Artigo de método
Aqui, apresentamos um protocolo para otimizar a germinação assibiótica de sementes, o desenvolvimento de plântulas e o alongamento da parte aérea em Hemipilia cucullata. O protocolo também permite a indução de corpos semelhantes a protocormos a partir de explantes de folhas estéreis, facilitando a propagação in vitro eficiente para a conservação e uso sustentável desta orquídea medicinal ameaçada de extinção.
Hemipilia cucullata (Orchidaceae ) é uma orquídea terrestre amplamente valorizada por suas propriedades medicinais e apelo ornamental, mas suas populações selvagens estão ameaçadas devido à degradação do habitat, baixa viabilidade de sementes e sucesso limitado de polinização. Para apoiar sua conservação e utilização sustentável, este estudo desenvolveu um protocolo otimizado para a germinação assibiótica de sementes maduras, desenvolvimento de protocormo, alongamento da parte aérea e indução de corpo semelhante a protocormo (PLB) a partir de explantes de folhas estéreis. Sementes cultivadas em meio líquido 1/2 MS suplementado com 0,5 mg/L de ANA apresentaram uma taxa de germinação de 72 ± 6%, significativamente maior do que o meio controle (46%) e sólido (31%), com a germinação iniciando-se aproximadamente 21 dias antes em cultura líquida. Os protocormos foram subcultivados em meio B5 contendo 0,5 mg/L de BA, 0,2 mg/L de NAA e 100 mL/L de água de coco, levando a uma proliferação eficiente. Após 5-6 semanas, as plântulas foram transferidas para o meio de alongamento da parte aérea (B5 suplementado com 0,5 mg/L de BA e 1 mg/L de ANA), onde exibiram alongamento robusto da parte aérea e formação de folhas saudáveis. Para a indução de PLB, a maior taxa de indução (44,3 ± 5,1%) foi alcançada em meio MS contendo BA (3 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Este protocolo abrangente e reprodutível pode ser uma plataforma eficaz para a propagação em larga escala e conservação ex situ de H. cucullata, oferecendo suporte valioso para os esforços de recuperação desta orquídea ameaçada de extinção.
Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, comumente conhecida como orquídea cucullate neottianthe, é uma orquídea terrestre selvagem nativa da Eurásia temperada e é amplamente distribuída da Polônia ao Japão1. Inicialmente classificada no gênero Neottianthe, esta espécie foi recentemente transferida para o gênero Hemipilia, seção Neottianthe, com base em evidências moleculares2. A planta cresce a partir de tubérculos subterrâneos e atinge até 30 cm de altura, produzindo flores rosadas ou vermelho-púrpura dispostas em uma haste unilateral. Dev....
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NOTA: Antes de iniciar o experimento, use equipamento de proteção individual, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança. Execute todos os procedimentos sob uma capela de fluxo laminar para esterilidade. Manuseie etanol e hipoclorito de sódio com cuidado e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos de segurança do laboratório.
1. Esterilização da cápsula e extração de sementes
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As etapas do protocolo apresentadas neste estudo representam a metodologia otimizada desenvolvida por meio de uma série de experimentos comparativos com o objetivo de melhorar a germinação assibiótica de sementes, a proliferação de protocormos, o alongamento da parte aérea e a indução de PLB em H. cucullata. Por exemplo, na seleção de PGRs para promover a germinação das sementes, o NAA aumenta o desenvolvimento do embrião e a absorção de água, enquanto o BA promove a diferenciação dos botões e a divisão celular........
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As cápsulas de orquídeas geralmente contêm numerosas sementes, muitas vezes excedendo dez mil, mas sua germinação natural é extremamente limitada devido à ausência de endosperma e sua alta dependência de associações fúngicas simbióticas e pistas ambientais específicas20. Protocolos de germinação assibiótica têm sido amplamente adotados para contornar essas limitações e permitir a propagação eficiente de mudas sob condições controladas. Por exemplo, Chen et al
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Os autores não têm nada a divulgar.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1/2 MS Sais Básicos com vitaminas | Coolaber | PM1061 | |
| 6-Benzilaminopurina | Xangai Macklin Bioquímica Technology Co., Ltd. | 1214-39-7 | |
| Poder do ágar | Beijing Chembase Technology Co., Ltd. | 1400 | |
| Banco limpo | Suzhou Purification Equipemnt Co., Ltd. | SW-CJ-2G | |
| Água de coco | BOM FAZENDEIRO | https://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs | |
| Detergente | Liby Ciência e Tecnologia | 6920174756784 | |
| Gamborg B5 Médio | Laboratórios de FitoTecnologia | G398 | |
| Garrafa de vidro | Morebetter Biotechnology Co., Ltd. | MBT-BL-240 | |
| Murashige & Sais basais Skoog | Laboratórios de FitoTecnologia | M519 | |
| Pipeta | Eppendorf | 3123000268 | |
| Balança de precisão | METTLER TOLEDO | 30834109 | |
| SPSS | Corporação Internacional de Máquinas de Negócios | Software utilizado para testes de significância estatística | |
| Sacarose | Sinopharm chemical Reagent Co., Ltd. | 20210802 | |
| Thidiazuron | Xangai Macklin Bioquímica Technology Co., Ltd. | 51707-55-2 | |
| Ácido &alfa;-naftalenoacético | Xangai Macklin Bioquímica Technology Co., Ltd. | 86-87-3 |
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