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Artigo de método

Epitélio pigmentar primário da retina de camundongo transfectado com RNA de alu: um modelo in vitro patologicamente relevante para degeneração macular relacionada à idade

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DOI:

10.3791/68570

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17 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, descrevemos o processo completo de estabelecimento de um modelo relevante para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) em células epiteliais pigmentares da retina primária (RPE) de camundongos usando transfecção de RNA Alu.

Resumo

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), particularmente a DMRI não exsudativa, requer modelos experimentais que repliquem melhor a patologia humana. Os modelos in vivo atuais permanecem tecnicamente exigentes e demorados, enquanto os sistemas in vitro convencionais não conseguem recapitular os gatilhos patológicos específicos da doença. Aqui, apresentamos um método para estabelecer um modelo de degeneração epitelial pigmentar da retina (RPE) usando células primárias de RPE de camundongo transfectadas com Alu RNA, um retrotransposon diretamente implicado na patologia da atrofia geográfica.

Este protocolo detalha o isolamento enzimático de células primárias de RPE de camundongo, seguido de transfecção de RNA Alu para induzir a degeneração de RPE. A validação integra análise morfológica (arquitetura hexagonal), funcional (perda de polaridade e interrupção da proteína ZO-1 do camundongo) e molecular (PCR quantitativa). Como resultado, observamos alterações multifatoriais desencadeadas pela transfecção de RNA Alu: secreção de citocinas inflamatórias (genes de camundongo Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) e senescência celular (genes de camundongo p21 e p53 regulação positiva; p < 0,05). Em comparação com os modelos tradicionais de estresse agudo, esse sistema recapitula as cascatas inflamatórias-degenerativas crônicas da DMRI por meio de técnicas padronizadas, garantindo a reprodutibilidade. Ao combinar aspectos de ensaios in vitro simplificados e modelos in vivo complexos, essa abordagem pode servir como uma plataforma preliminar para explorar mecanismos acionados por retrotransposons e rastrear potenciais candidatos terapêuticos.

Introdução

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma causa predominante de deficiência visual global. No entanto, os tratamentos eficazes para DMRI não exsudativa permanecem limitados. Assim, há uma necessidade urgente de modelos de pesquisa reprodutíveis e eficientes para descobrir mecanismos de doença e identificar alvos terapêuticos 1,2. Central para esse esforço é o epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada situada entre a membrana de Bruch (coroide) e os fotorreceptores (retina), que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase da retina, apoiando a função dos fotorreceptores, regulando a barreira hemato-retiniana e facilitando a depuração de resíduos 3,4.

A disfunção ou perda de células do EPR é uma característica saliente de muitas doenças degenerativas da retina, especialmente na DMRI, onde a disfunção do EPR representa uma etapa inicial e crítica em sua progressão 2,4,5. Notavelmente, em pacientes que manifestam atrofia geográfica (GA), a fase avançada da DMRI, níveis reduzidos da enzima de processamento de microRNA Dicer 1 ribonuclease III (DICER1) resultam em acúmulo tóxico de Alu RNA, um transcrito de retrotransposon diretamente ligado à degeneração do EPR e implicado na patologia humana6.

Os modelos in vivo tradicionais, como o modelo de iodato de sódio (NaIO3) e o modelo de β amilóide (Aβ), mantêm a complexidade sistêmica da doença, mas enfrentam limitações críticas. O modelo NaIO3 induz rapidamente o estresse oxidativo da retina e danos ao EPR, no entanto, sua toxicidade aguda interrompe tanto o EPR quanto os fotorreceptores, falhando em imitar a progressão crônica da DMRI relacionada à patologia e obscurecendo a avaliação terapêutica da disfunção sutil do EPR7. Da mesma forma, o modelo Aβ introduz estressores específicos da doença, mas exige amplo conhecimento técnico e cronogramas prolongados em comparação com abordagens in vitro 8,9. Os modelos convencionais de EPR in vitro, como H2O2 e modelos de exposição à hidroquinona, por outro lado, carecem de relevância patológica, falhando em recapitular estressores específicos da doença, como agregados de proteínas tóxicas ou gatilhos inflamatórios1.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para estabelecer um modelo de degeneração de EPR em células primárias de RPE de camundongo usando Alu RNA, um RNA não codificante derivado de retrotransposon diretamente implicado na patogênese de GA6. O RNA de alu ativa vias inflamatórias e compromete a integridade da barreira do EPR10,11, mimetizando assim as características patológicas associadas à DMRI não exsudativa. Este método emprega o isolamento enzimático e cultura de células RPE, seguido pela indução da degeneração RPE usando Alu RNA. Além disso, fornecemos um sistema de validação abrangente, combinando leituras morfológicas (arquitetura hexagonal), funcionais (integridade da barreira e perda de polaridade) e moleculares (marcadores inflamatórios e de senescência) para avaliar esse modelo de degeneração.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Geral de Xangai, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai. Este protocolo segue rigorosamente o Regulamento para a Administração de Assuntos Relativos a Animais Experimentais (emitido pela Comissão Estadual de Ciência e Tecnologia) e as diretrizes para o uso ético de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes relacionados aos materiais usados neste protocolo.

1. Isolamento de células primárias de RPE de camundongo

  1. Preparação de placas revestidas
    1. Diluir o Matrigel na proporção de 150 μL de Matrigel para 13 mL de DMEM/F12 (concentração final de aproximadamente 1,14%).
    2. Cubra uniformemente o fundo da placa com o Matrigel diluído (aproximadamente 150 μL para uma placa de 48 poços). Incubar durante a noite a 37 °C para formar um gel.
  2. Preparação da solução
    1. Prepare o meio de cultura RPE completo usando o meio de águia modificado / mistura de nutrientes F-12 (DMEM / F12) da Dulbecco complementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Prepare a mistura de papaína adicionando 4,5 mL de solução salina balanceada de Earle (EBSS) a um frasco de papaína (100 unidades / frasco).
    3. Prepare o DNase I Mix adicionando 500 μL de EBSS a um frasco para injetáveis de DNase I (1.000 unidades/frasco).
    4. Prepare a solução de digestão de papaína adicionando 250 μL de DNase I Mix a 4,5 mL de Papain Mix (ajuste o protocolo fornecido pelo fornecedor para atingir uma concentração final de papaína de 22 UI/mL), perfazendo o volume final de 4,75 mL.
  3. Eutanásia e coleta de tecidos
    1. Eutanasiar camundongos com 2-3 semanas de idade por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 5% a 150-200 mg/kg de peso corporal. Confirme a anestesia profunda e a morte, verificando a cessação dos batimentos cardíacos e da respiração.
    2. Pulverizar completamente a região ocular com etanol a 70% antes da enucleação para eliminar contaminantes superficiais 12,13,14. Pressione suavemente a borda periorbital para projetar o globo. Em seguida, use uma pinça para extrair o globo ocular, preservando o nervo óptico para facilitar a dissecção.
      NOTA: Todas as ferramentas (por exemplo, pinças, tesouras) são autoclavadas e os procedimentos são realizados sob uma capela de fluxo laminar para manter a esterilidade.
    3. Mergulhar imediatamente os globos oculares em meio de cultura RPE completo estéril pré-aquecido a 37 °C.
  4. Digestão enzimática
    NOTA: Todas as etapas, incluindo digestão enzimática e procedimentos subsequentes, devem ser realizadas sob uma capela de fluxo laminar para manter a esterilidade.
    1. Transfira o globo ocular para um prato e use uma pinça para eliminar o tecido conjuntivo aderente e os músculos extraoculares residuais sob um estereomicroscópio.
    2. Enxágue suavemente os olhos 2x com solução salina tamponada com fosfato pré-resfriado de Dulbecco (D-PBS; sem Ca2+/Mg2+; a 4 °C).
      NOTA: O meio de cultura RPE completo residual pode comprometer a atividade enzimática da papaína.
    3. Mergulhe totalmente os olhos em 1 mL de solução de digestão de papaína e incube a 37 °C por 45 min.
  5. Separação de células RPE
    1. Após a digestão, neutralizar a atividade enzimática com meio de cultura RPE completo.
    2. Transfira o globo ocular para um prato e, sob um estereomicroscópio, excise a córnea, a íris e a lente e preserve a ocular posterior.
      NOTA: As células RPE foram isoladas e mantidas como folhas intactas (em vez de se dissociarem em células únicas) durante todo o processo.
    3. Separe o complexo retina-EPR da coróide e, em seguida, retire a camada de EPR da retina como folhas contínuas em meio de cultura RPE completo. Colete as camadas de EPR destacadas uniformemente em meio de cultura de EPR completo fresco como uma mistura e, em seguida, cultive-as em superfícies revestidas com Matrigel.
  6. Cultura de células
    1. Semeie a mistura em uma placa de 24 poços revestida com Matrigel (8-10 globos oculares por poço em lamínula, para imunocoloração), uma placa de 48 poços revestida com Matrigel (6-8 globos oculares por poço, para qPCR) ou uma placa de 96 poços revestida com Matrigel (5-6 globos oculares por poço).
    2. Incubar a 37 °C com 5% de CO2. Execute a primeira troca de meio após 48 h usando o meio de cultura RPE completo. Troque o meio a cada 48 h após a primeira troca.
      NOTA: Para manter a polaridade das células RPE o máximo possível, evite passá-las sempre que possível, pois a subcultura repetida pode levar à perda de diferenciação e integridade funcional.
  7. Monitoramento da morfologia celular
    1. Permitir que as células formem uma monocamada com morfologia hexagonal característica. Monitore a morfologia sob um microscópio de cultura de células invertido.

2. Indução do modelo de degeneração do EPR

  1. Síntese e verificação de RNA de alu
    1. Sintetizar RNA de Alu usando um sistema de transcrição in vitro .
      NOTA: A síntese do RNA Alu utilizada em nosso estudo foi baseada no protocolo descrito pelo Ambati Lab6.
    2. Purifique o RNA e confirme sua qualidade usando um microespectrofotômetro.
  2. Transfecção de RNA de alu
    NOTA: Designamos o dia da semeadura primária da célula RPE como dia 0. No dia 5, as células primárias aderentes do EPR exibiram uma morfologia uniforme e atingiram mais de 50% de confluência celular, momento em que a transfecção de RNA Alu foi realizada usando um reagente de transfecção à base de lipídios catiônicos, de acordo com as diretrizes do fabricante.
    Dois grupos controle foram incluídos para validar os resultados: i) um controle negativo (NC), no qual nem o RNA Alu nem o reagente de transfecção foram adicionados e o meio de baixo soro foi usado como substituto; ii) controle de lipossomas (LC), no qual o RNA de Alu foi omitido, mas a mesma quantidade de reagente de transfecção foi misturada com meio de baixo soro e aplicada às células, para controlar os efeitos associados à lipofecção. As etapas a seguir descrevem o procedimento de transfecção de RNA Alu.
    1. Substitua o meio existente por 300 μL de meio de cultura RPE completo por poço (placa de 48 poços) antes dos procedimentos de transfecção.
    2. Prepare complexos de transfecção com RNA de Alu e reagente à base de lipídios catiônicos em meio com baixo teor de soro.
      1. Prepare a mistura 1 com 1,2 μL de reagente à base de lipídios catiônicos e 18,8 μL do meio de baixo soro. Misture delicadamente (não vórtice) e incube em temperatura ambiente por 5 min.
      2. Prepare o Mix 2 com 6 μL de Alu RNA (100 μg / mL) e 14 μL de meio com baixo teor de soro.
      3. Prepare complexos de transfecção adicionando 20 μL de Mix 2 gota a gota em 20 μL de Mix 1.
        NOTA: O RNA de Alu foi transfectado a uma concentração final de 0,6 μg por poço usando 1,2 μL de reagente à base de lipídios catiônicos por poço (1,2 μL de reagente: proporção de 0,6 μg de RNA).
      4. Mexa suavemente para misturar. Em seguida, deixe em temperatura ambiente por 20 min.
    3. Adicione 40 μL / poço dos complexos de transfecção a cada poço de uma placa de 24 poços. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C/5% CO2 durante 48 h.
    4. Realize qPCR, imunocoloração e outros procedimentos experimentais 48 h após a transfecção.

3. Validação do modelo de degeneração

NOTA: Experimentos abrangentes de validação de modelo foram realizados no dia 7.

  1. Coloração de imunofluorescência para avaliação da polaridade e integridade da barreira
    1. Fixe as células RPE cultivadas com formaldeído livre de metanol a 4% por 20 min em temperatura ambiente. Lave 3 x 10 min com 1x PBS.
    2. Bloqueie a ligação inespecífica com albumina de soro bovino (BSA) a 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 h.
    3. Incubar com anticorpos primários anti-ZO1 (diluição 1:1.000 em 3% BSA) e Faloidina 488 (diluição 1:1.000 em 3% BSA) durante a noite a 4 °C, evitando a luz.
    4. Lave as células 3 x 10 min suavemente com PBS.
    5. Incubar com anticorpos secundários (diluição 1:1.000 em 3% BSA) por 1 h em temperatura ambiente.
    6. Lave as amostras 3 x 10 min com 1x PBS.
    7. Contracoloração com DAPI (diluição 1:1.000 em PBS) por 10 min.
    8. Lave as amostras por 3 x 10 min com 1x PBS.
    9. Remova cuidadosamente a lamínula da placa de 24 poços e coloque-a em uma lâmina de vidro pré-carregada com uma gota de meio de montagem. Capture imagens confocais usando uma objetiva de 40x/0,95.
  2. PCR quantitativo (qPCR) para senescência e marcadores inflamatórios
    NOTA: A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gene de camundongo Gapdh) foi empregada como o gene de referência interno para a normalização dos valores do ciclo limiar (Ct). Todas as reações de PCR quantitativa (qPCR) incluíram três réplicas biológicas por grupo experimental. As sequências de primers são fornecidas na Tabela Suplementar S1.
    1. Extração de RNA
      1. Adicione tampão de lise (Kit de RNA Total) à placa de cultura (1 mL por 10 cm² de área de superfície) e incube em temperatura ambiente por 5 min.
      2. Centrifugar a 13.400 × g durante 5 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo livre de RNase.
        NOTA: Pule esta etapa se as amostras estiverem livres de detritos (por exemplo, lisado de células claras).
      3. Adicione 200 μL de clorofórmio ao sobrenadante, vórtice por 15 s e incube em temperatura ambiente por 3 min.
      4. Centrifugar a 13.400 × g durante 10 min a 4 °C. Transfira a fase aquosa superior (~ 500 μL) para um novo tubo.
      5. Adicione 0,5 volumes de etanol à fase aquosa. Misture delicadamente pipetando.
      6. Carregue a mistura em uma coluna de membrana de sílica (incluída no Kit de RNA Total). Centrifugar a 13.400 × g durante 30 s. Descarte o fluxo.
      7. Adicione 500 μL de tampão de remoção de proteína (Kit de RNA Total) à coluna. Centrifugar a 13.400 × g durante 30 s. Descarte o fluxo.
      8. Adicione 500 μL de tampão de lavagem (Kit de RNA Total) à coluna. Centrifugar a 13.400 × g durante 30 s. Descarte o fluxo.
      9. Repita a etapa anterior 3.2.
      10. Centrifugue a coluna vazia a 13.400 × g por 2 min para secar a membrana.
      11. Eluir o RNA adicionando 30-100 μL de água livre de RNase à membrana. Incube em temperatura ambiente por 2 min. Centrifugue a 13.400 × g por 2 min.
    2. Síntese de DNA complementar (cDNA)
      1. Medir a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro a 260 nm e 280 nm.
        NOTA: Uma proporção A260 / A280 entre 1,8 e 2,0 é considerada associada à pureza aceitável do RNA.
      2. Prepare a mistura de reação em um tubo livre de RNase: molde de RNA (500-1.000 ng): X μL (relacionado à sua concentração), 5x tampão de transcrição reversa: 4 μL, água livre de RNase: a 20 μL.
      3. Incubar a mistura de reação em um termociclador usando o seguinte programa: 37 °C por 15 min, 85 °C por 5 s e uma retenção indefinida a 4 °C.
    3. qPCR
      1. Prepare a mistura principal de qPCR para cada reação (10 μL no total): TB Green (incluído no Premix Taq): 5 μL, corante ROX (incluído no Premix Taq): 0,2 μL, primer direto (1 μM): 0,2 μL, primer reverso (1 μM): 0,2 μL, água livre de RNase: 3,4 μL, modelo de cDNA: 1 μL.
      2. Adicione 10 μL da mistura principal em cada poço de uma placa de 96 poços.
      3. Sele a placa com uma tampa óptica adesiva. Centrifugue a 300 × g por 1 min.
      4. Execute o seguinte programa em um sistema de PCR em tempo real: Estágio 1: 95 °C por 30 s; Estágio 2: 40 ciclos de: 95 °C por 5 s, 60 °C por 30 s; Etapa 3: Análise da curva de fusão.
      5. Calcule os níveis de expressão relativa dos mRNAs alvo usando o método 2−ΔΔCt 15.

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Resultados

Células primárias de RPE de camundongo antes da transfecção de RNA Alu
No Dia 0 (Figura 1), as células primárias de EPR de camundongo foram isoladas e exibiram a morfologia hexagonal característica, típica de células EPR saudáveis. Essas células mantinham uma monocamada bem organizada. As células foram cultivadas para permitir a organização estrutural inicial e a formação de junções apertadas, como evidenciado pela forma hexagonal e limites bem definidos. Essa morfologia ...

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Discussão

Nosso objetivo era estabelecer um modelo de lesão de EPR reprodutível e acessível que permitisse imagens de alta resolução e análise mecanicista com restrições mínimas de recursos. Essa abordagem forneceu uma visualização clara da ruptura estrutural induzida pelo RNA Alu em comparação com o grupo controle, incluindo fragmentação da junção apertada apical e desorganização do citoesqueleto basal por meio de imagens confocais da pilha Z (tamanho do passo de 0,5 μm). Duas etapas críticas gar...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Projeto Especial de Pesquisa em Inovação Médica do Plano de Ação de Inovação em Ciência e Tecnologia (23Y11901300), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82171076) e Comissão Municipal de Educação de Xangai (2023ZKZD18). Agradecemos ao Professor LZ pelo gentil presente de Alu RNA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gabinete de Segurança Biológica Classe II, Tipo A2 Série 1300Thermo Científico
37 &graus; C/5% CO2 incubadoraThermo Científico
Paraformaldeído a 4% (PFA)Biografia do serviçoG1101-500ML
RNA Alu humanoPresenteado por L.Z.
Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 568 (cabra)Invitrogen Thermo ScientificRolamento A11011
Tampa óptica adesiva MicroAmp da Applied BiosystemsThermo Fisher Científico
Placas de reação ópticas de 96 poços MicroAmp da Applied BiosystemsThermo Fisher Científico
Sistema de PCR em Tempo Real ViiA 7 da Applied BiosystemsThermo Fisher CientíficoSistema de PCR em tempo real para análise quantitativa da expressão gênica
Albumina de soro bovino (BSA, fração V)BeyotineST023-50g
Microscópio de cultura de células invertidas Carl Zeiss PrimovertZeissPara monitoramento da morfologia celular
Centrífuga 5424 REppendorf
ClorofórmioSigmaSeparação de fases na extração de RNA.
Microscópio confocal da exploração do laser (LSM900+Cell descobre 7)ZeissImagem de alta resolução de marcadores de imunofluorescência (por exemplo, ZO-1 e F-actina).
Placa de poço Costar 24/48/96Corning
LamelaThermo Fisher CientíficoUsado em placa de 24 poços para imagens de imunofluorescência.
DAPIThermo62248
Banho seco digitalMulab
DMEM/F12gibcoMeios para cultivar células RPE 
Tamponado com fosfato de Dulbecco (D-PBS)Compartilhar BioSB-CR017
Conde' s Solução salina balanceada (EBSS)gibcoSolução salina balanceada usada para diluição de papaína e DNase I durante o isolamento de EPR.
Etanol (Absoluto)SigmaPrecipitação de RNA e lavagem de coluna.
Soro fetal bovino (FBS)SigmaPara meios de cultura de células RPE completos
fórcepsPara dissecção
Lipofectamina 3000 (Reagente de Transfecção à Base de Lipídios Catiônicos)Thermo FisherL300015Para transfectar o RNA Alu em células RPE
matrigelCorning356234Matriz (diluição de 1,14%) para placas de revestimento para suportar a adesão e polarização do EPR.
Formaldeído sem metanolThermo CientíficoFixador alternativo (4%) para preservação de epítopos em imunofluorescência
MicropipetaEppendorf
Espectrofotômetro Nanodrop 2000Thermo CientíficoMede a concentração e a pureza do RNA
Nikon ECLIPSE Ti-S microscópio invertido fluorescenteNikonImagem de fluorescência de amostras coradas
Estereomicroscópio Olympus SZX16OlimpoPara dissecção de globos oculares de camundongos e isolamento de EPR
Opti-MEMgibcomeio com baixo teor de soro para preparação de complexo de transfecção
Sistema de dissociação de papaínaWorthingtonLK003150Para enzima de trabalho
Penicilina-estreptomicina gibcoPara meios de cultura de células RPE completos
Sal de pentobarbital sódicoSigmaAgente de eutanásia
Faloidina 488 Abcam176753Para avaliação de polaridade
Kit de reagentes PrimeScript RTTakaraRR037AKit de transcrição reversa para síntese de cDNA (preparação do modelo de qPCR)
Kit de RNA Total SimplesTIANGENDP419Para extração de RNA
TB Verde  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420APara qPCR
Anticorpo policlonal de coelho ZO-1Tecnologia de proteína21773Para avaliação morfológica

Referências

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