Epitélio pigmentar primário da retina de camundongo transfectado com RNA de alu: um modelo in vitro patologicamente relevante para degeneração macular relacionada à idade

Xinyue Hu; Yuhao Tang; Haoliang Zhang; Zilin Wang; Junran Sun

doi:10.3791/68570

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Epitélio pigmentar primário da retina de camundongo transfectado com RNA de alu: um modelo in vitro patologicamente relevante para degeneração macular relacionada à idade

577 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

17 de outubro de 2025

Xinyue Hu^*¹ , Yuhao Tang^*²^,³^,⁴ , Haoliang Zhang^*²^,³^,⁴ , Zilin Wang²^,³^,⁴ , Junran Sun²^,³^,⁴

¹Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ³National Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, descrevemos o processo completo de estabelecimento de um modelo relevante para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) em células epiteliais pigmentares da retina primária (RPE) de camundongos usando transfecção de RNA Alu.

Resumo

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), particularmente a DMRI não exsudativa, requer modelos experimentais que repliquem melhor a patologia humana. Os modelos in vivo atuais permanecem tecnicamente exigentes e demorados, enquanto os sistemas in vitro convencionais não conseguem recapitular os gatilhos patológicos específicos da doença. Aqui, apresentamos um método para estabelecer um modelo de degeneração epitelial pigmentar da retina (RPE) usando células primárias de RPE de camundongo transfectadas com Alu RNA, um retrotransposon diretamente implicado na patologia da atrofia geográfica.

Este protocolo detalha o isolamento enzimático de células primárias de RPE de camundongo, seguido de transfecção de RNA Alu para induzir a degeneração de RPE. A validação integra análise morfológica (arquitetura hexagonal), funcional (perda de polaridade e interrupção da proteína ZO-1 do camundongo) e molecular (PCR quantitativa). Como resultado, observamos alterações multifatoriais desencadeadas pela transfecção de RNA Alu: secreção de citocinas inflamatórias (genes de camundongo Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) e senescência celular (genes de camundongo p21 e p53 regulação positiva; p < 0,05). Em comparação com os modelos tradicionais de estresse agudo, esse sistema recapitula as cascatas inflamatórias-degenerativas crônicas da DMRI por meio de técnicas padronizadas, garantindo a reprodutibilidade. Ao combinar aspectos de ensaios in vitro simplificados e modelos in vivo complexos, essa abordagem pode servir como uma plataforma preliminar para explorar mecanismos acionados por retrotransposons e rastrear potenciais candidatos terapêuticos.

Introdução

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma causa predominante de deficiência visual global. No entanto, os tratamentos eficazes para DMRI não exsudativa permanecem limitados. Assim, há uma necessidade urgente de modelos de pesquisa reprodutíveis e eficientes para descobrir mecanismos de doença e identificar alvos terapêuticos ^1,2. Central para esse esforço é o epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada situada entre a membrana de Bruch (coroide) e os fotorreceptores (retina), que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase da retina, apoiand....