representam seu estado fisiológico completo5.

A microscopia de campo claro é um método amplamente utilizado e não invasivo para a captura de organoides. Ele monitora convenientemente o crescimento e a morfologia, mas fornece contraste limitado em amostras 3D não coradas. Além disso, falta seccionamento óptico, resultando em baixa resolução das estruturas internas. Os organoides parecem amplamente transparentes, dificultando a detecção de características finas abaixo da superfície6. O contraste de fase aumenta a visibilidade convertendo as mudanças de fase em diferenças de intensidade, revelando a arquitetura geral (por exemplo, um lúmen central) sem manchas. Apesar de sua utilidade para observação em tempo real, o contraste de fase sofre de artefatos de halo, baixa resolução e profundidade de penetração limitada, tornando-o menos eficaz para organoides mais espessos7.

O corte seriado seguido de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e imunomarcação baseada em anticorpos é amplamente utilizado para analisar a microestrutura organoide e a composição celular8. Técnicas aprimoradas de processamento de tecidos, como inclusão de parafina fixada em formalina (FFPE) e criossecção, melhoram a preservação da morfologia, com FFPE oferecendo resultados superiores9. A incorporação de organoides em hidrogéis como agarose e centrifugação alinha várias amostras em uma única seção, melhorando a eficiência da análise. Seções coradas com H & E de organoides tumorais derivados de pacientes refletem a histologia original do tumor, enquanto a coloração por imunofluorescência destaca marcadores como CK8 para identificação celular10. No entanto, essas técnicas não podem monitorar organoides vivos e podem introduzir artefatos como enrugamento ou deformação do tecido durante o seccionamento.

A microscopia de fluorescência confocal é amplamente utilizada para imagens organoides, produzindo seções ópticas de alta resolução (submicrômetros) que permitem a visualização detalhada da arquitetura organoide e da composição celular11,12. No entanto, a imagem confocal de organoides 3D é normalmente limitada a camadas superficiais (até 100 μm de profundidade) e pode ser demorada e fototóxica devido à iluminação a laser de varredura pontual13. A microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) supera algumas dessas limitações iluminando apenas o plano de imagem, obtendo imagens volumétricas rápidas de organoides inteiros com fotobranqueamento e fototoxicidade mínimos14,15; no entanto, essa técnica geralmente requer limpeza de tecido para obter imagens ideais de espécimes espessos. Além disso, a profundidade da imagem LSFM é restrita por incompatibilidades de dispersão de luz e índice de refração (RI), que podem ser mitigadas por meio de óptica adaptativa, imagens multi-view e comprimentos de onda de excitação otimizados16. A montagem de amostras também introduz deformações estruturais, enquanto grandes conjuntos de dados 3D apresentam desafios computacionais no armazenamento e na análise. Avanços recentes, incluindo técnicas aprimoradas de marcação genética, novos reagentes de limpeza, óptica adaptativa e análise de imagem orientada por IA, estão abordando essas limitações, tornando o LSFM cada vez mais viável para a pesquisa de organoides7.

Apesar desses avanços, as técnicas de imagem de fluorescência 3D apresentam vários desafios para o monitoramento de longo prazo de organoides vivos. Primeiro, o uso de marcação fluorescente introduz efeitos fototóxicos e perturba processos biológicos, apresentando desafios para estudos prolongados de imagens ao vivo17. Em segundo lugar, a marcação baseada em anticorpos sofre de penetração limitada devido a barreiras de difusão dentro de estruturas organoides densas, exigindo métodos avançados de permeabilização e limpeza de tecidos, que levam mais de 10 dias de incubação para o uso de anticorpos primários e secundários18. Em terceiro lugar, a transfecção e a expressão estável de proteínas fluorescentes em organoides permanecem ineficientes, pois as abordagens convencionais de entrega de genes lutam com ambientes 3D19. Em quarto lugar, as técnicas de limpeza óptica, essenciais para imagens profundas, geralmente levam à perda do sinal de fluorescência e distorção do tecido, necessitando de protocolos de limpeza otimizados que equilibrem a transparência e a preservação da fluorescência20.

Para resolver essas limitações, a holotomografia (HT) foi introduzida como uma técnica para obter imagens de organoides vivos não marcados com alta resolução ao longo do tempo. Também conhecida como imagem de fase quantitativa 3D, a HT é uma modalidade de alta resolução e sem rótulos que permite a visualização quantitativa em tempo real de organoides, preservando seu estado fisiológico nativo. O princípio da TH é análogo à tomografia computadorizada de raios-X; capturando várias imagens de campo óptico 2D sob várias condições de iluminação, a distribuição 3D RI de uma amostra não rotulada é reconstruída por meio da resolução de equações de onda inversa 21,22,23. A HT tem sido amplamente aplicada em vários campos biológicos, incluindo hematologia 24,25, condensação de fase em biologia celular26, microbiologia27 e histopatologia28. Mais recentemente, sua capacidade de imagem 3D de alta resolução e sem rótulos tem sido cada vez mais utilizada para pesquisa de organoides21 , 22 , 23 , 29 , oferecendo uma abordagem não invasiva para estudar sua dinâmica estrutural e funcional.

Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado para o uso de HT de baixa coerência no monitoramento de longo prazo e sem marcação de organoides do intestino delgado (sIOs) de camundongos. Este método permite a visualização em tempo real do crescimento do organoide e das respostas aos medicamentos ao longo de 24 horas, ao mesmo tempo em que fornece medições quantitativas do volume do organoide, densidade e teor de proteína, facilitando a análise rigorosa e orientada por dados do comportamento do organoide. Para investigar alterações morfológicas em organoides, tratamos as amostras com cisplatina, um agente quimioterápico à base de platina conhecido por induzir apoptose formando ligações cruzadas de DNA e inibindo a replicação celular30. Enquanto a imagem 3D RI captura detalhes estruturais, a análise sistemática é essencial para quantificar a dinâmica do organoide. Para conseguir isso, integramos o ilastik, um kit de ferramentas de segmentação baseado em aprendizado de máquina31 para diferenciar regiões organoides do fundo. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho completo, incluindo preparação de cultura organoide, aquisição de HT 3D, segmentação baseada em aprendizado de máquina e análise quantitativa de tomogramas RI. Ao oferecer uma estrutura de imagem escalável, reprodutível e não invasiva, essa abordagem estabelece um novo padrão para pesquisa de organoides com amplas aplicações em modelagem de doenças, medicina regenerativa e triagem de medicamentos.

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Protocol

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NOTA: Detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e software usados neste protocolo são fornecidos na Tabela de Materiais. Produtos equivalentes de diferentes fabricantes podem ser usados como alternativas. Um processo esquemático de todo o protocolo é apresentado na Figura 1.

1. Preparação da amostra

  1. Preparação do meio de cultura sIO
    1. Preparar o meio de cultura comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante. Esterilize o meio de cultura filtrando-o através de uma unidade de filtro de 0,22 μm.
      NOTA: Se o meio for preparado inteiramente em condições estéreis em uma capa de cultura de células e todos os componentes forem pré-esterilizados (por exemplo, fornecidos em frascos e frascos estéreis), a filtração através de um filtro de 0.22 μm pode não ser estritamente necessária.
    2. Alíquota de 15 mL de meio preparado em tubos de armazenamento estéreis. Aquecer o meio alíquota à temperatura ambiente (15 - 25 °C) antes de utilizar em cultura organoide.
  2. Descongelamento do estoque de sIO
    1. Descongele rapidamente o estoque de organoide congelado em 2 minutos usando um banho-maria a 37 °C. Transfira a suspensão organoide descongelada para um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 150 x g por 3 min para peletar os organoides.
    2. Remova cuidadosamente o sobrenadante para lavar o DMSO, minimizando os possíveis efeitos citotóxicos.
    3. Adicione o meio e a matriz extracelular (ECM) fresca na proporção de 1:4 e pipete suavemente para garantir a ressuspensão uniforme do pellet. Dispense 15 μL por cúpula em cada poço de uma placa de 48 poços. Mantenha o ECM no gelo para evitar a polimerização prematura.
    4. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por 1 h para permitir a polimerização do ECM. Após a polimerização, adicione cuidadosamente 200 μL de meio fresco a cada poço.
      NOTA: Este protocolo é compatível com várias placas de imagem comerciais e placas de poço. Ajuste o volume do meio de acordo com o tipo de poço para garantir que a cúpula do ECM esteja totalmente submersa.
  3. Passagem de sIOs
    NOTA: Os organoides tendem a aderir às pontas das pipetas. Para minimizar a aderência, ponteiras de pipeta pré-umedecidas com o meio.
    1. Aspirar gasto médio. Adicione 200 μL de solução de recuperação celular a cada poço e incube a 4 °C por 30 min para facilitar a degradação da ECM e a recuperação de organoides.
    2. Recolha a suspensão organoide por pipetagem suave e transfira-a para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 150 x g durante 3 min e, em seguida, retire cuidadosamente o sobrenadante.
    3. (Opcional) Para passar como células únicas, execute um dos seguintes métodos de dissociação:
      1. Método enzimático: Adicionar 100 μL de solução de dissociação unicelular ao pellet e incubar a 37 °C, incubadora de CO2 a 5% por 1-2 min. Adicione 150 μL de meio para neutralizar. Execute pipetagem ou batidas suaves. Centrifugue a 150 x g durante 3 min e retire o sobrenadante, deixando apenas o pellet.
        NOTA: Evite a incubação excessiva, pois a exposição prolongada pode ser altamente prejudicial para as células.
      2. Dissociação mecânica: Ressuspender o pellet em 200 μL de meio de cultura. Usando uma pipeta P200, pipete para cima e para baixo 20x-30x para dissociar mecanicamente os organoides em fragmentos menores ou células únicas. Centrifugue a 150 x g durante 3 min, aspire o sobrenadante e retenha o sedimento.
    4. Adicione o meio e o ECM fresco na proporção de 1:4 e pipete suavemente para garantir a ressuspensão uniforme do pellet. Dispense 15 μL por cúpula em cada poço de uma placa de 48 poços.
    5. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por 1 h para permitir a polimerização do ECM.
    6. Após a polimerização, adicione 200 μL de meio de cultura fresco a cada poço e encha os poços externos vazios com PBS para evitar a evaporação. Substitua o meio de cultura a cada 2-3 dias e passe os organoides semanalmente. Ajuste o intervalo de passagem de acordo com o tamanho do organoide desejado.
  4. Tratamento medicamentoso
    1. Prepare uma solução estoque de 10 mM de cisplatina dissolvendo 3,00 mg de cisplatina em pó (MW ≈ 300,05 g / mol) em 1 mL de DMSO. Vortex brevemente e proteja a solução da luz usando tubos âmbar ou envolvendo-os com papel alumínio.
    2. Para preparar o meio de tratamento, diluir o estoque de cisplatina 10 mM 1:1.000 em meio de cultura sIO completo para obter uma concentração final de 10 μM de cisplatina e 0,1% de DMSO.
    3. Para o controle do veículo, prepare 0,1% de DMSO em meio de cultura para corresponder à concentração final de DMSO sem cisplatina.
    4. Remova o meio gasto das culturas sIO e substitua-o suavemente por meio contendo cisplatina 10 μM ou meio de controle somente DMSO.
    5. Após o tratamento, transfira as amostras para a incubadora do sistema de imagem.

2. Imagem de holotomografia de baixa coerência usando software operacional

  1. Preparação de amostras para imagem
    1. Dispense 15 μL de cúpula de ECM organoide na placa de imagem com fundo de lamínula # 1.5 seguindo o procedimento descrito nas etapas 1.3.1-1.3.4. Coloque cada cúpula no prato o mais próximo possível do centro para obter uma imagem ideal.
    2. Antes da polimerização, incube em temperatura ambiente por 1 min para permitir que os organoides se assentem no fundo.
    3. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5% por 1 h para polimerizar o ECM. Em seguida, adicione delicadamente meio de cultura suficiente para submergir totalmente os organoides.
      NOTA: Ajuste o volume do meio para garantir que os organoides estejam totalmente submersos de acordo com o tamanho da placa de imagem com fundo de lamínula.
    4. Aos 5 dias após a passagem, lave a amostra 2x-3x com PBS imediatamente antes da imagem para remover detritos e reduzir artefatos ópticos.
  2. Configuração de imagem
    1. Ligue o controlador ambiental para manter a viabilidade da amostra. A unidade controladora da câmara ajusta automaticamente a temperatura para 37 °C e a concentração de CO2 para 5%.
    2. Pressione o botão Porta na frente do instrumento para abrir a porta. Adicione água para formar uma camada fina dentro do poço da câmara para evitar que o meio de cultura seque.
    3. Coloque a placa de imagem em um suporte de recipiente adequado, insira-a na câmara de imagem e prenda-a usando um pino para evitar movimento. Certifique-se de que o prato esteja firmemente preso ao suporte do recipiente sem inclinar.
    4. Feche a porta do instrumento usando o botão Porta para bloquear a interferência de luz externa.
    5. Inicie o software TomoStudio X e faça login. Clique em Iniciar para abrir a janela principal.
    6. Clique em Adicionar projeto no canto superior esquerdo e atribua parâmetros experimentais (por exemplo, nome do projeto, tipo de meio, tipo de amostra, etc.). O painel de amostras será criado automaticamente. Certifique-se de que o tipo de meio correto seja atribuído para o uso do RI apropriado no experimento.
    7. Clique no poço desejado no painel e clique em Criar na parte superior para registrar os poços como amostras.
    8. Clique em Configuração de ROI no canto superior direito para definir a região de interesse (ROI) no prato. Depois que todos os parâmetros estiverem definidos, clique em Executar experimento no canto inferior direito para abrir a janela de aquisição de imagem.
    9. Clique em Carregar Embarcação no canto superior direito. Uma imagem de campo claro aparecerá. Ajuste a posição Z usando os botões +Z e -Z para focar.
    10. Na guia Imagem única, ajuste o tamanho do ROI. Capture organoides dentro de um campo de visão de 160 μm x 160 μm e adquira pilhas axiais de até 140 μm de profundidade. Para organoides maiores, adquira vários tomogramas de RI e imagens de ponto marcando a caixa de seleção Imagem de bloco na parte inferior.
    11. Navegue até a guia Time Lapse Imaging para configurar a imagem de longo prazo. Defina a duração e o tempo de intervalo conforme necessário. Neste experimento, a imagem de lapso de tempo foi realizada em intervalos de 10 minutos durante um período de 24 horas, e a análise foi realizada em intervalos de 2 horas durante a mesma duração.
    12. Clique no ícone Digitalizar para capturar o local atual do ROI. Centralize manualmente a cúpula do ECM usando imagens de campo claro. Clique no botão BF para ajustar os valores de intensidade e exposição para imagens de campo claro.
    13. Selecione ROI movendo a caixa ROI que aparece no painel Visualização. Quando o ROI desejado for encontrado, clique em Adicionar ponto na parte inferior. A lista de pontos de imagem aparecerá.
    14. Clique em Adquirir para iniciar a geração de imagens. Os dados brutos da imagem serão adquiridos.
  3. Aquisição de imagem
    NOTA: Esse processo gera um Tomocube Common File (TCF) a partir de dados brutos da imagem. Os dados brutos da imagem devem ser processados em um arquivo TCF, que contém vários tipos de imagens, como um tomograma RI e uma projeção de intensidade máxima. O tomograma RI representa a distribuição 3D RI da amostra, e a projeção de intensidade máxima mostra o valor RI mais alto para cada posição lateral no plano XY.
    1. Arraste e solte arquivos de imagem bruta no servidor de processamento HTX. Clique em Processo para gerar um arquivo TCF a partir do arquivo de imagem bruta.
    2. Para visualizar os tomogramas de RI gerados no arquivo TCF, use o TomoAnalysis Viewer, o MATLAB ou o Python. Para visualizar um arquivo TCF no MATLAB, use funções como h5info e h5read. Da mesma forma, em Python, use o pacote h5py para ler arquivos H5.

3. Análise de imagem

  1. Segmentação de imagem baseada em aprendizado de máquina
    1. Exporte o arquivo de imagem TCF para o formato HDF5 (Arquivo de Codificação Suplementar 1) para garantir que os dados estejam em um formato multidimensional compatível com ilastik.
    2. Abra o ilastik e navegue até Arquivo > Novo Projeto. Selecione Classificação de pixels na seção Fluxos de trabalho de segmentação. Salve o arquivo de projeto em um diretório designado.
    3. Carregue o arquivo HDF5 navegando até 1. Guia Dados de entrada. Clique em Adicionar Novo Arquivo, selecione o Conjunto de Dados H5 Apropriado e certifique-se de que os canais de imagem corretos sejam atribuídos.
    4. Navegue até 2. Guia Seleção de recursos para selecionar recursos relevantes (Cor/Intensidade, Borda, Textura) para otimizar a segmentação.
      NOTA: A seleção de recursos pode variar dependendo do conjunto de dados e das características da imagem. Para a análise atual, os recursos selecionados incluíram: Cor/Intensidade (σ = 1,60), Borda (σ = 3,50) e Textura (σ = 1,60). A otimização baseada em uma abordagem heurística pode ser necessária dependendo da complexidade da imagem. Como alternativa, a função Sugerir recursos > executar seleção de recursos no ilastik pode ser usada para identificar um conjunto ideal de parâmetros.
    5. Em 3. Guia de treinamento, rotule regiões organoides e não organoides aplicando pinceladas de cores distintas. Para melhorar a fidelidade da segmentação, anote cuidadosamente as regiões ao redor dos limites.
    6. Clique em Atualização ao vivo para visualizar os resultados da segmentação e fazer os refinamentos necessários.
    7. Navegue até 4. Exportação de previsão. Na Seleção de origem, escolha Segmentação simples para exportar previsões rotuladas. Clique em Exportar tudo, garantindo que o formato de saída esteja definido como .h5 ou .tiff, dependendo dos requisitos de análise downstream.
  2. Análise quantitativa de recursos
    NOTA: Esta etapa do protocolo é executada no MATLAB, com cada procedimento detalhado no Arquivo de Codificação Suplementar 2.
    1. Ao combinar o tomograma RI com a imagem da máscara, crie uma imagem RI mascarada que inclua apenas a região organoide.
    2. Usando a imagem RI mascarada, calcule parâmetros quantitativos, como volume organoide, densidade de proteínas e teor de proteínas.
      1. Volume: Calcule o volume total do organoide multiplicando o número de pixels na máscara segmentada pela resolução de pixels para X, Y e Z. Calcule o número de pixels contando todos os valores de voxel na matriz de máscara rotulada com organoide, usando a função MATLAB integrada Soma.
        NOTA: A resolução de pixels é determinada pelo sistema de imagem e pode ser encontrada no grupo Dados > atributos 3D dentro da estrutura HDF5.
      2. Densidade da proteína: Calcule a densidade da proteína subtraindo o valor médio de RI do RI médio do organoide médio e dividindo-o pelo Incremento do Índice de Refração da Proteína.
        1. RI médio: Meça o RI do meio circundante usando um refratômetro antes da análise.
        2. Valor médio de RI: Determine o RI médio do organoide calculando a média dos valores de RI dos voxels localizados dentro da máscara organoide.
        3. Incremento do índice de refração de proteína (α): Use uma constante empírica relatada anteriormente derivada de estudos de incremento de índice de refração.
      3. Teor de proteína: Calcule o teor total de proteína multiplicando o volume determinado na Etapa 3.2.2.1 pela densidade de proteína obtida na Etapa 3.2.2.2.

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Results

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A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho esquemático para imagens 4D e análise quantitativa de sIOs. Este protocolo permite imagens contínuas ao vivo e avaliação abrangente de sIOs por meio de um processo de quatro etapas: Cultura, Imagem 4D, Processamento de Imagem e Análise Quantitativa (Figura 1D).

Após um período de incubação de 5 dias, os sIOs maduros foram transferidos para placas de imagem com fundo de lamínula para visualização ...

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Discussion

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A holotomografia apresenta uma abordagem poderosa para imagens de alta resolução e sem rótulos de organoides vivos, superando muitos desafios associados às técnicas convencionais de imagem. Neste protocolo, descrevemos uma metodologia abrangente para aplicar HT de baixa coerência à pesquisa sIO, permitindo a visualização quantitativa em tempo real da morfologia organoide, dinâmica de crescimento e respostas ao tratamento medicamentoso. A integração da segmentação baseada em aprendizado d...

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Disclosures

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M.J.L., J.H.L., S.M.L. e Y.K.P. têm interesses financeiros na Tomocube Inc., uma empresa que comercializa instrumentos de holotomografia e imagem de fase quantitativa.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela subvenção da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia financiada pelo governo coreano (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), Instituto da Coreia para o Avanço da Tecnologia (KIAT) por meio do programa de P&D da Cooperativa Internacional (P0028463) e pela subvenção do Fundo Coreano para Medicina Regenerativa (KFRM) financiada pelo governo da Coreia (Ministério da Ciência e TIC e Ministério da Saúde e Bem-Estar) (21A0101L1-12). A aquisição de dados foi realizada por M.J.L. e J.H.L., sendo J.H.L. responsável pelo processamento dos dados e J.M.C. pela análise dos dados. Todos os autores contribuíram para a redação do manuscrito. Estendemos nossos agradecimentos a ChulMin Oh e Chungha Lee por valiosas discussões técnicas e assistência na preparação de figuras.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de 48 poçosCorning3548Prato de cultura
Solução de recuperação de célulasCorning354253Degradação do matrigel 
CisplatinasupelcoPHR1624N/A
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Veículo
Tubo EppendorfCorningMCT-175-C-SN/A
Servidor de processamento HTXTomocube Inc., CoreiaN/AServidor de processamento de dados
HT-X1Tomocube Inc., CoreiaN/ASoftware operacional
IlastikN/AN/AKit de ferramentas de segmentação baseado em aprendizado de máquina
Suporte para vaso de prato de imagem Tomocube Inc., CoreiaN/ASuporte para antena de imagem
Meio de Crescimento Organoide IntestiCult (Mouse)Tecnologias STEMCELL#06005Meio de cultura pré-fabricado disponível comercialmente 
Laboratório de MatemáticaObras de MatemáticaMatlab 2024aSoftware para processamento de imagens
MatrigelCorning356231ECM para organoides 3D
Millipore  Steritop  Filtro superior de garrafa de vácuoMerckS2GPT05RE0,22 μ Unidade de filtro M para esterilização média
Organoides intestinais de camundongosTecnologias STEMCELL#70931N/A
RefratômetroATAGOR-5000Calculadora de índice de refração
TomoDishTomocube Inc., Coreia901002-02#1.5 Prato de imagem com fundo de lamínula
TomoStudio XTomocube Inc., CoreiaN/ASoftware de imagem
TrypLEGibco12604Dissociação de célula única

References

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