É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Microdissecção Multinível e Perfil Funcional-Estrutural de Ramos Arteriais Renais Humanos

1.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

5 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para o isolamento e avaliação funcional de ramos arteriais renais humanos, facilitando estudos pré-clínicos para o desenvolvimento farmacêutico.

Resumo

A disfunção vascular renal desempenha um papel crítico na patogênese de múltiplas condições clínicas, incluindo lesão renal aguda, isquemia renal e hipertensão, apresentando desafios significativos no manejo clínico e afetando adversamente os resultados dos pacientes. O isolamento e a caracterização funcional das artérias intrarrenais são cruciais para elucidar os mecanismos subjacentes à disfunção vascular renal, particularmente relacionados à lesão renal, e orientar o desenvolvimento terapêutico direcionado. Apesar de sua importância clínica, as abordagens padronizadas para isolar e avaliar funcionalmente as artérias intrarrenais humanas em diferentes níveis de ramificação permanecem subdesenvolvidas. Este protocolo fornece uma estrutura abrangente para o isolamento sistemático e avaliação multimodal de ramos arteriais intrarrenais, incorporando avaliações funcionais e estruturais em condições fisiológicas e patológicas. A metodologia engloba três componentes principais: (1) identificação anatômica precisa e microdissecção das artérias intrarrenais dos rins do doador, acompanhada de coloração de hematoxilina-eosina (H&E) para confirmação estrutural; (2) procedimentos rigorosos de normalização em miografia de fio para melhorar a reprodutibilidade e confiabilidade da medição; e (3) análise quantitativa das respostas vasomotoras usando técnicas de miografia de fio de precisão. A normalização é baseada na relação comprimento-tensão muscular, onde o alongamento incremental dos segmentos arteriais estabelece uma tensão de repouso ideal para maximizar a sobreposição actina-miosina, provocando assim respostas contráteis de pico. Na miografia com fio, segmentos de vasos isolados são suspensos entre dois fios paralelos, permitindo a medição precisa da tensão vascular. Ao aplicar protocolos de normalização rigorosos, essa técnica permite a quantificação reprodutível e confiável da reatividade vascular em diversas condições fisiopatológicas e intervenções farmacológicas.

Introdução

O rim é um órgão vital responsável por manter a homeostase humana por meio da eliminação de resíduos metabólicos, equilíbrio eletrolítico e regulação de fluidos - funções que exigem fluxo sanguíneo excepcionalmente alto. Em condições fisiológicas, os rins recebem aproximadamente 25% do volume sanguíneo total bombeado pelo coração a cada minuto (débito cardíaco), ressaltando seu papel substancial no fluxo sanguíneo sistêmico e a importância crítica da perfusão renal na manutenção do equilíbrio fisiológico geral1. O sistema arterial renal regula com precisão esse fornecimento maciço de sangue para manter a TFG enquanto se adapta às alterações hemodinâmicas sistêmicas. Consequentemente, o comprometimento da perfusão renal representa um mecanismo patológico crítico que contribui para a redução da taxa de filtração glomerular (TFG) em condições como lesão renal aguda e isquemia renal. Além disso, ocorre frequentemente secundariamente a distúrbios sistêmicos que comprometem o fluxo sanguíneo renal, incluindo choque, disfunção cardíaca e sepse 2,3,4,5. A artéria renal sofre ramificação sequencial dentro do rim, primeiro dividindo-se em artérias interlobares que percorrem as colunas renais entre as pirâmides medulares. Ao atingir a junção corticomedular, esses vasos dão origem a artérias arqueadas, que se arqueiam ao longo da fronteira entre o córtex e a medula. Desses vasos curvilíneos emergem artérias interlobulares que penetram radialmente no parênquima cortical, levando sangue aos capilares glomerulares por meio de arteríolas aferentes para perfundir néfrons individuais 1,6,7. As artérias interlobar, arqueada e interlobular constituem a principal vasculatura de resistência no rim, servindo como reguladores primários da hemodinâmica intrarrenal e do controle da pressão 1,8. O isolamento e a caracterização precisos desses vasos são cruciais para elucidar os mecanismos fundamentais que regem a homeostase da perfusão renal9. Além disso, sua reatividade vascular heterogênea sob várias condições fisiopatológicas oferece uma estrutura estratégica para o desenvolvimento de novos agentes vasodilatadores com potencial protetor renal10,11.

Atualmente, técnicas de imagem clínica (por exemplo, ultrassom) são usadas rotineiramente para monitorar as alterações do fluxo sanguíneo renal; No entanto, metodologias experimentais em pesquisa básica para avaliar diretamente a tensão vascular renal, um determinante chave da perfusão renal, permanecem limitadas 12,13,14,15. O sistema de miografia com fio é uma plataforma experimental bem estabelecida que mede mudanças de tensão em pequenos tecidos biológicos in vitro, incluindo vasos sanguíneos, traqueia 16,17,18, com diâmetros variando de 50 μm a 10 mm 16,19,20. Embora a miografia de fio tenha sido amplamente aplicada em estudos com animais, as diferenças entre espécies na estrutura e função vascular limitam a extensão em que os vasos de roedores podem representar a fisiologia vascular humana21. Portanto, a identificação e o isolamento precisos das artérias intrarrenais humanas em vários níveis anatômicos (interlobar, arqueado e interlobular) são cruciais para permitir investigações in vitro abrangentes sobre suas propriedades fisiológicas, bem como alterações funcionais relacionadas à doença e mecanismos de lesão patológica. Quando combinado com intervenções farmacológicas usando vários compostos vasoativos, esse sistema permite a avaliação dinâmica e o registro quantitativo das respostas de vasoconstrição/vasodilatação em anéis arteriais isolados, fornecendo uma ferramenta poderosa para investigar a reatividade vascular em condições experimentais controladas 19,22,23.

Este protocolo detalha uma metodologia abrangente para a localização anatômica precisa e microdissecção de ramos da artéria intarenal humana (artérias interlobar, arqueada e interlobular), seguida de caracterização funcional usando um sistema de monitoramento de tensão vascular in vitro para avaliar sua reatividade diferencial a drogas vasoativas, estabelecendo assim distinções estruturais e funcionais entre esses segmentos vasculares. Ao combinar a localização anatômica com o perfil de reatividade farmacológica e a análise histopatológica, estabelecemos uma plataforma ex vivo que permite uma avaliação abrangente das respostas vasculares específicas da região aos agentes vasoativos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O protocolo e os exemplos descritos aqui foram revisados e aprovados pelo Departamento de Urologia do Primeiro Hospital da Universidade de Pequim (aprovação nº 2023yan500-002) e conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes da participação.

1. Preparação da solução

  1. Prepare a solução de Krebs-Ringer (Krebs) contendo 119,0 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,2 mM de KH2PO4 e 11,0 mM de D-glicose em pH 7,4.
  2. Prepare uma solução salina com alto teor de potássio (60K+) contendo 64,0 mM de NaCl, 60 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,2 mM de KH2PO4 e 11,0 mM de D-glicose em pH 7,4.

2. Preparação do reagente

NOTA: Armazene os medicamentos de acordo com os detalhes fornecidos na Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS) imediatamente após recebê-los.

  1. Prepare a fenilefrina (Phe, 10-1 M em estoque) dissolvendo 167,21 mg de fenilefrina em 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a solução-mãe a -80 °C, diluir a 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M como concentração de trabalho no dia da utilização.
  2. Prepare a acetilcolina (ACh, 10-2 M em estoque), dissolvendo 18,166 mg de acetilcolina em 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a solução de stock a -80 °C, diluir a 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M como concentração de trabalho no dia da utilização.

3. Coleta de tecido renal e isolamento da artéria intrarrenal

  1. Recrute pacientes adultos diagnosticados com carcinoma de células renais, conforme confirmado histologicamente por biópsia pré-operatória por agulha grossa ou congelação intraoperatória.
    NOTA: Os pacientes agendados para nefrectomia radical são escolhidos especificamente porque suas peças cirúrgicas fornecem acesso a segmentos arteriais intrarrenais intactos localizados distalmente às margens do tumor. Esses segmentos podem ser dissecados e isolados com precisão, permitindo o estudo detalhado da fisiologia vascular renal humana sem interferência de tecido maligno. A confirmação histológica garante a identificação precisa do carcinoma e o delineamento claro dos limites do tumor, facilitando a seleção de segmentos arteriais normais e livres de tumor para investigações experimentais.
    1. Excluir pacientes com comorbidades significativas (hipertensão, diabetes mellitus ou outras doenças sistêmicas) para evitar influências confusas na função vascular, aumentando assim a confiabilidade e a relevância das avaliações fisiológicas.
      NOTA: As amostras para este experimento foram coletadas de pacientes agendados para nefrectomia radical no Primeiro Hospital da Universidade de Pequim.
  2. Durante a nefrectomia radical, colete amostras de rim humano recém-excisadas e mergulhe-as imediatamente em solução de Krebs gelada para preservar a viabilidade do tecido. Apenas regiões de aparência macroscopicamente normal distais às margens do tumor são mantidas para dissecção arterial (Figura 1A).
    NOTA: Para um isolamento ideal da artéria intrarrenal, o tecido saudável adjacente deve ser colhido como uma cunha corticomedular de espessura total durante a nefrectomia radical, preservando assim a árvore arterial completa da vasculatura cortical à medular.
    1. Armazene imediatamente o tecido excisado em 200 mL de solução fria de Krebs. Coloque o recipiente no gelo e transporte-o em um saco térmico isolado para o laboratório dentro de 2 h após a coleta. Certifique-se de que o tecido permaneça totalmente submerso durante o transporte para preservar a viabilidade e a integridade estrutural para posterior dissecção e análise funcional.
      NOTA: Para manter a viabilidade do tecido e a função fisiológica, todo o processo de isolamento e subsequente armazenamento em solução de Krebs a 4 °C deve ser concluído em 6 h 24,25,26,27. A solução deve ser substituída regularmente durante os procedimentos para manter a oxigenação e a viabilidade do tecido, facilitando a depuração dos componentes sanguíneos do lúmen vascular.
  3. Identifique visualmente o plano coronal localizando o hilo renal e alinhando o corte para passar pela pelve renal e pela borda convexa lateral. Usando um bisturi estéril, divida o rim ao longo do plano coronal para produzir duas metades simétricas. Essa abordagem expõe a arquitetura interna, incluindo as pirâmides e colunas renais, facilitando a identificação precisa e a subsequente dissecção das artérias intrarrenais (Figura 1A).
    NOTA: Para facilitar a separação das artérias renais, uma porção da pelve renal, pirâmides renais e gordura na superfície transversal deve ser removida primeiro para expor mais vasos sanguíneos (Figura 1B). Tenha cuidado para não cortar os vasos sanguíneos.
  4. Sob um estereomicroscópio, separe meticulosamente as artérias interlobar, arqueada e interlobular usando tesoura de microdissecção e fórceps em uma placa de cultura de fundo preto de 10 cm (Figura 1C).
    NOTA: No rim humano, a artéria interlobular percorre as pirâmides renais, apresentando a parede vascular mais espessa entre os três ramos arteriais 1,8, com diâmetro médio de aproximadamente 1-2 mm. Na junção corticomedular, a artéria interlobar transita para a artéria arqueada, formando um arco semicircular ao longo da borda corticomedular, com diâmetro médio de aproximadamente 500 μm. Os vasos sanguíneos ramificam-se ainda mais no córtex renal, que é a artéria interlobular, com a parede vascular mais fina e o menor diâmetro entre os três, cerca de 200 μm (Figura 1C). Além disso, ao diferenciar os três ramos vasculares, a localização anatômica fornece informações mais críticas do que as medidas do diâmetro vascular absoluto 1,8.
    1. Remova suavemente qualquer tecido e gordura circundantes das artérias, certificando-se de limpá-los completamente em uma placa de cultura de fundo preto de 10 cm (Figura 1B).
  5. Use as artérias renais isoladas (artérias interlobular, arqueada e interlobar) para os seguintes experimentos:
    1. Prepare os segmentos arteriais para processamento histológico aparando cuidadosamente os tecidos isolados em um comprimento padronizado de aproximadamente 3 mm, o que é adequado para inclusão em parafina e secção histológica. Fixe cada amostra em 2 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em temperatura ambiente por 1 h para preservar a morfologia do tecido. Após a fixação, processe com protocolos padrão de desidratação, limpeza e inclusão de parafina para posterior coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com os protocolos histológicos estabelecidos (Figura 2).
      NOTA: Para possíveis avaliações histológicas, as amostras podem ser submetidas à coloração tricrômica de Masson para avaliar a deposição de colágeno ou coloração de Verhoeff-Van Gieson (EVG) para visualização de fibras elásticas, de acordo com protocolos histológicos estabelecidos28,29.
    2. Para estudos de função vascular, armazene anéis intrarrenais em solução de Krebs gelada até o teste. Os anéis arteriais devem estar completamente submersos.
      NOTA: Para ensaios moleculares subsequentes, como western blot / qPCR, congele imediatamente as amostras frescas em nitrogênio líquido após a dissecação e, em seguida, armazene a -80 ° C seguindo os procedimentos publicados anteriormente para preservar a integridade do RNA e evitar a degradação da proteína30,31.

4. Montagem do anel arterial

  1. Identifique as artérias interlobar, arqueada e interlobular por suas distintas posições anatômicas (Figura 1C) e faixas de diâmetro (Figura 2) e, em seguida, separe-as cuidadosamente em anéis de aproximadamente 2 mm de comprimento usando tesouras de microdissecção para estudos de função vascular (Figura 3A).
    NOTA: Armazene imediatamente cada anel arterial isolado separadamente em 5 mL de solução gelada de Krebs até o teste funcional. Para testes funcionais, selecione anéis vasculares não ramificados entre 1,5-2,0 mm de comprimento com cortes perpendiculares limpos. Exclua anéis superiores a 2.0 mm para evitar dificuldades de montagem ou anéis inferiores a 1.5 mm para evitar registros de tensão instáveis.
  2. Prepare todos os anéis arteriais (das artérias interlobar, arqueada e interlobular separadamente) conforme mencionado na etapa 4.1 e leve as soluções de Krebs e 60K+ à temperatura ambiente. Em seguida, ligue o computador conectado, seguido pelo sistema de miógrafo de fio, garantindo que todos os componentes sejam inicializados corretamente antes de prosseguir com os experimentos.
  3. Antes de montar os anéis arteriais nas câmaras do miógrafo de fio, enxágue cada câmara duas vezes com 5 mL de solução de Krebs para garantir a limpeza e eliminar substâncias residuais e, em seguida, adicione 5 mL de solução de Krebs a cada câmara.
    1. Aqueça a solução a 37 °C usando o sistema de controle de temperatura integrado do miógrafo. Simultaneamente, arejar continuamente a solução com gás (uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO2) através de uma linha de gás conectada para manter a oxigenação adequada e o equilíbrio do pH durante a experiência.
  4. Preparar dois fios-guia de 3 cm de comprimento com um diâmetro de 40 μm para cada anel arterial e transferir cuidadosamente os anéis arteriais isolados para outra placa de cultura de fundo preto de 10 cm contendo solução de Krebs.
    NOTA: Diferentes diâmetros de fios-guia devem ser selecionados para vasos sanguíneos de diferentes diâmetros. Para o anel arterial com diâmetro de cerca de 100 μm ou menos, é necessário um fio-guia de 15 μm; se o diâmetro estiver entre 100 μm e 200 μm, utiliza-se um fio-guia de 25 μm; Se o diâmetro for maior que 200 μm, um fio-guia de 40 μm pode ser usado. Para a consistência do experimento, recomenda-se usar o mesmo diâmetro para todos os vasos do mesmo tipo em um único experimento. 19.
  5. Insira cuidadosamente o primeiro fio-guia no anel arterial dentro do prato, dobre um lado do fio-guia 90° e, em seguida, transfira-o para a câmara para fixação no suporte de amostra do tipo clamp usando os parafusos especializados fornecidos pelo instrumento para aperto do parafuso no sentido horário (Figura 3B).
    NOTA: O fio-guia é inserido para fornecer suporte estrutural durante a transferência do anel arterial ao montá-lo no porta-amostras, minimizando danos ou distorções induzidos pelo manuseio.
  6. Antes de fixar o anel arterial no suporte, registre o comprimento e a largura do vaso. Coloque o anel arterial entre os dois suportes (Figura 3C) e leia a escala micrométrica, onde 1 escala representa 10 μm. Subtraia o valor da escala medido quando os suportes mal se tocam (Figura 3D) para determinar o comprimento e a largura do anel arterial.
  7. Passe outro fio-guia pelo vaso sanguíneo e, finalmente, fixe-o do outro lado. Enrole o fio-guia no sentido horário ao redor dos parafusos de fixação em ambos os lados e certifique-se de que esteja firmemente preso à superfície do porta-amostras.
    NOTA: Durante todo o processo de fixação, é necessário evitar puxar o vaso sanguíneo ou arranhar a parede interna do vaso sanguíneo com o fio-guia para evitar danificar o endotélio vascular. O fio-guia deve ser enrolado ao redor do parafuso de fixação em uma única camada sem sobreposição. Os dois fios-guia devem estar no mesmo plano horizontal, paralelos um ao outro e não se cruzarem. Além disso, após fixar o fio-guia, ajuste o porta-amostras em ambos os lados mais próximos; no entanto, eles devem estar próximos um do outro sem realmente entrar em contato, de modo a evitar força, conforme mostrado na Figura 3E e na Figura 3F.
  8. Instale a câmara de volta no sistema de miógrafo de fio. Em seguida, cubra a tampa e ventile o gás. Conecte o sensor e abra o software de aquisição de dados para teste de tensão vascular.

5. Normalização específica do vaso para determinação ideal da tensão inicial

NOTA: O estabelecimento de condições basais estáveis, definidas como a tensão de repouso ideal para a capacidade de resposta contrátil máxima, é fundamental para medições funcionais reprodutíveis. No entanto, devido a diferenças fisiológicas interindividuais inerentes, os vasos sanguíneos humanos exibem maior variabilidade nas propriedades mecânicas basais em comparação com os vasos sanguíneos animais 32,33,34,35,36. Esses fatores, combinados com a heterogeneidade vascular intrínseca (por exemplo, disparidades estruturais e funcionais no diâmetro, espessura da parede e propriedades contráteis), coletivamente levam a variações significativas na tensão basal. Portanto, para garantir a reprodutibilidade experimental, recomenda-se normalizar cada vaso sanguíneo individualmente. O sistema de miógrafo de fio inclui um módulo de normalização dedicado, que permite a determinação precisa da tensão basal para cada vaso.

  1. Monte os anéis arteriais na câmara conforme descrito nas etapas 4.1 a 4.8. Comece a gravação do gráfico, zere o canal (Figura 4A), deixe a estabilização por pelo menos 30 minutos e, em seguida, zere novamente o canal antes de prosseguir com a normalização.
  2. Selecione Configurações de normalização no menu DMT (Figura 4B) e configure os parâmetros da seguinte forma (Figura 4C):
    1. Calibração da ocular (mm/div): 1; Pressão alvo (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Tempo médio online (segundos): 3; Tempo de atraso (segundos): 60.
      NOTA: IC1 denota a circunferência interna do vaso na produção máxima de força ativa, enquanto IC100 representa a circunferência correspondente a 100 mmHg de pressão transmural. As artérias renais humanas exibem variabilidade substancial entre espécimes, exigindo padronização, ao contrário dos modelos animais que possuem propriedades vasculares consistentes para determinação experimental e reutilização das relações IC1/IC100. Devido a variações significativas no diâmetro do vaso, espessura da parede e propriedades mecânicas entre espécimes humanos individuais, cada vaso deve passar por normalização independente para estabelecer suas características de linha de base exclusivas. A proporção de 0,9 foi, portanto, estabelecida como um espaço reservado para a inicialização do protocolo aqui e não usada na prática neste protocolo.
  3. Selecione o canal correspondente à artéria alvo e abra a tela de normalização no menu DMT (Figura 4C), preencha-o com os dados apropriados:
    1. Desfechos teciduais: a1 deve ser 0, a2 deve ser o comprimento do vaso (em mm); diâmetro do fio: 40 μm (insira o diâmetro do fio usado); leitura do micrômetro: o valor da escala do micrômetro, clique em Adicionar ponto para registrar o ponto.
  4. Quando estiver pronto, clique em Adicionar ponto para registrar o primeiro ponto e iniciar o procedimento de normalização.
  5. Aplique alongamento passivo, aguarde 3 min, insira a leitura do micrômetro como o próximo ponto e, em seguida, adicione 5 mL de 60K+ para provocar uma contração do vaso mediada por potássio (Figura 5).
  6. Espere até que a contração atinja um platô. Em seguida, lave a solução de 60K+ com 5 mL de solução de Krebs 3 vezes e calcule os dados de força ativa do traço subtraindo a força passiva em cada trecho da força ativada por potássio (Figura 5).
  7. Repita as etapas 5.5 a 5.6 (etapas "Stretch-60K+ stimulation-Wash") até que a força ativa atinja seu máximo e, em seguida, determine a tensão basal ideal na qual a produção de força ativa do vaso é máxima (Figura 5).
  8. Equilibre o anel arterial na câmara por 10 minutos antes de prosseguir para as próximas etapas do experimento.

6. Detecção de reatividade do anel da artéria renal

  1. Certifique-se de que o volume de Krebs em cada câmara seja de 5 mL antes do início do experimento.
  2. Para avaliar a contração dependente da concentração induzida pela fenilefrina, aplique Phe cumulativo em incrementos de meio log (10-9 a 10-4 M) 37 .
  3. Comece com a menor concentração de Phe (10-9 M). Adicione 5 μL de estoque de Phe (10-6 M) à câmara contendo 5 mL de tampão Krebs, monitore continuamente e aguarde até que a contração se estabilize (2-3 min de tensão inalterada), marque o ponto e adicione a próxima concentração em um incremento de meio log. Repita até atingir a concentração final (10-4 M), mantendo um monitoramento consistente durante todo o tempo (Figura 6).
  4. Para testes adicionais de drogas, lave a câmara com 5 mL mornos de solução de Krebs pelo menos 5 vezes até que a tensão retorne à linha de base e permaneça estável por pelo menos 10 min.
  5. Para avaliar a vasodilatação dependente da concentração induzida pela acetilcolina, aplique ACh cumulativa em incrementos de meio log (10-8 a 10-5,5 M).
    NOTA: Na vasculatura normal, a resposta à acetilcolina (ACh) serve como um indicador funcional da integridade endotelial37,38. A resposta vasodilatadora à ACh reflete a função endotelial por meio do relaxamento mediado por NO em vasos saudáveis. No entanto, em condições patológicas, essa resposta pode ser atenuada ou abolida devido à biodisponibilidade prejudicada do óxido nítrico (NO) e/ou vias de sinalização do receptor alteradas.
  6. Pré-contrair vasos com 10-4 M Phe, adicionar 5 μL de estoque de Phe (10-1 M) à câmara contendo 5 mL de tampão Krebs e incubar por 15 min. Começando com a concentração mais baixa de ACh, adicione 5 μL de estoque de Ach (10-5 M) à câmara contendo 5 mL de tampão Krebs, monitore continuamente e aguarde a resposta de vasodilatação (confirmada pela detecção sustentada de traços), marque o ponto e prossiga para a próxima concentração. Repita até que todos sejam testados (Figura 7).
  7. Complete o experimento salvando o arquivo e removendo os anéis arteriais. Limpe completamente a câmara incubando com 10 mL de solução de ácido acético a 8% por 3 min e depois enxágue com 10 mL de água 3 vezes. Em seguida, incube em 10 mL de etanol a 95% por 3 min e enxágue novamente com 10 mL de água 3 vezes. Por fim, desligue o aquecedor e o gás, garantindo que todo o líquido seja removido antes de desligar o gás.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

No rim humano, a artéria interlobar corre entre as pirâmides renais ao lado de sua veia correspondente. Caracterizada por uma parede vascular relativamente espessa e um invólucro significativo de tecido adiposo, essa artéria requer uma dissecção particularmente cuidadosa. O tecido adiposo circundante deve ser removido meticulosamente para evitar a aplicação de força excessiva durante o procedimento de isolamento (Figura 1C).

A artéria arqueada está anatomicamente ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A estabilidade da perfusão renal serve como um alvo terapêutico crítico e uma janela para a fisiopatologia hemodinâmica39,40. Apresentamos um protocolo para isolamento hierárquico e avaliação funcional de artérias renais humanas a partir de espécimes de nefrectomia fresca, abordando lacunas significativas nas metodologias atuais. Ao contrário das abordagens existentes limitadas a espécimes cadavéricos ou modelos animais, nossa té...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos voluntários por sua participação neste estudo, e também agradecer à equipe cirúrgica do Departamento de Urologia do Primeiro Hospital da Universidade de Pequim por fornecer tecido renal. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (F251013 para Y. Z., 7232096 para Y. L.); Fundação Nacional de Ciências da China (82325004, 92168114 para Y. Z., 82170422 para Y. L.); Programa Nacional de P&D da China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 para Y. Z., 2021YFF0501404 para Y. L., 2023YFC2415500 para L. Y.); Projeto de Pesquisa do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim no Laboratório Estadual de Homeostase e Remodelação Vascular (Universidade de Pequim; 2024-VHR-SY-07 a Y.Z.); 2023 Comissão Municipal de Saúde de Pequim Capital Ciência Médica e Tecnologia Inovação Transformação Excelente Programa de Promoção Projeto (YC202301QX0162 a L. Y.); Financiamento Nacional de Pesquisa Clínica Hospitalar de Alto Nível (Projeto do Fundo de Orientação de Incubação de Transformação de Conquistas Científicas e Tecnológicas do Primeiro Hospital da Universidade de Pequim, 2024CX24 a L. Y.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de acetilcolinaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AlemanhaResposta A6625
Prato de cultura de fundo pretoTecnologia Myo dinamarquesa, Aarhus, Dinamarca300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA501330
D-glicoseSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA610219
Pinça DumontTecnologia Myo dinamarquesa, Aarhus, Dinamarca300413
Tesoura de dissecção GeuderTecnologia Myo dinamarquesa, Aarhus, Dinamarca400431
Fio-guiaTecnologia Myo dinamarquesa, Aarhus, Dinamarca400447Diâmetro 40 µ m
KclSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100781
LabChart Professional versão 8.3 ADInstruments, Austrália-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100288
Sistema multi-miógrafoTecnologia Myo dinamarquesa, Aarhus, Dinamarca620 milhões
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100865
FenilefrinaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AlemanhaPág. 6126

Referências

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Técnica de MicrodissecçãoMiografia por FioDisfunção VascularIsolamento da Artéria IntrarenalRespostas VasomotorasRelação Comprimento-Tensão MuscularColoração com Hematoxilina e EosinaContração por FenilefrinaNormalização Arterial
Microdissecção Multinível e Perfil Funcional-Estrutural de Ramos Arteriais Renais Humanos
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.