Artigo de método

Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento

DOI:

10.3791/68568

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6 de agosto de 2025

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1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo de vídeo ilustra como realizar a tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes virológicos. Para obter os melhores resultados, as amostras são preparadas por congelamento de alta pressão e subsequente substituição por congelamento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia eletrônica (EM) e especialmente as técnicas de EM tridimensionais (3D) tornaram-se métodos estabelecidos em virologia estrutural. A investigação da alteração da ultraestrutura celular induzida por vírus, como fábricas de replicação induzida pelo vírus Zika (ZIKV) ou organelas de replicação do coronavírus, exige imagens 3D. A tomografia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) é um método amplamente utilizado, apesar de sua limitação a amostras com espessura de até 200 nm. A tomografia de microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizada (SEM) pode produzir dados 3D de volumes maiores com resolução isotrópica, embora normalmente mais baixa. Técnicas alternativas, como microscopia eletrônica de varredura facial em bloco (BF-SEM), tomografia de matriz SEM ou imagem TEM de seções seriais são usadas para imagens de volumes maiores. No entanto, em comparação com as técnicas mencionadas anteriormente, essas técnicas têm o custo de uma resolução muito menor ao longo do eixo Z da amostra. Uma técnica que fornece informações 3D de amostras de até 1 μm de espessura com resolução isotrópica de alguns nanômetros é a tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM).

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de amostras virológicas congeladas de alta pressão, substituídas por congelamento e embebidas em resina e sua análise usando tomografia STEM. Este protocolo se beneficia das vantagens da imagem à temperatura ambiente, preservando a ultraestrutura biológica em um estado quase nativo. Mostramos dois exemplos representativos de perguntas que podem ser respondidas usando a tomografia STEM. Primeiro, aplicamos o protocolo para estudar a morfogênese do vírion de um vírus da estomatite vesicular recombinante (VSV). Os tomogramas STEM oferecem informações sobre brotamento de VSV recombinante que, de outra forma, não seriam acessíveis por imagens 2D. Em segundo lugar, mostramos microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM) usando imagens de transferência de energia de ressonância de Foerster (FRET) e tomografia STEM, (FRET-3D-CLEM) de nanofibrilas peptídicas EF-C. Esta combinação publicada recentemente fornece novos insights sobre a captação e desmontagem de nanofibrilas peptídicas que aumentam a infecção, especialmente lucrando com o grande volume acessível pela tomografia STEM.

Introdução

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Figura 1: Comparação de diferentes técnicas de microscopia 3D, considerando resolução, instrumentação, tempo de aquisição e esforço. O volume máximo viável das técnicas está entre a tomografia crio-TEM, tecnicamente exigente, que oferece resolução molecular, e a microscopia de luz, onde a resolução é limitada pelo limite de difração da luz. Abreviaturas: TEM = microscopia eletrônica de transmissão; STEM = TEM de varredura; MEV = microscopia eletrônica de varredura; FIB = feixe de íons focalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As estruturas e sistemas relacionados ao vírus abrangem uma escala do regime sub-angstrom (por exemplo, pequenas moléculas para viroterapia, proteínas virais isoladas) a vários metros (por exemplo, organismos infectados inteiros). As partículas virais estão na faixa de 20-1.000 nm e são investigadas principalmente em seu contexto biológico, como células hospedeiras e linhagens de células produtoras virais, que estão na faixa de μm. A visualização de estruturas específicas relacionadas ao vírus depende, portanto, da escolha de uma técnica que forneça um campo de visão suficiente e resolução adequada. O estudo de células infectadas por vírus e pedaços de tecido depende de técnicas de microscopia (Figura 1). Embora as imagens gerais de células e tecidos possam ser adquiridas usando microscopia de luz clássica, as estruturas intracelulares envolvidas na replicação do vírus são frequentemente estudadas usando microscopia eletrônica (EM). Embora hoje em dia seja usado principalmente em pesquisa virológica básica, o EM também é usado em diagnósticos 1,2 e também encontrou seu caminho em aplicações biofarmacêuticas3.

Freqüentemente, as abordagens EM 2D, como a microscopia eletrônica de transmissão clássica (TEM), não podem responder suficientemente a uma determinada questão biológica. Em virologia, este é especialmente o caso quando se estuda as interações vírus-célula hospedeira, como ligação e entrada de vírion, formação de fábricas virais ou morfogênese de vírion 4,5,6,7,8,9. Portanto, a tomografia EM é usada para analisar a ultraestrutura 3D de amostras biológicas. Em princípio, existem duas maneiras de adquirir um tomograma de uma determinada amostra: 1) imagem passo a passo de fatias seriais que são posteriormente combinadas em uma pilha de imagens 3D, ou 2) aquisição de projeções de diferentes ângulos de visão da amostra seguida de reconstrução computacional das informações em uma pilha de imagens virtuais.

As técnicas do primeiro tipo incluem imagens de seções seriadas por MET ou SEM (tomografia de matriz SEM), SEM de face de bloco serial e tomografia de feixe de íons focalizado (FIB)-SEM. As imagens SEM e TEM de seções seriais não têm a resolução em z, que é limitada pela espessura da seção, mas fornece um grande campo de visão e depende de equipamentos que estão prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios EM4. A tomografia FIB-SEM pode produzir resolução isotrópica, mas os custos de dispositivo e manutenção podem ser desafiadores, e a imagem de células inteiras em resolução isotrópica é demorada 9,10.

O segundo tipo de tomografia depende exclusivamente da transmissão do feixe de elétrons através de uma amostra. Isso pode ser feito usando duas modalidades de imagem diferentes: TEM ou microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM). Embora a tomografia TEM seja mais difundida e mais fácil de implementar, a espessura da seção é limitada a ~ 200 nm. Portanto, estruturas maiores que a espessura da seção, como mitocôndrias, vesículas ou vírions, não podem ser visualizadas em um único tomograma. A tomografia STEM oferece a possibilidade de obter imagens de amostras de até 1 μm de espessura11,12. No entanto, requer um STEM com alta tensão de aceleração (≥200 kV) e uma configuração que suporte altos ângulos de inclinação, bem como um pequeno ângulo de semiconvergência13. Embora a imagem STEM seja uma técnica comum na ciência dos materiais, ela continua sendo uma técnica rara em laboratórios de EM biológicos.

Aqui, apresentamos uma abordagem orientada para a aplicação para usar a tomografia STEM para espécimes virológicos. Devido à alta complexidade e à natureza trabalhosa da tomografia EM, a preparação de amostras de alta qualidade é crucial. Embora a TEM criogênica (tomografia) seja, sem dúvida, o padrão-ouro para investigações em nível molecular, a imagem em temperatura ambiente de células congeladas e substituídas por congelamento de alta pressão fornece uma preservação sólida e clareza da ultraestrutura celular 7,14. Resumidamente, as células aderentes são cultivadas em um disco de safira e infectadas ou tratadas conforme desejado. As células são então imobilizadas congelando-as sob alta pressão a taxas de resfriamento muito altas, resultando na vitrificação da água em seu interior. Posteriormente, a água é substituída por um solvente enquanto as amostras são contrastadas e lentamente trazidas de volta à temperatura ambiente. As amostras são então gradualmente incorporadas em resina.

Existem muitos protocolos para congelamento de alta pressão e substituição por congelamento, que diferem no maquinário, sistema de transporte e composição da amostra. Protocolos detalhados para congelamento de alta pressão foram publicados, incluindo um de Walther et al.15 e um protocolo de vídeo de Steyer et al.16, que se concentra na preparação de tecidos para FIB-SEM usando aprimoramento de contraste assistido por micro-ondas. Para pesquisa virológica, Read et al.17 e Romero-Brey18 publicaram protocolos detalhados para a preparação de células infectadas por vírus por congelamento de alta pressão com discos de safira e posterior análise por tomografia eletrônica. A secção ultrafina também foi descrita anteriormente15,17. Consulte a literatura citada para obter mais detalhes sobre essas abordagens.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho que é uma versão adaptada e atualizada dos protocolos publicados anteriormente 15,17 emparelhados pela primeira vez com um guia de vídeo detalhado. O protocolo fornece um fluxo de trabalho para preparação de amostras usando congelamento de alta pressão, substituição por congelamento e incorporação em resina epóxi. Seções de 800 nm a 1.000 nm de espessura são cortadas usando um ultramicrótomo. Uma série de inclinação é adquirida com um STEM de 200 kV, usando as ferramentas EM do software. Este protocolo é otimizado para células aderentes e fornece um fluxo de trabalho abrangente, permitindo modificações para outros tipos de amostras, como células de tecido ou suspensão. Para tomografia STEM em condições criogênicas, consulte o trabalho do grupo de Michael Elbaum19,20.

Protocolo

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1. Cultura de células

  1. Preparação de discos de safira
    1. Limpe os discos de safira lavando 3x em etanol 100% por 20 min. Remover o etanol restante puxando os discos sobre um papel de filtro seco. Deixar os discos numa câmara de secagem a 37 °C durante, pelo menos, 30 minutos ou até estarem completamente secos.
      NOTA: Neste protocolo, são utilizados discos de safira com diâmetro de 3 mm e espessura de 0,16 mm. Para outros sistemas, um fluxo de trabalho otimizado para células de tecido ou suspensão, consulte Walther et al.15. Algumas "dicas e truques" para células cultivadas e outros sistemas são fornecidas por McDonald et al.21.
    2. Revestir os discos de safira com carbono colocando aproximadamente 50 discos de safira planos em um vidro de relógio limpo e revestindo-os com uma camada de carbono de 10 a 15 nm de espessura usando um dispositivo de revestimento de carbono. Cozer os discos durante a noite a 120 °C para estabilizar a camada de carbono.
      NOTA: Para abordagens EM correlativas, introduza um sistema de coordenadas: coloque uma grade localizadora no topo dos discos de safira antes do revestimento de carbono, de modo que a grade fique visível como um negativo no disco21.
    3. Para ser capaz de identificar o lado revestido de carbono do disco de safira mais tarde, use uma ferramenta afiada (por exemplo, a ponta de uma pinça) para riscar uma marca no carbono que só pode ser lida corretamente de um lado.
      NOTA: Recomendamos o número "2" ou similar (Figura 2A,B). Ignore esta etapa para discos de safira com um sistema de coordenadas revestido.
    4. Armazenar os discos de safira numa câmara de secagem a 37 °C até nova utilização.
      NOTA: Não é aconselhável reutilizar discos de safira, pois isso aumenta a probabilidade de quebra durante o congelamento de alta pressão.
  2. Cultura de células
    1. Pouco antes da colocação em cultura de células, descarregue o lado revestido de carbono dos discos com um dispositivo de descarga luminescente para torná-los hidrofílicos (por exemplo, 0,26 mbar com uma corrente de 20 mA por 40 s). Em seguida, esterilize os discos expondo-os à luz ultravioleta por 15 min.
      NOTA: A exposição à luz UV por mais de 30 minutos pode danificar o revestimento de carbono.
    2. Use uma pinça estéril para colocar os discos no fundo de uma placa de cultura contendo meios, garantindo que os discos não flutuem. Semeie cuidadosamente as células por cima. Caso os discos de safira flutuem nos meios de cultura de células, descarregue por mais tempo ao repetir o experimento.
      NOTA: É crucial que o "2" esteja orientado corretamente, o que significa que o lado revestido de carbono está voltado para cima. Uma monocamada de célula nos discos com uma confluência final de ~ 80% é desejada. O crescimento celular nos discos de safira pode diferir daquele na placa de cultura circundante. Verifique a distribuição e a qualidade das células nos discos com um microscópio de luz invertida antes de continuar com o protocolo. A distribuição das células pode ser melhorada balançando suavemente a placa enquanto semeia as células.
      Para as células em suspensão, cobrir os discos de safira revestidos de carbono com poli-L-lisina ou utilizar capilares, conforme descrito noponto 15. Não exponha discos revestidos de poli-L-lisina à luz UV, pois isso pode danificar o revestimento de poli-L-lisina.
    3. Realize qualquer tratamento desejado das células (por exemplo, infecção, tratamento medicamentoso) enquanto mantém os discos de safira no lugar. Manuseie os discos com cuidado para evitar o desprendimento das células ou arranhões na camada de carbono. Incube as células de acordo. Realize a prefixação química com, por exemplo, 2,5% de glutaraldeído, 1% de sacarose em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3) ou 4% de paraformaldeído, de acordo com os regulamentos locais, antes de transportar as amostras para o freezer de alta pressão 1,7,22.
      NOTA: Antes de infectar samples deixar laboratórios de nível de biossegurança, cumpra todos os regulamentos locais de biossegurança aplicáveis ao sistema modelo.

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Figura 2: Congelamento de alta pressão. (A) Discos de safira mostrando revestimento de carbono com "2" (esquerda) ou um sistema de coordenadas para luz correlativa e microscopia eletrônica (direita). (B) Representação esquemática de um sanduíche SD-gold spacer-SD enquanto é preparado para congelamento de alta pressão. As células cultivadas nos discos ficam de frente umas para as outras e, portanto, são protegidas na cavidade apertada. (C) Suporte para congelamento de alta pressão que contém um sanduíche SD. (D) Materiais e dispositivos para carregar o suporte HPF: (1) Placa de aquecimento, (2) Microscópio estéreo, (3) Papel de filtro, (4) Tubo de reação contendo 1-hexadeceno, (5) Pinças, (6) SDs não revestidos, (7) Placa de Petri com espaçadores de ouro, (8) Suporte HPF. (E) Configuração do sistema HPF: (1) Caixa LN para transferência de amostras congeladas (ver também F), (2) Secador de cabelo para acelerar o aquecimento do suporte HPF após o congelamento, (3) Dewar de nitrogênio para reabastecer a caixa LN. (F) Caixa LN para armazenar amostras congeladas após congelamento de alta pressão com uma calha central (contorno pontilhado) na qual o suporte HPF pode ser aberto e os SDs podem ser manuseados com segurança. Materiais necessários diretamente após o congelamento de alta pressão: (1) Suporte para até seis recipientes de amostra, (2) Pinças isoladas, (3) Recipientes de amostra com tampa. Os recipientes contêm pequenos orifícios e pequenos pesos (por exemplo, um parafuso) para que sejam imersos em nitrogênio líquido. Abreviaturas: SD = disco de safira; HPF = congelador de alta pressão; LN = nitrogênio líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação da amostra para microscopia eletrônica

  1. Congelamento de alta pressão
    NOTA: Este protocolo descreve o congelamento de alta pressão com o freezer de alta pressão referenciado (HPF, Tabela de Materiais). As etapas descritas não devem diferir muito para outras máquinas, pois servem ao mesmo propósito.
    1. Siga as instruções do fabricante para configurar o freezer de alta pressão. Garanta um suprimento adequado de nitrogênio líquido (Figura 2E), ligue a máquina e faça um teste.
    2. Configure uma área de trabalho para carregar os discos no suporte HPF (Figura 2D). Tenha os seguintes itens prontos: uma placa de aquecimento (1), um microscópio estéreo (2), pedaços de papel de filtro (3), tubo de reação com hexadeceno como enchimento (4), pinças (5), discos de safira vazios / não revestidos para congelar um número ímpar de SDs com células (6), espaçadores de ouro (7) e o suporte HPF (8, detalhe na Figura 2C).
    3. Prepare um espaço de trabalho para o manuseio de amostras congeladas (Figura 2E,F). Antes de iniciar o congelamento de alta pressão, prepare os seguintes equipamentos:
      1. Prepare a caixa LN e encha-a com nitrogênio líquido (Figura 2E, F) em preparação para manusear e transferir os discos de safira congelados do suporte HPF para as cápsulas de armazenamento.
      2. Prepare um pequeno dewar (3 na Figura 2E) e encha-o com nitrogênio líquido: esteja preparado para reabastecer a caixa LN com nitrogênio líquido várias vezes durante o processo de congelamento.
      3. Mantenha as pinças isoladas (2 na Figura 2F) prontas.
      4. Prepare recipientes de amostra que conterão os discos de safira após o congelamento de alta pressão (cápsulas de armazenamento, 3 na Figura 2F). Certifique-se de que eles tenham uma tampa e vários orifícios para o nitrogênio líquido entrar e pequenos pesos (por exemplo, pequenos parafusos ou similares) para garantir que não flutuem. Etiquete os recipientes antes de usá-los e pré-resfrie-os na caixa LN.
        NOTA: Usamos cápsulas BEEM como cápsulas de armazenamento.
    4. Manter as amostras numa incubadora perto do congelador de alta pressão, se as células não tiverem sido prefixadas, ou, se não for possível, numa placa aquecida (1 na figura 2D), para manter as condições fisiológicas (37 °C, 5% CO2) durante o maior tempo possível.
    5. Certifique-se de um número suficiente de células nos discos de safira e boa qualidade da célula antes de iniciar o congelamento de alta pressão. Para fazer isso, inspecione os discos usando um microscópio de luz invertida.
    6. Realize o congelamento de alta pressão.
      1. Pegue um disco de safira da placa de cultura com uma pinça e coloque-o no suporte HPF (Figura 2C) com o lado revestido de carbono voltado para cima ("2" é legível). Antes disso, remova o excesso de mídia mergulhando o disco rapidamente em papel de filtro, mas tome cuidado para não deixar as células secarem.
      2. Mergulhe um espaçador de ouro em hexadeceno e coloque-o cuidadosamente em cima do disco de safira. Pegue um segundo disco de safira e posicione-o em cima do espaçador de ouro com o lado revestido de carbono voltado para baixo, formando um disco de safira - espaçador de ouro - sanduíche de disco de safira com as células apontando uma para a outra. Certifique-se de que não haja ar preso na cavidade do sanduíche.
      3. Feche o suporte HPF. Execute esta etapa com cuidado, mas rapidamente, para minimizar o estresse na amostra, principalmente para células vivas que não foram prefixadas.
        NOTA: Para amostras contendo substâncias cancerígenas, mutagênicas ou tóxicas para a reprodução (CMR), como fixadores químicos, carregue o suporte HPF sob uma capela para minimizar a exposição.
      4. Inicie o processo de congelamento. Insira rapidamente o suporte HPF no freezer de alta pressão, trave-o de acordo com as instruções do fabricante e inicie o processo de congelamento.
    7. Remova as amostras vitrificadas do suporte HPF. Transfira rapidamente a ponta do suporte HPF que transporta os discos de safira agora congelados para a caixa LN pré-resfriada. Remova os discos cuidadosamente do suporte HPF para a calha central na caixa LN (linha tracejada na Figura 2F). Depois disso, aqueça o suporte HPF e remova qualquer etanol ou hexadeceno residual antes de começar a montar o próximo sanduíche.
      NOTA: A partir de agora, certifique-se de que tudo o que toca nos discos seja pré-resfriado em nitrogênio líquido. Execute as etapas de transferência rapidamente em uma atmosfera de nitrogênio e armazene os discos em nitrogênio líquido para evitar o descongelamento da amostra. Pratique a transferência do suporte do HPF para a caixa LN com antecedência para garantir uma transição suave e rápida. O processo de aquecimento do suporte pode ser acelerado após o congelamento usando um secador de cabelo (2 na Figura 2E).
    8. Depois de remover os discos de safira do suporte, coloque-os nos recipientes rotulados para transferência para o dispositivo de substituição por congelamento ou para armazenamento de nitrogênio líquido até processamento posterior. Se os discos de safira estiverem bem empilhados após o HPF, use um bisturi para separar os discos de safira antes da substituição por congelamento.
      NOTA: Tome cuidado para não quebrar os discos e evite forças de cisalhamento. Planeje tempo suficiente para esta etapa.
  2. Substituição por congelamento
    1. Configure o dispositivo de substituição por congelamento seguindo as instruções do fabricante. Encha o dewar de nitrogênio líquido e inicie o programa para pré-resfriar a câmara de amostra a -90 °C. Certifique-se de que haja nitrogênio líquido suficiente para todo o processo de substituição.
      NOTA: Os produtos químicos envolvidos são perigosos. Execute todas as etapas sob uma hotte e cumpra as diretrizes locais de meio ambiente, saúde e segurança (EHS).
    2. Prepare a solução de substituição por congelamento contendo 0,1% (p / v) de acetato de uranila, 0,2% (p / v) de tetróxido de ósmio (OsO4) e 5% (v / v) de água em acetona. Para preparar um volume de 6 mL (suficiente para preencher 24 criogeniais, o que equivale à capacidade máxima do dispositivo de substituição usado aqui), siga estas etapas:
      1. Pesar 6 mg de acetato de uranilo para um recipiente de vidro com tampa hermética.
      2. Adicione 300 μL de tetróxido de ósmio a 4% (p / v) em água.
      3. Feche o vaso e sonice por 5 min para dissolver o acetato de uranila.
      4. Adicione 5,7 mL de acetona, misture e divida uniformemente a solução em criogeniais compatíveis com o dispositivo de substituição por congelamento.
    3. Colocar os criotubos fechados contendo a solução de substituição por congelação no dispositivo de substituição por congelação pré-arrefecido a -90 °C e esperar até que a solução também arrefeça até -90 °C (durante cerca de 20 minutos).
    4. Encha a caixa LN com nitrogênio líquido. Para transferir os discos de safira para o dispositivo de substituição por congelamento, pinças de pré-resfriamento, bisturi e alicates (ou pinças grandes) em nitrogênio líquido.
    5. Use as pinças grandes pré-resfriadas para transferir as cápsulas de armazenamento com as amostras congeladas de alta pressão do tanque de armazenamento para a caixa LN.
      NOTA: Trabalhe rapidamente para evitar qualquer descongelamento das amostras. Ao processar amostras diretamente após o congelamento de alta pressão, esta etapa pode ser ignorada.
    6. Transferir as amostras congeladas a alta pressão para o dispositivo de substituição por congelação. Separe os discos de safira um por um, mantendo-os em nitrogênio líquido. Transfira rapidamente cada disco individualmente para uma solução criogênica com substituição por congelamento, garantindo que o disco esteja totalmente imerso. Feche o criogênico e coloque-o imediatamente de volta no dispositivo de substituição por congelamento.
      NOTA: Durante a transferência, mantenha o criovial na atmosfera de nitrogênio líquido para evitar que a solução de substituição aqueça, mas não em nitrogênio líquido para evitar que congele. Segure o frasco para injetáveis com os dedos perto da tampa para evitar o aquecimento da solução de substituição. Manuseie a solução de substituição com cuidado, pois contém substâncias tóxicas.
    7. Depois que todos os discos forem transferidos para o dispositivo de substituição, inicie o processo de congelamento de substituição. Ajuste o dispositivo para aumentar gradualmente a temperatura durante 16 h de -90 °C para 0 °C, com uma etapa de incubação de 1 h a 0 °C, seguida de um aumento gradual para 20 °C durante 1 h.
    8. Assim que as amostras atingirem 20 °C, continue diretamente com a lavagem das amostras por 3 x 30 min com 100% de acetona.
      NOTA: Não deixe as células dos discos secarem. Execute todas as etapas subsequentes sob uma hotte. Colete todos os resíduos em um recipiente adequado e descarte-os de acordo com os regulamentos locais de EHS.
  3. Incorporação
    1. Prepare a resina epóxi de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Execute todas as etapas com resina epóxi sob uma hotte. Recomendamos preparar resina fresca para cada procedimento de incorporação devido à menor viscosidade e, portanto, melhor infiltração da amostra.
    2. Para pré-embutir as amostras, incubar as amostras em uma solução contendo 1/3 de resina epóxi e 2/3 de acetona por 1 h. Substitua a solução por 2/3 de resina epóxi e 1/3 de acetona e incube por 3 h. Troque a solução por resina epóxi 100% e deixe incubar durante a noite com a tampa do frasco aberta para permitir que a acetona restante evapore.
    3. No dia seguinte, transfira os discos de safira para novos tubos de reação rotulados cheios de resina epóxi recém-preparada. Posicione os discos horizontalmente, apoiados na parede do tubo de reação, e certifique-se de que o lado com as células esteja voltado para cima no tubo de reação (o "2" é legível em um microscópio estéreo). Colocar os tubos de reacção com a tampa aberta numa estufa a 60 °C e deixar a resina epóxi polimerizar durante pelo menos 48 h.
      NOTA: Se um fragmento de disco de safira precisar ser incorporado, incorpore-o com a ajuda de uma ponta polimerizada de um bloco de resina de um experimento anterior: Coloque a ponta no tubo de reação, preencha o tubo com resina nova e coloque o disco quebrado em cima da ponta polimerizada.
      Quaisquer consumíveis de uso único contaminados com resina epóxi devem ser colocados em um forno a 60 °C para permitir que a resina polimerize totalmente antes do descarte. Pinças e outros itens podem ser limpos com etanol de antemão.
    4. Mergulhe a ponta de um tubo de reação fechado em nitrogênio líquido por aproximadamente 10 s. Em seguida, remova o bloco de resina do tubo de reação batendo no tubo de reação na mesa. O disco de safira se separa facilmente do revestimento de carbono que fica no topo das células embutidas.
      NOTA: Certifique-se de que seu meio de incorporação tolera as mudanças de temperatura induzidas pelo tratamento com nitrogênio líquido.
  4. Preparação de seções de tomografia STEM
    1. Prepare seções muito mais espessas do que seções ultrafinas para imagens TEM, geralmente entre 800 nm e 1 μm.
      NOTA: A preparação de cortes para tomografia STEM difere ligeiramente da ultramicrotomia convencional. Para um protocolo detalhado que descreve a preparação das seções de tomografia STEM, consulte Walther et al.15 e Villinger et al.10.
      Antes de continuar com a preparação das seções de tomografia STEM, certifique-se de que a qualidade das células é boa. Para isso, execute o corte ultrafino (~ 70 nm) e a análise MET ( Figura 3D, E ).
    2. Colete as seções em grades de cobre de barras paralelas, para que nenhuma barra de grade bloqueie o feixe de elétrons ao inclinar a amostra em ângulos altos. Para uma melhor fixação da seção, trate as grades com 0,01% de poli-L-lisina: prepare uma pequena alíquota de 0,01% de poli-L-lisina a partir de uma solução estoque a 0,1%, mergulhe as grades na alíquota, seque-as cuidadosamente arrastando a borda da grade sobre um papel de filtro. Descarregue as grades e use-as para coletar as seções.
    3. Trate as seções com ouro coloidal como marcadores fiduciais para alinhamento da série de inclinação (consulte a seção 3).
    4. Aplique uma camada de carbono nas seções para estabilizá-las e torná-las mais condutoras.

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Figura 3: Controle de qualidade por TEM - diferentes aparências de células após incorporação, corte e seccionamento ultrafino. (A) Células embebidas em resina epóxi após a remoção do SD. A camada de carbono com o '2' riscado permanece nas células embebidas em resina e é claramente visível. As células quase transparentes são distribuídas uniformemente pela face do bloco. (B) Face em bloco aparada antes da microtomia. Parte do 2 riscado ainda é visível na superfície do bloco de resina. (C) seções de 70 nm de espessura montadas em uma grade MET. (D) Visão geral do MET de uma seção ultrafina inteira. Observe os orifícios na seção (pontas de setas brancas) que resultam de infiltração incompleta de resina e são um artefato comum. (E) Vista ampliada de uma célula selecionada marcada com um retângulo branco em (D). Semelhante a (D), a incorporação incompleta é visível na membrana plasmática (pontas de setas brancas); no entanto, o resto da célula mostra boa preservação e incorporação. Barras de escala = 100 μm (D), 10 μm (E). Abreviaturas: SD = disco de safira; TEM = microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Exames de imagem

  1. Aquisição da série de inclinação STEM
    1. Configure o microscópio de acordo com as diretrizes do fabricante. Garanta o alinhamento adequado do feixe.
    2. Encha cuidadosamente o dewar de nitrogênio líquido no microscópio.
    3. Selecione o suporte de tomografia correto no software de operação do microscópio.
    4. Insira a grade no suporte. Preste atenção que as barras da grade são orientadas perpendicularmente ao eixo de inclinação para evitar que as barras bloqueiem o feixe de elétrons em ângulos de inclinação altos.
    5. Insira o suporte no microscópio.
    6. Alinhe a viga executando as seguintes etapas:
      1. Carregue o arquivo de alinhamento fornecido pelo fabricante. Abra a válvula de feixe e trabalhe no modo TEM por enquanto. Defina uma ampliação de aproximadamente 20.000x e defina o foco padrão pressionando Foco STD.
      2. Procure um buraco na amostra. Isso é mais fácil no modo de baixa ampliação (pressione LowMag).
      3. Certifique-se de que nenhuma abertura esteja inserida. Defina o tamanho do ponto como 1 e Alfa como 3. Minimize o feixe no viewtela girando o botão de brilho no sentido anti-horário e centralize-o com os botões de mudança de feixe.
      4. Alinhamento correto da pistola: No painel de alinhamento do software de operação do microscópio, selecione Pistola e o wobbler do ânodo. Ajuste a simetria do feixe com os botões DEF/STIG . Confirme se o movimento do feixe na tela fluorescente é homogêneo. Mova o ponto mais brilhante para o meio da tela com os botões SHIFT ; Desmarque tudo quando terminar.
      5. Estigmatizadores condensadores corretos: No mesmo painel de alinhamento , selecione CLA e o wobbler HT. Ajuste com os botões DEF/STIG para obter um movimento homogêneo.
      6. Defina a abertura da lente do condensador: Maximize o feixe na tela fluorescente girando o botão de brilho no sentido horário. Insira a menor abertura da lente condensadora e certifique-se de que esteja alinhada corretamente no feixe, alternando o brilho. Se o feixe se mover assimetricamente na tela de visualização, ajuste manualmente a abertura usando as unidades de abertura manuais. Se a abertura parecer distorcida na tela fluorescente, corrija os estigmas do condensador CLA novamente com DEF/STIG (etapa anterior 3.1.6.5).
      7. Alterne para o modo STEM (selecione ASID).
        NOTA: Você pode interromper o diálogo de relaxamento da lente após 5-10 seg.
      8. Mova o estágio para uma região fina e rica em contraste da amostra. Pressione STD Focus e remova todas as aberturas. Mude para ampliação de 25.000 com tamanho de ponto de 1,5 nm, defina o comprimento da câmera entre 80 e 120 cm e selecione o modo de ponto.
      9. Altere o valor z do goniômetro até que o ronquigrama fique visível na tela de visualização. Altere o comprimento da câmera se o ronchigrama estiver fraco. Se não for redondo, use o botão COND Stig para ajustá-lo.
      10. Insira a menor abertura da lente condensadora. Use as unidades de abertura manual para centralizar a abertura ao redor do ronchigrama.
    7. Insira o detector apropriado. Com base na questão de pesquisa, use o detector de campo claro e/ou o detector de campo escuro. Ative o modo de varredura e adquira uma primeira imagem de teste da amostra.
    8. Selecione uma ampliação maior do que a desejada para o tomograma (superior a 800.000x). Foco correto e astigmatismo: faça isso próximo, mas não diretamente na região de interesse (ROI) para evitar danos ao feixe em áreas críticas da amostra.
      NOTA: Os marcadores fiduciais de ouro podem facilitar essa etapa.
    9. Defina a altura eucêntrica para garantir que o ROI permaneça centralizado em toda a faixa de inclinação (ou seja, -72 ° a 72 °). Selecione um recurso próximo ao ROI, traga-o para o centro, concentre-se, corrija o astigmatismo e incline o palco passo a passo para - 72 °. Ajuste a posição z do suporte para manter o recurso centralizado e ajuste o contraste e o brilho, se necessário. Se necessário, repita isso inclinando passo a passo para +72 °.
    10. Escolha o campo de visão navegando de volta para o ROI, foco e obtenha uma imagem de visão geral (Figura 4). Defina a ampliação desejada para a aquisição da série de inclinação.
    11. Configure a aquisição automática de imagens em série de inclinação de -72° a +72° e imagens a cada 1,5°.
    12. Para neutralizar os efeitos mecânicos que ocorrem ao mudar a direção da inclinação do estágio, comece a série de inclinação com um ângulo maior do que aquele com o qual iniciar a imagem. Se a imagem for de -72° a 72°, comece inclinando a platina de 0° a -74° e, em seguida, inicie a aquisição da imagem no caminho para +72°, adquirindo a primeira imagem a -72°.
    13. Inicie a aquisição automática da série de inclinação. Certifique-se de ativar o foco dinâmico no software de aquisição.
      NOTA: Se a aquisição da série de inclinação for encerrada prematuramente, corrija a altura eucêntrica. Especialmente em maior ampliação, isso pode causar problemas com a aquisição automatizada da série de inclinação devido à migração do ROI para fora do campo de visão.
      Um software comumente usado para tomografia STEM e TEM é o SerialEM. Kirchweger et al.20 publicaram um protocolo de vídeo para tomografia Cryo-STEM usando SerialEM, que pode ser facilmente adaptado para tomografia STEM à temperatura ambiente.

figure-protocol-3
Figura 4: Aquisição da série de inclinação. (A) HASTE de 200 kV. (B) Visão geral STEM de uma célula congelada de alta pressão e substituída por congelamento embutida em resina epóxi. A série de inclinação mostrada em (C-E) foi adquirida na posição marcada com o retângulo branco. (CE) Imagens selecionadas de uma série de inclinação adquiridas de -72° a +72°. Fiduciais de ouro em ambos os lados da seção são usados para reconstrução de tomograma computacional. Fiduciais agrupados como os marcados com as elipses brancas não podem ser usados para reconstrução do tomograma, mas são bem reconhecíveis em altos ângulos de inclinação. Essas ou estruturas semelhantes fora da região de interesse são úteis para definir a altura eucêntrica. Barra de escala = 1 μm (B). Abreviatura: STEM = microscopia eletrônica de transmissão de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Reconstrução e segmentação do tomograma

  1. Realize a reconstrução do tomograma (por exemplo, com o software Etomo do pacote de software IMOD23).
    1. Execute o primeiro alinhamento da série de inclinação e reconstrua o tomograma usando a projeção traseira ponderada.
      NOTA: Um protocolo detalhado pode ser encontrado no site do IMOD: Guia de Tomografia IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Para processamento de imagens adquiridas com o detector de campo escuro, consulte o trabalho publicado anteriormente11,13.
  2. Segmente estruturas celulares (por exemplo, com software como 3DMOD do pacote IMOD ou soluções baseadas em IA).

Resultados

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A tomografia STEM oferece a possibilidade de obter imagens de seções mais espessas do que a tomografia TEM com resolução isotrópica na faixa nanométrica e, em comparação com a tomografia FIB-SEM, fornece um fluxo de trabalho de imagem relativamente eficiente em termos de tempo. Em virologia, isso é especialmente útil, pois permite a aquisição de imagens de um grande número de características ultraestruturais para análise estatística em 3D ou na busca de eventos raros. Aqui, mostramos dois resultados representativos que demonstram como a tomografia STEM pode ser usada em relação a esses dois aspectos.

Visualização de vírions VSV recombinantes brotantes

Existe uma grande variedade de vírus que formam partículas de diferentes formas e tamanhos. Para analisar a forma dos vírions em uma suspensão de vírus, muitas vezes um método simples como TEM de coloração negativa é suficiente. Caracterizar a morfologia dos vírions no contexto celular é mais difícil. Isso vale especialmente para vírus que formam partículas com morfologia anisotrópica, como rhabdoviridae. VSV é um rabdovírus que forma vírions em forma de bala de ~ 180 nm de comprimento. Nas células em suspensão, os vírions são orientados aleatoriamente, tornando difícil discernir sempre a forma da bala em imagens 2D (Figura 5A-C). Para definir adequadamente a forma de bala de todos os vírions VSV recombinantes em uma amostra, é necessário um método 3D com resolução isotrópica - um que também possa fornecer informações volumétricas em uma área de amostra suficientemente grande. Um tomografia STEM pode incluir muitos vírions completos em um único conjunto de dados (Figura 5D, E). Assim, é possível obter imagens de um grande número de vírions para análise estatística, mesmo que apenas um tomograma por célula seja adquirido. Em comparação, um tomograma TEM de uma seção de 200 nm de espessura capturaria apenas alguns vírions VSV recombinantes completos (conforme marcado na Figura 5E).

figure-results-1
Figura 5: Tomografia STEM de locais de brotamento de VSV recombinante. (AC) Detalhes de uma seção virtual de um tomografia STEM obtida de uma seção de 800 nm de espessura mostram que a forma da bala nem sempre é visível devido a (A, B) diferentes orientações dos vírions. (C) Apenas vírions orientados paralelamente ao plano de visualização apresentam balas bem definidas. (D) Os locais de brotamento do VSV recombinante se assemelham a grandes aglomerados de vírions sem orientação preferencial. (E) A vista lateral do tomograma demonstra a capacidade de capturar muitos vírions VSV recombinantes completos em uma seção usando tomografia STEM. A pilha de imagens virtuais tem uma espessura de aproximadamente 600 nm nesta posição. As linhas tracejadas representam a espessura aproximada de uma seção para tomografia TEM (200 nm), onde apenas alguns vírions completos em forma de bala seriam incluídos. Barra de escala = 500 nm (D). Abreviaturas: STEM = microscopia eletrônica de varredura de transmissão; VSV = vírus da estomatite vesicular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Degradação de nanofibrilas do peptídeo EF-C

No contexto da terapia gênica, as nanofibrilas peptídicas que aumentam a transdução tornaram-se um tópico de interesse. Em um estudo publicado recentemente24, imagens correlativas usando imagens de transferência de energia de ressonância de Foerster (FRET) e tomografia STEM, (FRET-3D-CLEM) foram usadas para investigar a captação e desmontagem de nanofibrilas peptídicas EF-C. Altas eficiências de FRET, correspondentes a pares de FRET próximos uns dos outros, emitem fluorescência vermelha correspondente a fibrilas montadas. Baixas eficiências de FRET, correspondentes a pares de FRET que estão distantes um do outro, emitem fluorescência verde, representando fibrilas desmontadas. Ambos os sinais aparecem nas células quando elas estão no processo de absorção e degradação das nanofibrilas do peptídeo EF-C. As áreas onde são encontradas eficiências de FRET altas e baixas aparecem em amarelo (Figura 6A).

figure-results-2
Figura 6: Imagem da degradação de nanofibrilas do peptídeo EF-C por imagem FRET correlativa e tomografia STEM. (A) Microscopia confocal de uma célula incubada com nanofibrilas EF-C que foram marcadas com um par FRET. Os sinais verdes correspondem a fibrilas supostamente desmontadas. O vermelho corresponde a fibrilas supostamente intactas. Amarelo corresponde a áreas onde uma mistura do sinal vermelho e verde é detectada. Nu núcleo. (B) Visão geral STEM de uma seção de 800 nm de espessura da mesma célula. (C) A posição do tomograma é indicada. A imagem é uma composição de duas imagens adquiridas em seções diferentes, porque a célula foi parcialmente bloqueada pela grade de barras em uma das seções. O núcleo é marcado com Nu em A, B e C. (C) Corte virtual do tomograma. As pontas das setas vermelhas marcam regiões sobrepostas com sinais de fluorescência vermelhos. A tomografia STEM confirma a presença de fibrilas intactas. A ponta da seta verde aponta para uma região com fibrilas desmontadas. (D) Segmentação do tomograma. Um filopódio endocitado está beliscando a membrana da vesícula (seta branca). O grande volume que pode ser investigado com um tomografia STEM (aqui aproximadamente: 7 μm x 7 μm x 550 nm) facilita a observação de um evento tão raro. (E) Seções virtuais 19, 24 e 29 do tomograma. Com um tamanho de pixel de 6,8 nm, as seções estão separadas por 27,2 nm. A figura é reproduzida a partir dos dados publicados por Rauch-Wirth et al.24 . Barras de escala = 5 μm (A), 1 μm (C). Abreviaturas: STEM = microscopia eletrônica de varredura de transmissão; FRET = Transferência de energia de ressonância de Foerster. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A visualização foi realizada por esta abordagem correlativa para confirmar que as fibrilas EF-C são absorvidas pela célula e subsequentemente degradadas. A microscopia de luz nos permite escolher células para microscopia eletrônica que fornecem sinais vermelhos e verdes, para comparar a aparência ultraestrutural correlacionada com os diferentes sinais de fluorescência. Os tomogramas STEM da mesma célula mostram que o sinal vermelho pode se originar de fibrilas que ainda estão fora da célula ou aparentemente recém-internalizadas pela macropinocitose ( Figura 6C ). Além disso, o CLEM verificou que o sinal verde de fato se originou de fibrilas degradadas ( Figura 6B , C que pode ser encontrada em lisossomos ( Figura 6C , maior vesícula ). Devido ao grande volume acessível pela tomografia STEM e à visualização 3D das estruturas, é mais fácil correlacionar o sinal da microscopia de luz com características ultraestruturais e interpretá-las. Além disso, eventos raros, como pinçamento de filopódios dentro do lisossomo (Figura 6D, E, seta branca) podem ser detectados com essa abordagem.

Discussão

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A tomografia STEM oferece uma resolução comparável à tomografia TEM combinada com a capacidade de investigar volumes com até 1 μm de espessura. Portanto, consideramo-lo ideal para imagens de alterações de estruturas intracelulares induzidas por vírus, como remodelação da membrana 4,6,25, brotamento de vírions 7 ou endocitose5. Dependendo da questão de pesquisa, outras técnicas do VolumeEM podem ser consideradas. Para uma técnica que fornece um campo de visão maior com uma resolução comparável, recomendamos a tomografia FIB-SEM. A tomografia FIB-SEM será mais lenta do que a tomografia STEM ao obter imagens de um volume comparável com resolução semelhante, pois o tempo de imagem aumenta quando a resolução aumenta. Muitas vezes, isso é então contramedido por imagens de campos de visão menores. Além disso, uma resolução z de 6,8 nm (Figura 6) seria tecnicamente desafiadora com a fresagem por feixe de íons. Portanto, o FIB-SEM é ideal para imagens de estruturas maiores, como células inteiras e tecidos 9,10,26,27, embora geralmente com tamanhos de pixel (isotrópicos) de várias dezenas de nanômetros. Além disso, os tomogramas FIB-SEM não mostram efeitos de "cunha ausente", o que é típico para tomogramas reconstruídos a partir de uma série de inclinação. Além disso, com o desenvolvimento de máquinas FIB de plasma, alternativas que fornecem fresagem mais rápida e ainda precisa estão sendo introduzidas no campo.

Se uma alta resolução em z não for crucial, a imagem MET ou MEV de cortes seriados pode ser uma alternativa que permite a investigação de um campo de visão muito grande em um curto espaço de tempo28,29, porém, geralmente com resolução anisotrópica. Na tomografia TEM, diferentes tomogramas de cortes espessos seriados podem ser combinados30,31. O mesmo é possível na tomografia STEM; No entanto, dada a espessura dos cortes que podem ser investigados, há menos necessidade de combinar vários tomogramas. Em virologia, a tomografia TEM é frequentemente usada para caracterizar a remodelação da membrana induzida por vírus 32,33,34,35. Embora a própria tomografia TEM forneça informações valiosas sobre o ciclo de replicação de vírus, a maioria dos casos de uso se beneficiaria da capacidade da tomografia STEM de obter imagens de volumes mais espessos. Isso vale especialmente para vírions com morfologia anisotrópica, como rhabdoviridae, onde a tomografia TEM pode capturar apenas alguns vírions completos em um tomograma35 ou para imagens de vários vírions envolventes em um compartimento de replicação com um tamanho do complexo de montagem viral citoplasmática (cVAC) do citomegalovírus humano (HCMV) 4.

A tomografia STEM sob condições criogênicas oferece mais informações funcionais19 e um protocolo de vídeo está disponível20. Nosso protocolo difere no fluxo de trabalho de preparação de amostras, que, em vez de preservar a amostra no estado nativo, fornece preservação ultraestrutural quase nativa. Embora a tomografia STEM de amostras congeladas de alta pressão e substituídas por congelamento não possa alcançar a preservação ultraestrutural e a resolução atômica observadas no EM criogênico, ela se beneficia das vantagens de equipamentos mais simples, amostras mais estáveis e um rendimento mais alto.

As etapas a seguir são críticas para o sucesso do método:

Primeiro, um objetivo claro do experimento de imagem. Devido à natureza trabalhosa da técnica, é necessário um experimento bem planejado com um objetivo claro para a imagem. O conhecimento detalhado do sistema modelo - linhagem celular e vírus - deve ser gerado de antemão usando outros métodos menos difíceis de executar. Portanto, encorajamos a otimização das taxas de infectividade em pré-experimentos baseados em microscopia óptica e o ajuste das condições experimentais para se adequar ao sistema biológico. Os parâmetros de otimização incluem o número de células, multiplicidade de infecção (MOI) e pontos de tempo com base no vírus e no evento a ser fotografado. Isso garantirá uma alta proporção de células avaliáveis na amostra.

Em segundo lugar, preparação de amostras de alta qualidade. Ressaltamos a importância do preparo de amostras de qualidade. Atualmente, consideramos a vitrificação por congelamento de alta pressão como o padrão-ouro para espécimes espessos como células. A substituição por congelamento, incorporação e subsequente aquisição de imagens à temperatura ambiente é uma maneira robusta de obter resultados de alta qualidade quando combinada com a tomografia STEM. Portanto, estabelecer uma rotina estável para o preparo da amostra é crucial. Para isso, gostaríamos de destacar a literatura sobre congelamento a alta pressão14,21. Se for utilizada uma solução de substituição por congelamento menos tóxica, recomendamos o uso de permanganato de potássio como substituto do tetróxido de ósmio, conforme descrito por Schauflinger et al.36.

Finalmente, um fluxo de trabalho de execução suave para aquisição de séries de inclinação, incluindo um microscópio bem alinhado, deve ser estabelecido de acordo com as instruções do usuário do STEM e será diferente de microscópio para microscópio. Estabelecer um fluxo de trabalho tranquilo também depende do gerador de digitalização e do software de aquisição de imagem.

Divulgações

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JGW, RH, EP, JSR e MD são funcionários da Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, uma empresa farmacêutica com interesse no desenvolvimento e produção de produtos baseados em vírus. Isso não teve influência no design do papel; portanto, não relatamos conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Esta publicação faz parte da Estratégia Global de Tecnologia de Desenvolvimento e foi apoiada pela Gestão Global de Tecnologia da Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. Agradecemos a Renate Kunz e Jana Apolloni pela excelente assistência técnica e discussão útil sobre a preparação da amostra. Agradecemos a Reinhard Weih pela excelente assistência com questões técnicas e manutenção do dispositivo. Agradecemos a Torsten Friedrich pela discussão útil e por ajudar na configuração do microscópio. O trabalho de Clarissa Read, Julia LaRoche e Jan Münch recebeu financiamento de uma bolsa do Centro de Pesquisa Cooperativa da Fundação Alemã de Pesquisa (SFB1279).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-HexadecenoMerck KGaA8220640500
200 grade de cobre com barras paralelasPlano GmbHG2014C
37 & deg; Câmara de secagem CBinder GmbH9010-0323
AcetonaVWR international GmbH20066330
DDSACiências da Microscopia Eletrônica13710
Faca de diamanteDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Ciências da Microscopia Eletrônica13600
Embed-812 ResinaCiências da Microscopia Eletrônica14900
Ferramentas de EMTVIPS GmbHSoftware TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Etanol 100%Merck KGaA1.00983.2511
Papel de filtroVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarCiências da Microscopia Eletrônica15830-25
Unidade de substituição por congelamento Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 milhas náuticasReagentes e Reagentes de Ouro da AURION Immuno Acessórios425.011
Broca de pinheiro dourado e oslash dourado; 2000 & mu; mScience Services GmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
Placa de aquecimentoMEDAX GmbH & Co. KG12501
Sistema de vaporização de alto vácuo BAF 300BAL-TEC AG
Freezer de alta pressão Wohlwend HPF Compact 01Escritório de Engenharia M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Tanque de nitrogênio líquidoH.Erben GmbH94500
Nitrogênio (fluido)VWR international GmbH-
NMACiências da Microscopia Eletrônica19000
Tetróxido de ósmioChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Forno a 120 ° CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poly-L-Lysina 0,1% em relação a algo. SoluçãoTed Pella, Inc.18026
Tubos Safe-Lock 0,5 mLEppendorf SE0030 121.023
Recipientes de amostra (cápsulas Beem)Plano GmbHG360-1
Diâmetro do disco de safira 3 x 0,16 mmEscritório de Engenharia M. Wohlwend GmbH500
Ultramicrotome Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Acetato de uranilaRiedel de Haë n AG31697
Câmara de luz UVDiniesELG100S

Referências

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