Função da artéria renal e histopatologia ligadas a metabólitos plasmáticos e fecais em pacientes com insuficiência cardíaca

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de uma plataforma multimodal para elucidar a disfunção vascular renal impulsionada por metabólitos cardíacos na síndrome cardiorrenal.

Resumo

A microbiota intestinal e seus cometabólitos hospedeiro-micróbio associados são cada vez mais reconhecidos como reguladores-chave do equilíbrio metabólico sistêmico e do eixo cardiorrenal, particularmente no contexto da síndrome cardiorrenal. Embora as evidências clínicas indiquem que a disfunção cardíaca pode iniciar ou exacerbar alterações patológicas renais, as principais moléculas de sinalização metabólica que medeiam o eixo cardiorrenal e seus mecanismos subjacentes permanecem indefinidos. Este estudo estabelece uma nova plataforma de pesquisa sistemática integrando assinaturas cardiometabólicas com análise da função vascular renal, compreendendo: (1) Isolamento e extração de metabólitos plasmáticos/fecais de pacientes com insuficiência cardíaca; (2) Técnicas de isolamento vascular renal ex vivo e cultura primária; (3) Uma estrutura de avaliação multimodal para interações metabólicas cardiorrenais, incorporando ensaios funcionais vasculares, testes bioquímicos moleculares para marcadores de lesão vascular renal e análises histopatológicas. Em comparação com controles saudáveis, os metabólitos de pacientes com insuficiência cardíaca prejudicaram a função vascular renal e induziram respostas inflamatórias, destacando seu potencial como biomarcadores funcionais na síndrome cardiorrenal. Este estudo não se concentra em um metabólito específico; portanto, será necessária uma maior identificação e validação dos tipos específicos de metabólitos que exercem efeitos patogênicos em estudos futuros usando técnicas analíticas como LC-MS/MS e RMN. A aplicação desta plataforma revelou que os metabólitos associados à doença cardíaca prejudicam a função vascular renal e a homeostase. Essas descobertas fornecem uma visão mecanicista sobre os fatores metabólicos das interações cardiorrenais e oferecem uma ferramenta translacional para identificar novos biomarcadores e alvos terapêuticos.

Introdução

A Síndrome Cardiorrenal (RSC) é uma condição patológica complexa caracterizada por danos bidirecionais entre o coração e os rins. A intrincada interdependência entre esses dois órgãos foi descrita pela primeira vez por Robert Bright em 1836, que documentou sistematicamente mudanças estruturais significativas no coração associadas à doença renal avançada¹. A prevalência da RSC está fortemente ligada à coexistência de doença cardiovascular (DCV) e doença renal crônica (DRC). Estudos indicam que aproximadamente 30% dos pacientes com insuficiência cardíaca também têm DRC, enquanto 44%-51% das mortes em pacientes com DRC são diretamente atribuídas a eventos cardiovasculares².

O gerenciamento do CRS apresenta vários desafios significativos. Em primeiro lugar, o atendimento clínico permanece fragmentado, com falta de coordenação interdisciplinar e mecanismos de alerta precoce, muitas vezes levando a intervenções tardias durante a fase de descompensação³. Em segundo lugar, as estratégias de tratamento atuais enfrentam um dilema paradoxal. Terapias convencionais, como diuréticos e inibidores do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), podem aliviar os sintomas de insuficiência cardíaca⁴; no entanto, seu uso prolongado ou em altas doses pode ativar o SRAA e o sistema nervoso simpático (SNS), exacerbando a hipóxia e a fibrose renal, contribuindo para a resistência diurética e piora da função renal⁵. Da mesma forma, embora os inibidores da enzima conversora de angiotensina (IECA) e os bloqueadores dos receptores da angiotensina (BRAs) possam mitigar o dano cardiorrenal, seu uso clínico é frequentemente limitado devido a preocupações com creatinina sérica elevada ou hipercalemia, com apenas 30% a 40% dos pacientes capazes de tolerar a terapia a longo prazo⁶.

Dados esses desafios, há uma necessidade urgente de identificar biomarcadores precoces eficazes e alcançar uma compreensão mais profunda da patogênese da RSC para facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos. No entanto, as limitações atuais na identificação de mediadores acionáveis da diafonia cardiorrenal - particularmente metabólitos específicos da doença que ligam diretamente a disfunção cardíaca à lesão vascular renal - impedem o progresso na resolução dessas necessidades clínicas não atendidas. Evidências emergentes sugerem que os metabólitos associados a doenças cardíacas podem servir como biomarcadores diagnósticos e condutores mecanicistas da RSC, reprogramando a homeostase vascular renal, mas seus papéis espaço-temporais no início ou amplificação da lesão renal permanecem mal caracterizados ^7,8,9. Estudos recentes demonstraram que metabólitos endógenos, como ceramidas, podem agravar ativamente a inflamação e a remodelação vascular, particularmente em condições cardiorrenais, destacando a relevância mais ampla da detecção de metabólitos na patologia vascular¹⁰.

Dentre os compartimentos renais acometidos na RSC, a vasculatura é cada vez mais reconhecida como alvo primário e precoce da lesão. A disfunção endotelial na microcirculação renal - marcada por biodisponibilidade prejudicada do óxido nítrico, estresse oxidativo e expressão elevada de mediadores pró-inflamatórios e pró-trombóticos - contribui para a rarefação microvascular, aumento da permeabilidade vascular e hipóxia regional¹¹. Paralelamente, as células musculares lisas vasculares (VSMCs), essenciais para regular o tônus arterial e a complacência, também são vulneráveis à desregulação metabólica na RSC. Evidências acumuladas indicam que os metabólitos associados à doença podem interromper a contratilidade do VSMC, promover a remodelação desadaptativa e contribuir para o aumento da rigidez vascular e comprometimento da perfusão renal. Apesar de seu papel fundamental, os mecanismos de disfunção vascular impulsionados pelo músculo liso permanecem pouco explorados nos modelos atuais de RSC ^8,12. Essas alterações fisiopatológicas não apenas exacerbam o dano renal, mas também promovem ativação neuro-hormonal desadaptativa e distúrbios hemodinâmicos sistêmicos, prejudicando ainda mais a função cardíaca e perpetuando a progressão da RSC¹³. Assim, o direcionamento da lesão vascular renal oferece uma janela mecanicamente informativa para a patogênese precoce da RSC e fornece um foco racional para investigar as interações metabólicas coração-rim.

Para abordar essas lacunas, nosso estudo prioriza a identificação sistemática e a validação funcional de metabólitos associados à insuficiência cardíaca como reguladores centrais da progressão da RSC. Este trabalho preenche a desconexão crítica entre a descoberta de biomarcadores observacionais e a pesquisa de patogênese mecanicista, delineando como esses metabólitos induzem disfunção vascular renal, ativam cascatas inflamatórias e comprometem os mecanismos de reparo tecidual. Os modelos tradicionais usados para estudar a RSC - incluindo modelos animais, culturas de células in vitro e organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) - têm limitações¹⁴. Os modelos animais sofrem de diferenças entre espécies que limitam a relevância clínica. As culturas in vitro carecem de integração em nível de órgão, enquanto os organoides derivados de iPSC - embora capazes de modelar interações cardiomiócitos-células epiteliais tubulares - permanecem funcionalmente imaturos e são limitados aos estágios iniciais de desenvolvimento¹⁵. Além disso, os sistemas organoides vasculares atuais consistem principalmente em monocamadas endoteliais ou microvasos primitivos, sem a camada contrátil do músculo liso e leituras funcionais necessárias para avaliar as respostas no nível do vaso à lesão metabólica¹⁶.

Em contraste, nossa plataforma emprega metabólitos cardíacos derivados de humanos e vasculatura renal humana ex vivo , permitindo artérias renais humanas ex vivo fisiologicamente relevantes e estruturalmente intactas, permitindo análises fisiologicamente relevantes e mecanicamente informativas das interações metabólicas cardiorrenais na interface vascular. Isso fornece uma vantagem única na modelagem da comunicação metabólica entre órgãos subjacente à progressão da síndrome cardiorrenal. Nossa plataforma pioneira de pesquisa cardiorrenal integrada sinergiza três inovações principais: perfil metabolômico de metabólitos plasmáticos/fecais derivados de insuficiência cardíaca, sistemas de isolamento/cultura renovascular ex vivo e avaliação funcional-molecular-histopatológica multimodal. Cada componente desta plataforma foi otimizado para reprodutibilidade e relevância translacional, incluindo o uso de 200 μL de plasma ou 0,1 g de material fecal por amostra, incubação de segmentos de artéria renal humana de 2 mm a 37 °C com 5% de CO₂ por até 24 h e detecção quantitativa baseada em reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) de marcadores de lesão vascular. Este sistema não apenas decifra o potencial diagnóstico das assinaturas de metabólitos, mas também vincula diretamente suas contribuições causais à patologia da RSC, permitindo a identificação de alvos terapêuticos por meio do mapeamento em nível molecular da desregulação metabólica entre órgãos. Ao unir a descoberta mecanicista com a tradução clínica, esse paradigma de foco duplo muda o gerenciamento da SRC do controle reativo dos sintomas para intervenções proativas orientadas por biomarcadores.

Protocolo

Os protocolos experimentais e metodologias de caso empregados neste estudo foram aprovados eticamente pelo Departamento de Urologia do Primeiro Hospital da Universidade de Pequim (Código de Revisão Ética: 2023yan500-002) e pelo Peking Union Medical College Hospital (aprovação nº I-23PJ585), com estrita adesão aos princípios descritos na Declaração de Helsinque. Para este estudo, recrutamos pacientes do sexo masculino ou feminino hospitalizados no Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) a partir de julho de 2019, diagnosticados com insuficiência cardíaca (IC) por pelo menos dois cardiologistas experientes. Um total de quatro pacientes com IC (HF1-HF4) foram incluídos para extração de plasma e metabólitos fecais. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os sujeitos antes de sua inclusão na pesquisa. O aparato experimental e os reagentes são mostrados na Tabela de Materiais.

1. Processamento de amostras de plasma e fezes - extração de metabólitos polares

1. Coleta de amostras
   1. Colete todas as amostras de plasma e fezes em tubos de coleta estéreis e pré-resfriados e congele-as imediatamente em nitrogênio líquido após a coleta. Armazenar as amostras a -80 °C até ao processamento.
   2. Para garantir a estabilidade do metabólito, processe todas as amostras dentro de um ciclo de congelamento e descongelamento e não deixe o intervalo de tempo entre a coleta e a extração da amostra exceder 2 semanas.
      NOTA: Essas medidas foram tomadas para minimizar a degradação do metabólito e garantir a reprodutibilidade nas análises metabolômicas a jusante.
   3. Extraia metabólitos de amostras fecais e plasmáticas seguindo as etapas 1.3 ou 1.4 do protocolo, respectivamente.
2. População do estudo
   1. Faça medições de pressão arterial basal e registre o histórico de medicamentos de todos os participantes.
   2. Colete amostras de pacientes antes de qualquer deterioração clínica aguda, excluindo indivíduos com comorbidades metabólicas importantes (por exemplo, diabetes, hipertensão primária) para minimizar fatores de confusão na análise metabolômica (Tabela Suplementar S1).
   3. Obtenha informações clínicas para cada sujeito usando procedimentos padrão.
3. Extração de plasma
   1. Centrifugue o soro bruto a 14.000 × g por 10 min (4-8 ° C). Colete o sobrenadante em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Adicione metanol resfriado (-80 °C) de grau HPLC para atingir 80% (v/v) de concentração de metanol. Misturar delicadamente por inversão e incubar a -80 °C durante 6-8 h.
   3. Centrifugue a 14.000 × g por 10 min (4-8 °C). Transferir o sobrenadante metanólico para tubos frescos para definição do perfil metabolómico.
      NOTA: Coloque as amostras de plasma após a coleta em um freezer de -80 ° C dentro de 2 h e minimize os ciclos de congelamento e descongelamento para garantir a estabilidade do metabólito.
4. Extração fecal
   1. Adicione 500 μL de metanol de grau HPLC (pré-resfriado a -80 °C) a amostras fecais frescas ou congeladas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Homogeneizar usando um micro-pilão/homogeneizador de tecidos em gelo seco por 1-2 min, seguido de vórtice (1 min a 4-8 °C) e incubação a -80 °C por 4 h.
   2. Centrifugue a 14.000 × g por 10 min (4-8 °C) usando uma centrífuga refrigerada. Transferir o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml; Conservar a -80 °C até ao passo 1.4.4.
   3. Ressuspenda o pellet com 400 μL de metanol pré-resfriado (-80 °C) para HPLC. Vortex completamente (1 min a 4-8 °C) e incubar a -80 °C por 30 min.
   4. Repita a centrifugação (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Combinar os sobrenadantes de ambas as fases de extracção.
   5. Realize uma centrifugação de clarificação final (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Transfira o sobrenadante purificado para tubos estéreis de 1,5 mL para análise a jusante.
      NOTA: Coloque as amostras fecais após a coleta em um freezer de -80 ° C dentro de 2 h e minimize os ciclos de congelamento e descongelamento para garantir a estabilidade do metabólito.

2. Isolamento da artéria renal

1. Seleção de participantes e coleta de tecidos
   1. Rastreie pacientes submetidos a nefrectomia radical para carcinoma de células renais. Inclua apenas aqueles com idade ≥ 18 anos sem comorbidades metabólicas (por exemplo, hipertensão primária, diabetes mellitus). Durante a cirurgia, colete o parênquima renal histologicamente normal localizado a pelo menos 3 cm das margens do tumor.
   2. Mergulhe imediatamente os espécimes colhidos em tampão Krebs-Henseleit oxigenado (4 ° C, pH 7,4; composição em mM: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 25,0 NaHCO₃, 1,2 KH₂PO₄, 11,0 glicose). Conclua os procedimentos de isolamento dentro de 6 h após a cirurgia.
2. Preparação do tecido renal
   1. Realize o corte coronal em tampão Krebs a 4 ° C para obter amostras heminéfricas contendo estruturas hilares intactas. Realize a microdissecção usando um sistema estereomicroscópico (aumento de 40x) para expor os ramos da artéria arqueada renal e identificar as artérias arqueadas.
3. Dissecção microvascular
   1. Obtenha um isolamento preciso dos segmentos arteriais através da remoção sequencial do tecido adventício perivascular usando uma tesoura de microcórnea.
   2. Preservar os segmentos arteriais com um diâmetro de aproximadamente 500 μm.
   3. Minimize a tensão de cisalhamento endotelial por meio da manipulação sem tensão com micropinças. Realizar a dissecção em condições hipotérmicas (4 °C) com tampão de Krebs renovado a cada 15 min para preservar o pH fisiológico e a homeostase iónica.
      NOTA: A quantificação explícita das dimensões arteriais e da composição do tampão, um fluxo de trabalho termicamente regulado desde a obtenção (4 °C) até o processamento (4 °C) e a dissecção microvascular completa dentro de 6 h após a coleta da amostra garantem a viabilidade ideal do tecido e a integridade funcional.

3. Incubação da artéria renal com metabólitos de lesão cardíaca

1. Preparação do tecido vascular: Dissecar as artérias renais microcirurgicamente em condições estéreis e remover meticulosamente o tecido conjuntivo perivascular aderente usando uma pinça oftálmica fina. Corte as artérias renais isoladas em segmentos de 2 mm usando microtesoura estéril para posterior cultura organotípica.
2. Descontaminação antibiótica: Lave os segmentos vasculares por 3 x 5 min com solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com coquetel triplo de antibióticos/antimicóticos para minimizar a contaminação microbiana e garantir a esterilidade antes da exposição ao metabólito.
3. Agrupamento experimental: Atribua aleatoriamente segmentos vasculares a quatro coortes experimentais e transfira para placas de cultura de 24 poços contendo 500 μL de Dulbecco's Modified Eagle Medium por poço.
4. Intervenção de metabólitos
   1. Adicione metabólitos dos seguintes grupos: 1) Metabólitos derivados do plasma de controle saudável (HC-P); 2) Metabólitos derivados do plasma de pacientes com insuficiência cardíaca (HF-P); 3) Metabólitos derivados de fezes de controle saudável (HC-F); 4) Metabólitos derivados de fezes de pacientes com insuficiência cardíaca (HF-F).
   2. Reconstituir extratos de metabólitos em metanol (grau HPLC) e administrar 10 μL de cada extrato no poço correspondente da placa de cultura de 24 poços, que contém 500 μL do meio de Eagle modificado de Dulbecco e segmentos de artéria renal (concentração final de solvente de 2% (v / v)). Adicionar volumes equivalentes de veículo (mistura de metanol/PBS) aos alvéolos de controlo.
5. Condições de cultura: Incubar os conjuntos de placas em condições padrão de cultura de células (37 °C, 5% CO₂, 95% de humidade) durante 24 h utilizando uma incubadora humidificada.

4. Ensaio do anel da artéria renal

1. Suspensão e fixação do anel arterial renal
   1. Preparação do fio: Passe dois fios paralelos de aço inoxidável de 2 cm (pré-equilibrados em Krebs, 95% O₂/5% CO₂) através do lúmen arterial sob microscopia óptica, garantindo uma protrusão igual do fio em ambas as extremidades.
   2. Montagem do miógrafo: Ligue o sistema de aquecimento e o gás para manter a temperatura fisiológica e a oxigenação. Prenda os fios horizontalmente em um banho de miógrafo de fio com temperatura controlada (Krebs, 95% O₂/5% CO₂). Ajuste os botões dos parafusos para manter o relaxamento natural do vaso.
2. Determinação da tensão inicial ideal com normalização específica do vaso
   NOTA: A tensão de repouso foi ajustada usando um procedimento de normalização para padronizar as condições basais, otimizar a capacidade de resposta do vaso e garantir a reprodutibilidade. Equilibre por 30 min antes de prosseguir com a normalização.
   1. Selecione Configurações de normalização no menu DMT , usando os seguintes parâmetros: calibração da ocular: 1 mm/div; pressão alvo: 13.3 kPa; Relação IC1/IC100: 0,9 C; média online: 3 s; Tempo de atraso: 60 s.
      NOTA: Detalhes adicionais de configuração do sistema e de fundo são fornecidos no documento de referência¹⁷.
   2. Para normalizar um recipiente, selecione o canal de interesse e preencha a tela de normalização com dados. Defina os pontos finais do tecido com base na leitura do micrômetro e no diâmetro do fio de 40 μm.
   3. Aplique o alongamento passivo e aguarde 3 min. Administre 60K⁺ para induzir uma contração mediada por potássio e espere até que a contração atinja um platô. Enxágue a preparação 3 x 5 min com solução de Krebs para lavar os 60K⁺. Calcule a força ativa subtraindo a força passiva em cada nível de estiramento da força induzida por potássio registrada no traço.
   4. Repita a etapa 4.2.3 até que a força ativa máxima seja atingida. Defina a tensão de repouso ideal como o nível que produz a tensão ativa máxima em cada artéria, com respostas de pico a K ⁺ alto usado como contrações de referência.
   5. Equilibre o anel arterial por 10 minutos antes de novos experimentos.
      NOTA: Devido à variabilidade interindividual significativa nos graus, espessuras e origens dos vasos, normalize cada vaso sanguíneo individualmente para garantir a reprodutibilidade. Use o módulo de normalização do sistema de miografia de fio para determinar a tensão basal apropriada com base no diâmetro passivo e nas propriedades mecânicas de cada vaso. Aplique o procedimento de forma consistente em todas as amostras antes do teste funcional.
3. Detecção de reatividade de anéis de artéria renal
   1. Para investigar os efeitos de diferentes metabólitos na contratilidade vascular, realizar testes de função de contração vascular usando artérias renais incubadas com plasma extraído e metabólitos fecais de voluntários saudáveis e pacientes com IC por 12 h. Para obter detalhes específicos, consulte a seção 3.
   2. Use 60K⁺ para provocar uma contração mediada por potássio. Certifique-se de que cada câmara tenha 5 mL de solução de Krebs.
   3. Para determinar as contrações dependentes da concentração induzidas por fenilefrina (Phe) nos anéis das artérias, adicione Phe em incrementos de meio log de ^10-9 a ^10-4 M. Comece com a concentração mais baixa de Phe, introduza-a na câmara e aguarde uma contração constante.
   4. Marque o ponto em que uma contração constante é alcançada (ou seja, registre o valor da tensão no platô) e, em seguida, passe para a próxima concentração. Repita até que a concentração final tenha sido adicionada com sucesso.
   5. Depois de terminar o experimento, salve o arquivo de dados e remova os anéis das artérias. Limpe bem a câmara com uma solução de ácido acético a 8% e incube por 3 min.
   6. Desligue o sistema de aquecimento e o gás, certificando-se de que todo o líquido foi removido antes de desligar o gás.

5. Exame histopatológico da artéria renal: coloração de hematoxilina-eosina

NOTA: Descarte reagentes perigosos e resíduos biológicos de acordo com os protocolos institucionais de biossegurança e higiene química. Especificamente, o xileno e o paraformaldeído devem ser coletados em recipientes de resíduos químicos rotulados e seláveis e armazenados em uma área designada de capela antes do descarte por manipuladores de resíduos perigosos certificados. O ácido acético usado para limpeza da câmara do miógrafo deve ser neutralizado e descartado seguindo os procedimentos padrão de descarte de resíduos ácidos. Não descarregue nenhum desses reagentes em pias de laboratório.

1. Lave as artérias em PBS frio e fixe em paraformaldeído a 4% (pH 7,4) durante a noite. Corte cortes seriados a 4 μm e processe para histologia.
2. Incubar secções de tecido montadas em lâminas de vidro num secador de lâminas a 60 °C durante 1 h e, em seguida, transferir imediatamente para xileno. Mergulhe as seções em xileno (3 x 5 min).
3. Submeter as seções à hidratação graduada do etanol: 100% etanol (2 x 5 min), 95% etanol (1 x 5 min), 90% etanol (1 x 5 min), 80% etanol (1 x 5 min), 70% etanol (1 x 5 min), enxágue com água ultrapura (1 x 5 min).
4. Coloração com hematoxilina (0,5% p/v) por 5 min; Em seguida, enxágue em água corrente.
5. Diferencie com álcool ácido a 1% (HCl-etanol) por 5-10 s e enxágue em água corrente.
6. Azule as seções em água com 0,6% de amônia e enxágue em água corrente.
7. Mergulhe as seções em solução de eosina (1% p / v) por 2 min.
8. Desidrate e limpe as seções em etanol 95% (2 x 5 min), etanol 100% (2 x 5 min) e xileno (2 x 5 min).
9. Seque ao ar brevemente até obter transparência óptica, monte em meio de montagem, cubra com lamínulas e sele as lamínulas com um meio de montagem neutro.
10. Realize imagens de campo claro e avaliação histomorfométrica.

6. Detecção de biomarcadores moleculares associados à lesão renal

1. Extração de mRNA da artéria renal
   1. Adicione o tecido vascular criopreservado em nitrogênio líquido a 1 mL de reagente de extração de RNA e transfira para um homogeneizador de tecido pré-resfriado para homogeneização completa.
   2. Adicionar 250 μL de clorofórmio por 100 μl do reagente de extração, vortex vigorosamente durante 30 s e incubar durante 10 min a 25 °C.
   3. Centrifugar a 12.000 × g (10 min, 4 °C) e transferir a fase aquosa para um tubo novo.
   4. Adicione 500 μL de isopropanol à fase aquosa, misture por inversão e incube por 20 min a 25 ° C.
   5. Centrifugue a 12.000 × g (10 min, 4 °C) e descarte o sobrenadante.
   6. Lave o pellet com 1 mL de etanol a 75% (2 x 5 min), seque ao ar o pellet de RNA e ressuspenda em DEPC-H₂O (0,1% v / v).
      NOTA: Verifique a pureza do RNA (OD₂₆₀ / OD₂₈₀ = 1.9-2.0) e confirme as bandas de rRNA 28S / 18S intactas.
2. síntese de cDNA
   1. Misture 2 μg de mRNA + 1 μL de oligo (dT) primer, ajuste para 8 μL com DEPC-H₂O (0,1% v / v), aqueça a 70 ° C por 5 min e deixe esfriar no gelo por 5 min.
   2. Prepare a mistura principal de transcrição reversa em 10 μL de mistura de reação 2x TS, 1 μL de mistura enzimática RT/RI e 1 μL de removedor de gDNA. Adicione os 12 μL de master mix aos 8 μL de mistura de RNA/primer da Etapa 6.2.1 para obter um volume total de reação de 20 μL.
   3. Aqueça a mistura a partir da etapa 6.2.2. a 42 °C por 60 min e terminar o processo aquecendo a 85 °C por 5 min.
   4. Dilua os 20 μL de reação de transcrição reversa adicionando 80 μL de H₂O livre de nuclease, resultando em um volume final de 100 μL (diluição 4x). Use o cDNA diluído como modelo para PCR quantitativo.
3. Análise quantitativa de PCR
   1. Configure a reação misturando 2,0 μL de molde de cDNA, 0,5 μL de primer direto (10 μM), 0,5 μL de primer reverso (10 μM), 10 μL de master mix SYBR Green (2x) e 7 μL de ddH₂O.
   2. Realize a PCR usando as seguintes configurações: desnaturação inicial: 95 °C/3 min; 40 ciclos: 95 °C/30 s; Tm-5 °C/30 s; 72 °C/30 s; curva de fusão: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
   3. Analisar a expressão gênica pelo método 2-ΔΔct. As sequências de primers são mostradas na Tabela Suplementar S2.

Resultados

A coorte foi composta por duas mulheres e dois homens, com faixa etária de 46 a 73 anos (média de idade: 64,0 anos). As medidas basais da pressão arterial mostraram pressão arterial sistólica variando de 109 a 168 mmHg e pressão diastólica de 68 a 115 mmHg. Todos os pacientes com IC tinham história de medicação registrada, incluindo agentes cardioprotetores comuns, como betabloqueadores, estatinas e antiplaquetários, com variações individuais nos inibidores do sistema renina-angiotensina e diuréticos. Para os controles, ...

Discussão

Pesquisas recentes em RSC identificaram a reprogramação metabólica como um mecanismo patológico chave, com metabólitos regulando a homeostase vascular renal ^7,8,9. Embora os VSMCs desempenhem um papel crítico na regulação do tônus vascular e da complacência na RSC, nosso estudo fornece evidências diretas de que os metabólitos associados à lesão cardíaca prejudicam a contratilidade e a integridad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM Glicose Alta	Gibco	Gato # 06-1055-57-1-ACS
PBS	Solarbio	Gato # P1010
Penicilina-estreptomicina-anfotericina B	Thermo Fisher Científico	Gato# 15240062
Fenilefrina	MCE	Gato # HY-B0769
Sistema de transcrição reversa	Promega	Gato # A5001
Sistema estereomicroscópico	Leica	M80
Mistura master SYBR Green	Thermo Fisher Científico	Gato # 4309155
Sistema de medição de tensão vascular	DMT	620 milhões