O Projeto e a Aplicação de Peptídeo Inibidor para Regulação Negativa Rápida In vitro dos Níveis de Modificações Pós-Traducionais em um Local Específico

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve as especificações de projeto, padrões de controle de qualidade e sistema de verificação funcional do TAT-PIP, um peptídeo inibidor de modificação pós-tradução.

Resumo

As proteínas são os principais executores das atividades vitais e são reguladas nos níveis de modificação transcricional, translacional e pós-traducional (PTM). Além disso, o PTM representa um mecanismo mais complicado para regular as atividades da proteína, pois uma proteína geralmente possui vários tipos de PTMs e vários locais para um PTM específico. A transfecção de plasmídeo ou lentivírus e adenovírus podem ser usados na triagem inicial do local de MPT funcionalmente importante entre todos os locais identificados; No entanto, esses métodos sempre enfrentam desafios como baixa eficiência na entrada de células e tecidos, custos demorados e altos, potencial reação imunológica, etc. Para resolver isso, recentemente desenvolvemos e empregamos com sucesso um tipo de peptídeo recombinado chamado TAT-PIP, peptídeo inibitório de PTM conjugado com TAT. O TAT-PIP consiste em um módulo TAT que facilita a entrada de células e tecidos e um módulo PIP que regula especificamente o PTM em locais específicos por meio de ligação competitiva. Aqui, apresentamos um protocolo que descreve as especificações de projeto, padrões de controle de qualidade e sistema de verificação funcional do TAT-PIP. Na seção de design, descrevemos a consistência, o comprimento opcional, a especificidade e a conservação do TAT-PIP. A seguir, apresentamos os requisitos de teste de qualidade do TAT-PIP, que garantem sua eficácia e segurança. Na aplicação da parte TAT-PIP, introduzimos o teste de gradiente de concentração de TAT-PIP, o processo de incubação das células testadas e a subsequente detecção fenotípica. Em resumo, descrevemos um método eficaz para rastrear locais de PTM, derrubando seletivamente um local específico e observando o fenótipo resultante para inferir sua função. Devido ao seu baixo custo sintético e alta eficiência, este método supera as limitações das tecnologias existentes, como a transfecção de plasmídeo.

Introdução

As proteínas são os principais executores das atividades vitais, e seus processos regulatórios biológicos envolvem dois aspectos principais da regulação da expressão gênica - transcrição gênica e tradução de mRNA. No entanto, durante as últimas décadas, a modificação pós-traducional (MPT) tornou-se outro mecanismo indispensável para regular as funções celulares¹. A fosforilação, a PTM mais conhecida pelos pesquisadores, desempenha um papel particularmente importante nas funções fisiológicas. Por exemplo, depois que a quinase regulada por sinal extracelular (ERK) é fosforilada pela quinase MEK nos sítios Thr202 e Tyr204, sua conformação muda, expondo o sítio ativo, que ativa proteínas-alvo a jusante, como fatores de transcrição². Em contraste, quando o N-terminal Ser9 de GSK-3β é fosforilado pela Akt / PKB quinase, sua bolsa de ligação ao substrato é bloqueada, levando a uma perda de atividade da quinase³. A ubiquitinação é outro PTM importante que regula vários processos celulares através da ligação covalente de moléculas de ubiquitina a proteínas de substrato. A ubiquitina contém 7 resíduos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) e uma metionina N-terminal (M1). A ligação das cadeias de ubiquitina em diferentes locais confere diferentes destinos às proteínas do substrato. A função primária da ubiquitinação ligada ao K48 é marcar proteínas de substrato para degradação pelo proteassoma⁴. Por outro lado, a função primária da ubiquitinação ligada a K63 é se envolver na transdução de sinal não degradativa, como reparo de danos ao DNA, respostas inflamatórias e endocitose⁵. Nos últimos anos, com o rápido avanço das tecnologias proteômicas, um número crescente de novos PTMs foi descoberto. Além da acetilação clássica, novas acilações como propionilação, crotonilação e glutarilação foram identificadas⁶. No campo das modificações de histonas, a lactosilação de histonas interfere na modificação do RNA m⁶A e na homeostase do microambiente imunológico⁷. No campo das modificações não histonas, a redução da crotonilação do ATP5O é um importante fator prejudicial na regulação negativa do metabolismo dos fosfolipídios⁸.

A realização de pesquisas sobre PTM requer o avanço sistemático da análise do proteoma PTM⁹. Este campo engloba duas direções principais de pesquisa: a análise dos perfis de PTM em todo o nível do proteoma e a identificação abrangente dos locais de PTM de uma proteína específica. Embora a espectrometria de massa moderna possa identificar efetivamente vários tipos de PTMs e os locais específicos, a triagem e validação dos principais locais funcionais continua sendo um desafio científico central que restringe o progresso da pesquisa. Estabelecer estratégias eficientes de triagem de locais é o primeiro passo para resolver a função dos principais locais regulatórios. Os métodos tradicionais envolvem a construção de plasmídeos mutantes para locais específicos (mutações inativadoras, mutações ativadoras), introduzindo-os em células-alvo por meio de técnicas de transfecção in vitro e avaliando sistematicamente as mudanças nos indicadores fenotípicos, como proliferação celular, apoptose e estresse oxidativo. No entanto, essa estratégia enfrenta obstáculos técnicos significativos em modelos celulares transcricionalmente silenciosos, como oócitos e sistemas primários de cultura de tecidos. Embora o sistema de transdução de lentivírus ou adenovírus possa superar parcialmente a questão da eficiência da transfecção, sua aplicação enfrenta desafios duplos: altos custos econômicos e baixa eficiência de penetração de partículas virais em modelos de tecidos in vitro . Enquanto a estratégia de construir camundongos knock-in mutantes é extremamente duradoura e cara. No geral, é urgente que estratégias econômicas e eficientes sejam desenvolvidas para a triagem inicial de locais de PTM funcionalmente importantes.

Nos últimos anos, nossa equipe desenvolveu e empregou com sucesso uma técnica rápida de regulação negativa de PTM chamada TAT-PIP, peptídeo inibitório de PTM conjugado com TAT, baseado na inibição competitiva de polipeptídeos. Sua principal vantagem é sua universalidade e alta eficiência para a realização de triagem preliminar de locais de PTM funcionalmente importantes, o que fornece uma base crucial para análises aprofundadas dos mecanismos moleculares dos principais locais de PTM. Este estudo elucida sistematicamente a estrutura principal e o processo de implementação do TAT-PIP e demonstra sua eficácia na regulação do nível de PTM em um local específico por meio de dados experimentais representativos.

Protocolo

1. Projetando a sequência TAT-PIP

NOTA: TAT-PIP consiste em duas partes de peptídeos (Figura 1): A parte N-terminal é TAT, CYGRKKRRQRRR, que permanece inalterada para cada TAT-PIP e pode ajudar a entrar eficientemente em células cultivadas in vitro ou tecidos in vivo ; a parte C-terminal é uma sequência polipeptídica em torno do local específico do PTM (Figura 1, geralmente lisina no símbolo "K", destacado em vermelho) de uma proteína objeto. O comprimento do PIP é de cerca de 10-15 resíduos de AA (se for maior, o custo aumenta; se menor, a especificidade diminui significativamente).

1. Otimize a sequência de PIP por meio da análise de explosão (Figura 2).
   1. Faça login no https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, clique na pesquisa blastp por sequências de proteínas.
   2. Copie a sequência de proteína alvo para a janela de entrada da sequência de consulta .
   3. Em escolher pesquisa, selecione a opção Bancos de dados padrão . Selecione a opção blastp (proteína-proteína BLAST) na seleção do programa. Por fim, clique no botão BLAST (Figura 2B).
   4. Selecione segmentos peptídicos com especificidade máxima como PIPs candidatos.
2. Realize uma comparação de homologia entre humanos e camundongos para o PIP final.
   1. Faça login no https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, clique na pesquisa blastp por sequências de proteínas.
   2. Copie as sequências da proteína de espécies humanas e de camundongos e cole-as na caixa de sequência de entrada.
   3. Clique no botão enviar para obter os resultados.
   4. Selecione um PIP com 100% de homologia entre humano e camundongo (Figura 2C).
3. Determine a composição do TAT-PIP, que consiste no TAT N-terminal e no PIP C-terminal.

2. Síntese e verificação da qualidade do TAT-PIP

1. Selecione uma empresa com ampla experiência em projetos para garantir a pureza do peptídeo não inferior a 98% com espectrometria de massa, evitando impurezas que possam afetar os experimentos subsequentes.
   NOTA: O nível de endotoxina do polipeptídeo deve ser de ≤10 e deve estar livre de patógenos.

3. A aplicação do TAT-PIP

1. Use água ultrapura livre de patógenos para dissolver o TAT-PIP para atingir uma concentração estoque de 10 mg / mL. Dispense o estoque em pequenos tubos para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, o que causará desnaturação parcial.
   NOTA: A adição de 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) ajudará a proteger a estrutura do TAT-PIP.
2. Trate as células com TAT-PIP.
   1. Cultura de células 293T de rim embrionário humano em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina em condições de cultura padrão (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Após a semeadura, as células foram cultivadas por cerca de 12 h, e o tratamento com TAT-PIP foi realizado quando a confluência atingiu aproximadamente 70%.
   2. Diluir o TAT dissolvido a 1 mg/ml utilizando PBS e, em seguida, adicionar diretamente ao meio de cultura celular na dose apropriada (concentração final recomendada do meio de cultura: 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml) durante 24 h.
   3. Lave as células com o meio de cultura original 3 vezes.
   4. Realize a análise de western blot para verificar a extensão da regulação negativa do PTM.
      NOTA: Com base na experiência e nos resultados experimentais subsequentes, a concentração final ideal de TAT-PIP é de 0,1 mg/mL.

4. Mancha ocidental

1. Prepare amostras de proteínas celulares.
   1. Lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 3 vezes, adicione 200 μL de tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação forte (RIPA) (com inibidor de fenilmetilsulfonil fluoreto [PMSF]-protease adicionado) no pellet celular e incube por 5 min para lise preliminar, raspe-os com um raspador de células.
   2. Sonicar a mistura usando um triturador ultrassônico a 12% de intensidade de energia por 5 s.
   3. Refrigerar o lisado celular com gelo durante 30 min e centrifugar a 13400 g a 4 °C durante 10 min.
   4. Transfira o sobrenadante contendo proteínas para um tubo de centrífuga pré-resfriado de 1,5 mL. Adicione 1/4 do volume de tampão de amostra 5x ao sobrenadante (concentração final 1x).
   5. Vortex a mistura, aqueça-a a 95 °C por 5 min em um termostato seco e leve à geladeira com gelo por 2 min.
   6. Meça a concentração total de proteína usando um ensaio de Bradford em um Nanodrop.
2. Realize a eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE).
   1. Use um gel de resolução de 12% e um gel de empilhamento de 4% para o SDS-PAGE.
   2. Pipetar as amostras de proteínas para os alvéolos de acordo com o volume especificado.
   3. Ligue o aparelho de eletroforese e primeiro execute a 80 V, 300 mA por 30 min para alinhar as bandas na interface entre os géis de empilhamento e resolução. Em seguida, execute a 120 V, 300 mA por 45 min para resolver as proteínas.
   4. Transfira as proteínas do gel para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um aparelho de transferência rápida.
3. Realize bloqueio, incubação de anticorpos e visualização.
   1. Bloqueie a membrana de PVDF em leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween 20 (TBST) e incube em temperatura ambiente (RT) por 1 h.
   2. Incubar a membrana com o anticorpo primário diluído a 1:1000 em 5% de leite desnatado/PBST durante a noite a 4 °C num rotador.
   3. Lave a membrana três vezes com TBST (10 min cada).
   4. Incubar a membrana com o anticorpo secundário diluído a 1:1000 em 5% de leite desnatado/TBST em RT durante 1 h.
   5. Lave a membrana três vezes com TBST (10 min cada).
   6. Exponha a membrana em uma série temporal (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s) para obter a imagem ideal sob um dispositivo de quimioluminescência eletrogerada (ECL).

5. Validação funcional de TAT-PIP em células cultivadas in vitro

1. Detecte os níveis de espécies reativas de oxigênio celular (ROS).
   1. Placa de células 293T com uma densidade ideal de 1 x 10⁵ células/poço em uma placa de cultura de 24 poços.
   2. Trate as células com o peptídeo inibidor da crotonilação (THCIP) da histona 116 histona conjugada com TAT (0,1 mg / mL) por 24 h e, em seguida, lave as células com PBS.
   3. Incubar as células com 10 μM de diacetato de dicloro-dihidrofluoresceína (DCFH-DA) em DMEM isento de soro a 37 °C no escuro durante 20 min.
   4. Capture imagens usando um microscópio de fluorescência invertida e meça a intensidade da fluorescência usando a função Medir no ImageJ.
      NOTA: O conjunto de filtros FITC foi usado, com um filtro de emissão de 465-495 nm, um espelho dicróico 505A e um segundo filtro de emissão de 512-550 nm.
2. Ensaio de proliferação celular
   1. Semeie células 293T com uma densidade ideal de 1 x 10,⁵ células por poço em uma placa de cultura de 24 poços.
   2. Adicione 10 μL de reagente CCK-8 a cada poço.
   3. Incubar as células a 37 °C durante 2 h.
   4. Registar a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas e subtrair o sinal de fundo dos poços em branco (meio + CCK-8).
   5. Normalize os dados para calcular a viabilidade celular.
3. Detecção dos níveis de ATP celular
   1. Lise as células com um tampão de lise. Centrifugue o lisado a 12.000 × g por 5 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante para análise posterior.
   2. Diluir a solução-padrão de ATP com o tampão de lise para criar um gradiente de concentração de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM e 5 μM.
   3. Adicione 20 μL de solução de detecção de ATP a cada alvéolo contendo o sobrenadante celular ou o padrão de ATP.
   4. Meça imediatamente o sinal luminescente usando um leitor de microplacas.
      1. Clique em Layout da placa, selecione o modelo de placa correspondente em Alterar modelo de placa para configurar amostras (padrões e amostras).
      2. Em seguida, clique em Protocolo à esquerda, escolha o botão Quimioluminescência e clique em Iniciar para iniciar a detecção.
   5. Gere uma curva padrão a partir dos sinais luminescentes dos padrões de ATP e use-a para quantificar a concentração de ATP no sobrenadante da célula.

Resultados

Este estudo descreve uma estratégia que usa TAT-PIP para regular negativamente o nível de PTM de uma proteína-alvo em um local específico com base na inibição competitiva. Em um exemplo típico, o TAT-PIP aqui é renomeado especificamente como THCIP. É composto por dois módulos funcionais: (1), o peptídeo penetrante de células N-terminal TAT (CYGRKKRRQRRR), que permite que o THCIP penetre nas células; (2) a sequência C-terminal em torno de K116 de H3, AIHAKRVTIMPKD, que compete especificamente com o H3 endógeno para ser cr...

Discussão

Neste protocolo, as etapas a seguir são críticas. Primeiro, o design TAT-PIP aborda a especificidade do peptídeo. Em segundo lugar, otimizar a aplicação e a concentração final; A concentração otimizada deve ser cuidadosamente testada para obter um knockdown eficiente e rápido. Em terceiro lugar, para verificar o efeito do TAT-PIP, vários experimentos são recomendados, em vez de confiar em um único experimento para confirmar seus efeitos adicionais.

Comparando ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema automático de imagem multifuncional	Tanon	4600	O medidor de exposição identifica e visualiza as bandas de proteína alvo detectando os sinais de fluorescência ou quimioluminescência na membrana após o tratamento de desenvolvimento.
Kit de contagem de células-8	GLPBIO	GK10001	Com base na correlação entre a viabilidade metabólica celular e o número de células, este método avalia a capacidade proliferativa das células medindo a capacidade de redução das células aos reagentes CCK-8
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)	Gibco	11995065	O meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) é um meio basal amplamente utilizado para apoiar o crescimento de uma ampla gama de células de mamíferos.
Substrato quimioluminescente ECL	ECL Biosharp	BL520B	geram sinais de luz por meio de reações de quimioluminescência que permitem a detecção de proteínas específicas ou ácidos nucléicos.
Aparelho de eletroforese	Tanon	EPS600	O principal papel do aparelho de eletroforese é separar e analisar macromoléculas biológicas ‌
Kit de ensaio de ATP aprimorado	Beyotime	S0027	O kit pode detectar efetivamente o nível de ATP das amostras Soro
bovino fetal (FBS)	Gibco	16000-044	O soro bovino fetal (FBS) fornece nutrientes essenciais e fatores de crescimento para a manutenção e crescimento celular.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	O dispositivo é altamente eficiente e é capaz de realizar rapidamente a transferência de proteínas do gel de poliacrilamida para a membrana de PVDF em 15 minutos
Microscópio de fluorescência invertida	Olympus Corporation	IX73	A microscopia de fluorescência usa luz ultravioleta como fonte de luz para irradiar o objeto examinado para fazê-lo emitir fluorescência e, em seguida, observar a forma e a localização do objeto sob o microscópio.
NanoDrop2000 espectrofotômetro UV-Vis de microvolume	Thermo Scientific	2000	NanoDrop foi usado para determinar a concentração de membrana de DNA ou RNA
PVDF	BioRAD	1620177	Este tipo de membrana PVDF tem excelente resistência química e alta capacidade de ligação a proteínas
Kit de ensaio ROS	Beyotime	S0033S	O kit pode detectar com precisão o nível de espécies reativas de oxigênio nas células
Conjugador de TAT H3K16 Peptídeo inibidor de crotonilação	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD	CN218107533U	Pode competir especificamente com o H3 endógeno para ser crotonilado em K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST pode limpar substâncias irrelevantes na membrana, reduzir erros experimentais e garantir a precisão dos resultados experimentais ‌
Triturador ultrassônico	LICHEN	LC-AUD-150P	As principais funções do aparelho incluem fragmentação celular, dispersão de partículas e emulsificação
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	podem obter análises quantitativas de alto rendimento de amostras biológicas, detectando os sinais ópticos (como absorbância, fluorescência ou luminescência) de amostras em microplacas

Os substratos Os leitores de microplacas