Artigo de método

Germinação assibiótica e regeneração baseada em explante foliar da orquídea medicinal ameaçada de extinção Hemipilia cucullata a partir de sementes maduras

DOI:

10.3791/68541

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19 de setembro de 2025

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1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para otimizar a germinação assibiótica de sementes, o desenvolvimento de plântulas e o alongamento da parte aérea em Hemipilia cucullata. O protocolo também permite a indução de corpos semelhantes a protocormos a partir de explantes de folhas estéreis, facilitando a propagação in vitro eficiente para a conservação e uso sustentável desta orquídea medicinal ameaçada de extinção.

Resumo

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Hemipilia cucullata (Orchidaceae ) é uma orquídea terrestre amplamente valorizada por suas propriedades medicinais e apelo ornamental, mas suas populações selvagens estão ameaçadas devido à degradação do habitat, baixa viabilidade de sementes e sucesso limitado de polinização. Para apoiar sua conservação e utilização sustentável, este estudo desenvolveu um protocolo otimizado para a germinação assibiótica de sementes maduras, desenvolvimento de protocormo, alongamento da parte aérea e indução de corpo semelhante a protocormo (PLB) a partir de explantes de folhas estéreis. Sementes cultivadas em meio líquido 1/2 MS suplementado com 0,5 mg/L de ANA apresentaram uma taxa de germinação de 72 ± 6%, significativamente maior do que o meio controle (46%) e sólido (31%), com a germinação iniciando-se aproximadamente 21 dias antes em cultura líquida. Os protocormos foram subcultivados em meio B5 contendo 0,5 mg/L de BA, 0,2 mg/L de NAA e 100 mL/L de água de coco, levando a uma proliferação eficiente. Após 5-6 semanas, as plântulas foram transferidas para o meio de alongamento da parte aérea (B5 suplementado com 0,5 mg/L de BA e 1 mg/L de ANA), onde exibiram alongamento robusto da parte aérea e formação de folhas saudáveis. Para a indução de PLB, a maior taxa de indução (44,3 ± 5,1%) foi alcançada em meio MS contendo BA (3 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Este protocolo abrangente e reprodutível pode ser uma plataforma eficaz para a propagação em larga escala e conservação ex situ de H. cucullata, oferecendo suporte valioso para os esforços de recuperação desta orquídea ameaçada de extinção.

Introdução

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Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, comumente conhecida como orquídea cucullate neottianthe, é uma orquídea terrestre selvagem nativa da Eurásia temperada e é amplamente distribuída da Polônia ao Japão1. Inicialmente classificada no gênero Neottianthe, esta espécie foi recentemente transferida para o gênero Hemipilia, seção Neottianthe, com base em evidências moleculares2. A planta cresce a partir de tubérculos subterrâneos e atinge até 30 cm de altura, produzindo flores rosadas ou vermelho-púrpura dispostas em uma haste unilateral. Devido à forma elegante e coloração atraente de suas flores, possui um valor ornamental significativo. Além disso, a planta inteira é reconhecida como uma erva medicinal em vários países, onde é amplamente utilizada para vários fins terapêuticos, incluindo o tratamento de doenças cardíacas, melhoria da circulação sanguínea, alívio de contusões e promoção da cicatrização de fraturas 3,4. Estudos fitoquímicos recentes identificaram várias antocianinas nessa espécie, como a cianidina 3-oxalilglicosídeo, a crisântema e a cianina, que possuem propriedades antioxidantes e vasoprotetoras e podem contribuir para seus efeitos medicinais 5,6.

Atualmente, as populações selvagens de H. cucullata enfrentam ameaças de perda de habitat e distúrbios ambientais, levando a graves declínios populacionais e, em algumas áreas, levando a espécie à extinção 3,7,8. No entanto, a conservação desta espécie é particularmente desafiadora devido às dificuldades em sua propagação natural. Na natureza, H. cucullata se reproduz clonalmente e sexualmente, mas ambos os modos são ineficientes. A propagação clonal natural é lenta e pouco frequente, enquanto a reprodução sexuada é limitada pelo baixo sucesso da polinização e baixa viabilidade das sementes 9,10. Além disso, investigações de campo revelaram uma estrutura etária marcadamente desequilibrada, com escassez de indivíduos juvenis e recrutamento natural limitado, especialmente em condições de estresse antrópico ou pirogênico 7,8,11. As sementes de H. cucullata, como muitas orquídeas, são minúsculas, não possuem endosperma e requerem parceiros fúngicos específicos para germinação, complicando ainda mais a regeneração natural. Consequentemente, apesar de sua ampla distribuição geográfica, o tamanho da população e a estrutura etária das populações selvagens estão diminuindo e os riscos de extinção local estão aumentando7. Portanto, o estabelecimento de um método eficiente para propagação artificial rápida é essencial tanto para a conservação dos recursos de germoplasma quanto para a utilização sustentável dessa espécie de orquídea.

Entre as técnicas de propagação disponíveis, a germinação simbiótica - contando com a associação com fungos micorrízicos de orquídeas - pode simular de perto os processos naturais, mas muitas vezes é difícil de padronizar devido à sua dependência de parceiros fúngicos específicos da espécie12 , 13 , 14 . Em contraste, a germinação assibiótica oferece uma alternativa mais simples e reprodutível, amplamente utilizada em sistemas de cultura de tecidos de orquídeas15. Embora protocolos de germinação assibiótica e propagação rápida tenham sido desenvolvidos para várias orquídeas medicinais, como Bletilla, Dendrobium e Cypripedium 16,17,18,19, a otimização específica da espécie de meios de cultura e condições de cultura de tecidos para H. cucullata ainda é necessária.

Neste estudo, usamos sementes maduras de H. cucullata obtidas por meio de polinização cruzada manual de indivíduos selvagens (Figura 1A) no Monte Tianmu, no leste da China (30 ° 20 ′ N, 119 ° 22 ′ E) para estabelecer e otimizar um protocolo eficaz para germinação de sementes assibióticas, desenvolvimento de plântulas e alongamento da parte aérea. Além disso, desenvolvemos um sistema de regeneração a partir de explantes foliares via indução de PLBs, contribuindo assim para a conservação e cultivo desta orquídea medicinal ameaçada de extinção.

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Protocolo

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NOTA: Antes de iniciar o experimento, use equipamento de proteção individual, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança. Execute todos os procedimentos sob uma capela de fluxo laminar para esterilidade. Manuseie etanol e hipoclorito de sódio com cuidado e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos de segurança do laboratório.

1. Esterilização da cápsula e extração de sementes

  1. Colocar a cápsula num copo. Adicione 1-2 gotas de detergente e enxágue abundantemente com água da torneira para remover os contaminantes da superfície.
  2. Lave a cápsula em água corrente durante 5 min. Absorva a água da superfície com papel absorvente estéril.
  3. Transfira a cápsula para uma bancada de trabalho estéril para posterior desinfecção.
  4. Mergulhe a cápsula em etanol a 75% (v/v) por 30 s.
  5. Esterilize a cápsula imergindo-a em 50 mL de solução de hipoclorito de sódio a 20% (v/v) (diluída de um alvejante comercial contendo ~5% de cloro disponível), com a adição de 2 gotas de detergente doméstico não diluído por 10-12 min.
  6. Enxágue a cápsula cinco vezes com água destilada estéril para remover o desinfetante residual.
  7. Usando um bisturi estéril, remova aproximadamente 1 mm do ápice e da base (extremidade do pedicelo) da cápsula.
  8. Faça uma pequena incisão na extremidade superior da cápsula para expor as sementes. Coloque a cápsula em uma placa de Petri estéril para extração de sementes.

2. Preparação do meio de cultura

  1. Prepare 1/2 meio líquido MS: Use metade das concentrações de macronutrientes do meio MS padrão, retenha todos os outros componentes como no meio MS, adicione 20 g / L de sacarose e ácido α-naftalenoacético (NAA, 0,5 mg / L) e ajuste o pH para 5,8.
  2. Após a fervura, dispense o meio em frascos de cultura de 500 mL imediatamente (o número de frascos pode ser ajustado de acordo com a escala de propagação desejada).
  3. Coloque o meio dispensado em uma autoclave e esterilize a 121 °C por 15 min. Após a esterilização, remova o meio da autoclave e deixe-o esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.

3. Germinação de sementes

  1. Use uma pinça estéril para dispersar uniformemente aproximadamente 500-600 sementes em cada frasco de meio (preparado na etapa 2.3). Deixe as sementes absorverem água e se depositarem no fundo do meio líquido.
  2. Manter as culturas a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h e uma intensidade de luz de 36 μmol·m-2·s-1.
  3. Observe a germinação das sementes semanalmente, registre as mudanças morfológicas e tire fotos para documentação.
  4. Após aproximadamente 12 semanas, quando a maioria das sementes tiver germinado, conte o número de sementes germinadas e calcule a taxa de germinação. Use um loop de inoculação estéril para coletar aleatoriamente um loop cheio de meio líquido contendo sementes. Transferir as sementes amostradas para uma placa de Petri ou lâmina de vidro e observar ao microscópio estereoscópico.
  5. Conte o número de sementes que formaram protocormos à medida que germinaram. Calcule a taxa de germinação usando a seguinte fórmula:
    Taxa de germinação (%) = (Número de sementes germinadas/Número total de sementes na amostra) × 100.

4. Subcultura e proliferação de protocormos

  1. Prepare o meio de proliferação suplementando o meio B5 (3,21 g/L) com água de coco (100 mL/L), 6-benzilaminopurina (BA, 0,5 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Adicione 20 g/L de sacarose e 7,3 g/L de ágar e ajuste o pH para 5,8.
  2. Após a fervura, distribua o meio em frascos de cultura de 150 mL imediatamente (o número de frascos pode ser ajustado de acordo com a escala de propagação desejada).
  3. Coloque o meio dispensado em uma autoclave e esterilize a 121 °C por 15 min. Deixe o meio esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.
  4. Transfira assepticamente 10-15 protocormos germinados (0,3-1 cm de tamanho) por frasco para o meio de cultura preparado na etapa 4.3.
  5. Após um período de cultivo de 5 semanas, avaliar o estado de proliferação e registar o número de protocormos recém-formados por frasco.
  6. Continue cultivando os protocormos proliferados por mais 4-6 semanas para permitir o desenvolvimento em plântulas com ápice de brotos visíveis e estruturas semelhantes a rizóides antes da transferência para alongamento de brotos.
    NOTA: Manter as culturas a 25 °C, com um ciclo claro/escuro de 12 h e uma intensidade luminosa de 36 μmol·m-2·s-1.

5. Alongamento do tiro

  1. Prepare o meio para o alongamento dos brotos suplementando o meio B5 (3,21 g/L) com BA (0,5 mg/L) e NAA (1 mg/L). Adicione 20 g/L de sacarose e 7,3 g/L de ágar e ajuste o pH para 5,8.
  2. Após a fervura, dispense o meio em frascos de cultura de 150 mL (o número de frascos pode ser ajustado de acordo com a escala de propagação desejada).
  3. Selecione mudas saudáveis (1-2 cm de tamanho, sem escurecimento óbvio ou amarelecimento completo) para alongamento dos brotos. Usando uma pinça esterilizada e resfriada, transfira assepticamente 8-12 plântulas para cada frasco de cultura de 150 mL contendo meio fresco preparado na Etapa 5.1. Certifique-se de que as mudas estejam distribuídas uniformemente dentro de cada garrafa.
  4. Após um período de alongamento de brotos de 5 semanas, selecione plântulas com brotos totalmente desenvolvidos e folhas saudáveis para amostragem de explante foliar.
    NOTA: Manter as culturas a 25 °C, com um ciclo claro/escuro de 12 h e uma intensidade luminosa de 36 μmol·m-2·s-1.

6. Indução de PLBs a partir de explantes foliares

  1. Prepare o meio de indução PLBs suplementando o meio basal MS (4,43 g/L) com BA (3 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Adicione 20 g/L de sacarose e 7,3 g/L de ágar e ajuste o pH para 5,8.
  2. Após a fervura, dispense o meio em frascos de cultura de 150 mL (o número de frascos pode ser ajustado de acordo com a escala de propagação desejada).
  3. Selecione plântulas saudáveis após 5 semanas de alongamento dos brotos (etapa 5.4). Extirpar as folhas estéreis totalmente expandidas, remover a região apical e as margens e cortar cada folha em segmentos de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm, utilizando um bisturi estéril em condições assépticas.
  4. Coloque os 10 segmentos de folha no meio de indução PLB com a superfície adaxial voltada para cima, garantindo um contato firme com a superfície do meio.
  5. Após 5 semanas de cultura, avaliar o número de PLBs induzidas com sucesso e calcular a taxa de indução (%). Além disso, registre a altura média das gemas (cm) e o número de gemas formadas por explante.
    NOTA: Manter as culturas a 25 °C, com um ciclo claro/escuro de 12 h e uma intensidade luminosa de 36 μmol·m-2·s-1.

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Resultados

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As etapas do protocolo apresentadas neste estudo representam a metodologia otimizada desenvolvida por meio de uma série de experimentos comparativos com o objetivo de melhorar a germinação assibiótica de sementes, a proliferação de protocormos, o alongamento da parte aérea e a indução de PLB em H. cucullata. Por exemplo, na seleção de PGRs para promover a germinação das sementes, o NAA aumenta o desenvolvimento do embrião e a absorção de água, enquanto o BA promove a diferenciação dos botões e a divisão celular....

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Discussão

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As cápsulas de orquídeas geralmente contêm numerosas sementes, muitas vezes excedendo dez mil, mas sua germinação natural é extremamente limitada devido à ausência de endosperma e sua alta dependência de associações fúngicas simbióticas e pistas ambientais específicas20. Protocolos de germinação assibiótica têm sido amplamente adotados para contornar essas limitações e permitir a propagação eficiente de mudas sob condições controladas. Por exemplo, Chen et al

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1/2 MS Sais Básicos com vitaminasCoolaberPM1061
6-BenzilaminopurinaXangai Macklin Bioquímica Technology Co., Ltd.1214-39-7
Poder do ágarBeijing Chembase Technology Co., Ltd.1400
Banco limpoSuzhou Purification Equipemnt Co., Ltd.SW-CJ-2G
Água de cocoBOM FAZENDEIROhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
DetergenteLiby Ciência e Tecnologia6920174756784
Gamborg B5 MédioLaboratórios de FitoTecnologiaG398
Garrafa de vidroMorebetter Biotechnology Co., Ltd.MBT-BL-240
Murashige & Sais basais SkoogLaboratórios de FitoTecnologiaM519
PipetaEppendorf3123000268
Balança de precisãoMETTLER TOLEDO30834109
SPSSCorporação Internacional de Máquinas de NegóciosSoftware utilizado para testes de significância estatística
SacaroseSinopharm chemical Reagent Co., Ltd.20210802
ThidiazuronXangai Macklin Bioquímica Technology Co., Ltd.51707-55-2
Ácido &alfa;-naftalenoacéticoXangai Macklin Bioquímica Technology Co., Ltd.86-87-3

Referências

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