Artigo de método

Um ensaio de permeabilidade de membrana lipossomal para investigar os efeitos dos grupos fosfato de fosfatidilinositol na ação membranotrópica do veneno PLA2

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DOI:

10.3791/68594

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26 de setembro de 2025

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um método econômico para avaliar a permeabilidade da membrana lipossomal com sensibilidade e resolução superiores às técnicas convencionais. Usando uma nova reação de substituição de ligante encapsulada, esta técnica detecta alterações induzidas pela fosfolipase A2 nas membranas do modelo. Facilmente integrada com análises padrão, essa abordagem acessível melhora a resolução para estudar a biofísica da membrana e as interações de toxinas.

Resumo

Desenvolvemos um ensaio novo, econômico e altamente sensível para avaliar a permeabilidade da membrana lipossomal com base em reações de substituição de ligantes envolvendo ligantes encapsulados no volume interno dos lipossomas, que combinamos com um ensaio de atividade hidrolítica (usando acilação de coenzima A) e simulação de modelagem molecular para investigar se os fosfatos do anel inositol no fosfatidilinositol protegem as membranas dos efeitos prejudiciais de enzimas expressas de forma aberrante. A expressão aberrante das fosfolipases A2 (PLA2) leva à desmielinização dos axônios que desencadeia o desenvolvimento de esclerose múltipla e doença de Alzheimer. Para imitar os efeitos do PLA₂ expresso de forma aberrante, usamos a subunidade básica do veneno de víbora PLA₂, HDP-2P. O HDP-2P foi testado em lipossomas de fosfatidilcolina (PC) enriquecidos com fosfatidilinositol, fosfatidilinositol-4-fosfato (PI-4-P) ou fosfatidilinositol-4,5-difosfato (PI-4,5-P2). Enquanto o HDP-2P mostrou atividade hidrolítica mínima e permeabilidade apenas ligeiramente aumentada em lipossomas PC, o enriquecimento de lipossomas PC com PI aumentou tanto a hidrólise quanto a permeabilidade. Notavelmente, PI-4-P e PI-4,5-P₂ inibiram drasticamente a atividade hidrolítica do HDP-2P e reduziram completamente a permeabilidade. Simulações de modelagem molecular revelaram que os fosfatos do anel inositol no fosfatidilinositol bloqueiam estericamente o acesso dos fosfolipídios ao sítio ativo do HDP-2P, impedindo a hidrólise. Tanto os dados in vitro quanto in silico sugerem que os fosfatidilinositóis fosforilados estão associados à redução da atividade do PLA₂, indicando um mecanismo potencial para mitigar a atividade excessiva do PLA2 - presumivelmente como um meio de proteger as membranas celulares da degeneração.

Introdução

O fosfatidilinositol (PI) é um fosfolipídio aniônico que consiste em uma estrutura de ácido fosfatídico ligada ao inositol, um anel hexahidroxi de seis carbonos, por meio de um grupo fosfato. O inositol pode ser reversivelmente convertido em fosfoinositídeos por fosforilaçãonas posições de carbono 2, 3, 4, 5 e 6 1. PI e fosfoinositídeos são encontrados em membranas plasmáticas e organelas de várias células em animais, plantas e microorganismos. Setenta anos após sua descoberta por Mable e Lowell Hokin 2,3,4, o IP e os fosfoinositídeos continuam sendo objeto de extensa pesquisa com o objetivo de entender seus mecanismos moleculares e sua relevância para a saúde humana 5,6,7.

Além do tecido cerebral, os fosfoinositídeos estão tipicamente presentes em baixas concentrações, representando cerca de 0,5 a 1% do total de lipídios no folheto interno da membrana plasmática. Os dados publicados indicam que é improvável que o IP desempenhe um papel estrutural importante em condições fisiológicas1. No entanto, durante os estados de doença, os níveis de IP e fosfoinositídeos aumentam e eles se deslocam para o folheto externo da membrana plasmática, indicando que esses fosfolipídios podem estar ligados à resistência à doença1. Embora há muito se pense que o PI desempenha um papel fisiológico menos significativo em comparação com os fosfoinositídeos, evidências emergentes destacam a importância do PI-4-P e do PI-4,5-P2 em vários processos fisiológicos1. Esses processos incluem sinalização intracelular, transdução de sinal intercelular 8,9,10, tráfego de membrana11,12,13, modulação da expressão gênica1, bem como proliferação celular14 e sobrevivência 1. Apesar disso, os mecanismos moleculares pelos quais o IP e os fosfoinositídeos impulsionam esses processos permanecem pouco compreendidos.

IP e fosfoinositídeos são abundantes nas células do tecido cerebral, onde constituem aproximadamente 10% do total de fosfolipídios, embora seus níveis possam aumentar transitoriamente nos estágios iniciais de doenças cerebrais, sugerindo que os fosfoinositídeos podem neutralizar o desenvolvimento de patologias neurológicas1, como esclerose múltipla e doença de Alzheimer desencadeada pela desmielinização axonal causada pela atividade aberrante do PLA2s 15, 16,17. Essas enzimas pertencem a várias classes e grupos, incluindo a fosfolipase secretora A2 do grupo IIA (sPLA2)15. Níveis elevados desse grupo de enzimas são encontrados no líquido cefalorraquidiano de pacientes com esclerose múltipla e Alzheimer, onde contribuem para a quebra das membranas de mielina, levando à desmielinização15. Também foi relatado que o sPLA2s de venenos de serpentes inibe a transmissão em sinapses neuromusculares18,19, causando distúrbios do sistema nervoso central e afetando adversamente o sistema neuromuscular periférico20.

Neste estudo, investigamos se o IP e os fosfoinositídeos podem proteger as membranas fosfolipídicas modelo dos efeitos das enzimas sPLA2 expressas de forma aberrante. As membranas modelo foram feitas de fosfatidilcolina (PC), o fosfolipídio mais abundante em todas as membranas celulares de mamíferos21, enriquecidas com uma razão molar de 20% de PI, PI-4-P ou PI-4,5-P2. Para mimetizar os efeitos das enzimas sPLA2 expressas aberrantemente em membranas modelo, usamos a subunidade básica HDP-2P da enzima PLA2 neurotóxica do veneno de víbora secretora do grupo IIA22, cuja atividade hidrolítica foi previamente estudada em membranas de mielina modelo23.

Para este trabalho, desenvolvemos uma nova abordagem para investigar mudanças na permeabilidade das membranas lipossomais afetadas pelo HDP-2P. O novo método é baseado em uma reação de substituição de ligante em solução de CuSO4 fora dos lipossomas, envolvendo um ligante NH3 preso dentro dos lipossomas. Se a permeabilidade da membrana induzida por HDP-2P permitir o vazamento de NH3 dos lipossomas, a amônia liberada substituirá quantitativamente quatro moléculas de água em íons de cobre hidratados por meio da reação: [(H2O) 6] 2 + (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [(H2O) 2 (NH3) 4] 2 + (aq) + 4H2O (l). Essa troca de ligantes produz um aumento característico na densidade óptica da solução mensurável por espectrofotometria (λ = 600 nm), servindo como nossa leitura quantitativa para mudanças de permeabilidade da membrana. Nossa abordagem baseada em substituição de ligantes demonstra sensibilidade superior para avaliar a permeabilidade da membrana em comparação com técnicas convencionais como 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 e ensaios de transporte de íons29, oferecendo a vantagem adicional de não exigir instrumentação cara. Este método simples e econômico, aplicado em conjunto com medições de atividade hidrolítica de HDP-2P e a simulação in silico da ligação de PI, PI-4-P e PI-4,5-P2 à superfície molecular de HDP-2P, nos permitiu concluir que os fosfatos do anel inositol em PI abolem os efeitos disruptivos de HDP-2P em membranas de PC enriquecidas com PI-4-P ou PI-4, 5-P2. Se esse achado for confirmado em estudos posteriores, a capacidade dos fosfatos do anel de inositol no IP de proteger contra os efeitos nocivos das proteínas celulares de ação anormal, potencialmente contribuindo para a estabilidade da membrana em condições de doença envolvendo atividade proteica aberrante, pode abrir caminho para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos para o tratamento de distúrbios neurológicos, como a doença de Alzheimer e a esclerose múltipla.

Protocolo

1. Simulação in silico da interação HDP-2P com IP e fosfoinositídeos usando software de modelagem molecular

  1. Instalação e preparação do software
    1. Instale o editor de desenho químico referenciado para construir moléculas de ligante, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S1A.
    2. Instale o software de modelagem molecular para acoplamento molecular do ligante ao receptor.
    3. Instale as ferramentas de acoplamento automatizadas para preparação de ligantes e receptores.
    4. Como o software de simulação de modelagem molecular depende do ambiente Python, instale o Python.
  2. Preparação de ligantes
    1. Primeiro, use o editor de desenho químico para construir as coordenadas atômicas para estruturas moleculares de PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, cardiolipina e fosfatidilserina.
      NOTA: O protocolo de exemplo nas etapas a seguir da preparação do ligante descreve as etapas apenas para PI.
    2. Construa a estrutura molecular do PI usando o editor de desenho químico, conforme ilustrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S1B e salve o arquivo no formato PDB, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S2.
    3. Abra o arquivo PDB no software da ferramenta de encaixe automatizado, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S3A.
    4. Adicione átomos de hidrogênio conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S3B e selecione polar ou todos os átomos de hidrogênio conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S4A.
      NOTA: Após a conclusão do acoplamento PI com HDP-2P, selecione apenas átomos de hidrogênio polar para simplificar a visualização de ligações polares ou de hidrogênio.
    5. Defina a molécula PI como o ligante para o software da ferramenta de acoplamento automatizado, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S4B.
    6. Salve o ligante como um arquivo PDBQT, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S5A. Certifique-se de tornar todas as ligações rotativas.
  3. Preparação do receptor
    1. Baixe o arquivo PDB da fosfolipase A2 HDP-2 (código PDB 2I0U), composto por dois monômeros, um ácido, enzimaticamente inativo, A, e o outro é básico, enzimaticamente ativo, E. Para excluir o monômero A enzimaticamente inativo, importe o arquivo 2I0U para o software de modelagem molecular (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S5B), selecione todos os átomos do monômero A (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S6A) e, em seguida, vá para Editar e exclua todos os átomos do monômero A (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S6B). Mantenha o monômero E enzimaticamente ativo, que agora é designado como receptor.
    2. Abra o receptor HDP-2P PDB file no software da ferramenta de acoplamento automatizado, conforme mostrado em Supplemental File 1-Supplemental Figure S7.
    3. Remova todas as moléculas de água conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S8A.
    4. Adicione átomos de hidrogênio conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S8B. Observe que, após a conclusão do acoplamento HDP-2P com PI, apenas hidrogênios polares devem ser selecionados para simplificar a visualização de ligações polares e de hidrogênio.
    5. Defina o HDP-2P como o receptor, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S9A, e salve-o como um arquivo PDBQT. Certifique-se de que o receptor esteja ajustado sem ligações rotativas.
  4. Configuração do parâmetro de encaixe
    1. Abra os arquivos PDBQT do ligante e do receptor.
    2. Entre na interface de configuração da caixa de grade, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S9B, e defina o tamanho da caixa de grade (tamanho x = 44,644; tamanho y = 74,939; tamanho z = 43,050) e centro (centro x = 25,626; centro y = 9,582; centro z = 41,825), que envolvem totalmente toda a superfície da molécula receptora, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S10A.
    3. Feche a interface de configuração da caixa de grade com as configurações atuais, conforme mostrado em Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S10B e salve os parâmetros de encaixe em um arquivo config.txt, conforme mostrado em Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S11A.
  5. Executando o software de encaixe molecular
    1. Inicie o software de encaixe molecular usando o arquivo config.txt, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S11B.
    2. Execute o cálculo de encaixe (~30-90 min; Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S12).
    3. Verifique o arquivo docking_log.txt para revisar as pontuações de encaixe (afinidade de vinculação).
    4. Selecione o resultado do encaixe com a menor conformação de energia.
  6. Análise de dados de encaixe
    1. Use o software da ferramenta de encaixe automatizado para abrir o arquivo PDBQT do resultado do encaixe.
    2. Analise os locais de ligação ligante-receptor, concentrando-se no centro ativo do receptor e nas interações intermoleculares, incluindo interações iônicas, íon-polares, polares e de ligações de hidrogênio. Faça uma tabela para PI e fosfoinositídeo, que interage com o sítio ativo do receptor, para descrever as afinidades do sítio de ligação em kcal / mol, porções carregadas e polares na cabeça polar de PI / fosfoinositídeo e resíduos de HDP-2P envolvidos na ligação intermolecular e tipos de ligações conforme mostrado na Tabela 1 e na Tabela 2. Repita o encaixe para cada par receptor-ligante 3x para garantir que não haja desvio nos locais de ligação, afinidades de ligação, porções carregadas e polares de resíduos de PI/fosfoinositídeo e HDP-2P e o tipo de ligações.

2. Atividade hidrolítica de HDP-2P em lipossomas de PC enriquecidos com PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS ou CL monitorados usando a coenzima A acilada com ácidos graxos livres

NOTA: Clorofórmio, metanol, NH3 e CuSO4 são perigosos. Sempre use luvas, óculos de proteção e jaleco de nitrilo. Manuseie todos os protocolos com esses reagentes sob a hotte. Armazene o clorofórmio em um frasco de vidro âmbar. Armazene o metanol em armários inflamáveis, longe de oxidantes. Mantenha o metanol longe de chamas e faíscas. Rotule todos os recipientes de resíduos para esses reagentes e descarte de acordo com os regulamentos locais de descarte de resíduos perigosos.

  1. Prepare 100 mL de solução tampão para a hidrólise de fosfolipídios catalisada por HDP-2P dissolvendo 5,55 mg de CaCl2 em tampão Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).
  2. Prepare 50 mL de solução estoque de EDTA 1,0 M dissolvendo 7,31 g de EDTA em água destilada deionizada (ddH20).
  3. Preparar a solução-mãe HDP-2P 0,54 mM em tampão Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4). A massa molar do HDP-2P é de 13,827 kDa.
  4. Preparar as seguintes soluções-mãe de fosfolípidos na concentração de 10,0 M em mistura de clorofórmio/metanol (2 a 1 em volume): L-α-fosfatidilcolina (PC) de gema de ovo, cardiolipina de coração bovino (CL), L-α-fosfatidil-L-serina (PS), PI, PI-4-P e PI-4,5-P2 de cérebro bovino. As massas molares de PC, CL, PS, PI, PI-4-P e PI-4,5-P2 são 768 Da, 1.466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da e 1.057 Da, respectivamente, conforme descrito abaixo.
  5. Preparar cinco amostras de lipossomas PC. Para preparar uma amostra de lipossomas de PC, adicionar 75 μl de solução-mãe de clorofórmio/metanol de PC a um tubo de ensaio de vidro e secar os lípidos a 25 °C sob vácuo de 10 Pa durante 1 h até formar uma película lipídica. Hidratar a película lipídica durante 1 h com 15 ml de solução tampão para hidrólise de fosfolipídios a 25 °C num termóstato. Em seguida, insira a pistola de titânio de um dispensador ultrassônico de 100-150 W na suspensão lipídica no tubo de ensaio de vidro colocado em banho de gelo e sonice a suspensão na frequência de 22 kHz por 10 min, não excedendo 50% da potência máxima. Para remover partículas de "poeira" de titânio, centrifugue os lipossomas a 200 × g (1.270 rpm com um rotor de 10 cm) por 10 min em temperatura ambiente.
  6. Prepare amostras de lipossomas PC enriquecidos com CL, PS, PI, PI-4-P ou PI-4,5-P2 no PC e outra proporção molar lipídica 4 para 1 misturando soluções estoque de clorofórmio / metanolfosfolipídio - 60 μL de PC com 15 μL de CL, PS, PI, PI-4-P ou PI-4,5-P2 em um tubo de vidro. Em seguida, secar os lípidos num vácuo de 10 Pa ou durante 3 h à temperatura ambiente, hidratar a película lipídica em solução tampão para a hidrólise dos fosfolipídios e sonicar com ondas ultrassónicas como acima descrito.
    NOTA: Para cada tipo de lipossomas, prepare cinco amostras.
  7. Coloque 1,0 mL de cinco amostras de cada tipo de lipossomas descritos acima em tubos separados e adicione 10 μL de solução incolor de coenzima A do kit NEFA a cada tubo e, em seguida, adicione 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 ou 3,72 μL de solução estoque de HDP-2P 0,54 mM aos tubos separados para obter em amostras de lipossomas as razões molares HDP-2P / fosfolipídio de 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 e 0,004, respectivamente.
  8. Imediatamente após a adição de HDP-2P aos lipossomas, incubar amostras de lipossomas por 15 min a 37 ° C em um termostato e, em seguida, interromper a hidrólise de fosfolipídios induzida por HDP-2P adicionando 100 μL de solução de estoque de EDTA. Depois disso, vórtice as amostras por 1 min.
  9. Quantificar a atividade hidrolítica do HDP-2P medindo a densidade óptica de amostras lipossomais a 550 nm usando um espectrofotômetro, que mediria até que ponto a solução incolor de coenzima A fica roxa quando é acilada com ácidos graxos livres.
  10. Repetir o procedimento acima duas vezes para que os valores médios da densidade óptica sejam obtidos a partir de três ensaios independentes.
    NOTA: Cada ponto de dados obtido neste ensaio experimental é o valor médio da densidade óptica. Idealmente, o desvio padrão dos pontos de dados experimentais deve estar dentro de ±5% da média.

3. Efeitos do HDP-2P na permeabilidade de membranas lipossomais de PC enriquecidas com PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS ou CL medidos por uma reação de substituição de ligante em solução de CuSO4 envolvendo um ligante NH3 preso dentro dos lipossomas

NOTA: Clorofórmio, metanol, NH3 e CuSO4 são perigosos. Sempre use luvas, óculos de proteção e jaleco de nitrilo. Manuseie todos os protocolos com esses reagentes sob a hotte. Armazene o clorofórmio em um frasco de vidro âmbar. Armazene o metanol em armários inflamáveis, longe de oxidantes. Mantenha o metanol longe de chamas ou faíscas. Rotule todos os recipientes de resíduos para esses reagentes e descarte de acordo com os regulamentos locais de descarte de resíduos perigosos.

  1. Preparar 20 ml de soluções-mãe 0,03 M para cada um dos seis fosfolípidos - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- em clorofórmio/metanol (2 a 1 volume). As massas moleculares de PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 são 768, 1466, 792, 867, 962 e 1057 Da, respectivamente.
  2. Prepare 100 mL de tampão Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4) com uma concentração final de 0,05 M CuSO4.
  3. Prepare 4 mL de estoque de HDP-2P 1,5 × 10-3 M em tampão CuSO4 0,05 M, Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4). A massa molar do HDP-2P é de 13,827 kDa.
  4. Para preparar 100 mL de solução de NH3 a 0,5 M, use solução de NH3 a 25% (densidade 905 g/L30, igual a 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Assim, para preparar 100 mL de NH3 0,5 M, use 3,76 mL de solução de NH3 a 25%: (0,5 M × 1.000 mL ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 mL de solução de NH3 a 25%. Colocar 3,76 ml de solução de NH3 a 25% num balão volumétrico de 100 ml e elevar o volume a 100 ml com tampão Tris-HCl (pH 7,4) a 0,10 M.
  5. Para preparar lipossomas com NH3 no volume interno dos lipossomas, colocar 12,5 ml de solução de fosfolipídio 0,03 M em clorofórmio/metanol num tubo e fosfolipídios secos em vácuo de 10 Pa ou durante 3 h à temperatura ambiente. Hidratar a película fosfolipídica durante 1 h com 12,5 ml de 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) a 25 °C num termóstato; em seguida, sonicar a suspensão lipídica na frequência de 22 kHz, conforme descrito na etapa 2.5, para produzir lipossomas sonicados.
    NOTA: Na solução com lipossomas sonicados, o NH3 está localizado dentro e fora dos lipossomas.
  6. Para eliminar o NH3 fora dos lipossomas, dialisar os lipossomas usando uma membrana de diálise (corte molecular 1,0 kDa) para temperatura ambiente de 5 chapéus contra 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) usando um agitador magnético.
    NOTA: A diálise por 5 h foi suficiente para remover completamente o NH3, pois a adição de 0,5 mL de lipossomas dialisados a 0,5 mL de tampão Tris-HCl 0,10 M, CuSO4 0,05 M produziu a mesma densidade óptica a 600 nm que a dos lipossomas preparados sem NH3 e misturados com o mesmo tampão.
  7. Após a diálise, centrifugue os lipossomas a 200 × g durante 90 min, conforme descrito no passo 2.5, para sedimentar os lipossomas. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os lipossomas com 5,0 mL de tampão Tris-HCl 0,10 M, CuSO4 0,05 M (pH 7,4) e divida os lipossomas ressuspensos em cinco amostras de 1,0 mL cada. Adicione a essas cinco amostras de 1,0 mL separadamente 60, 40, 20 e 0 μL de tampão Tris-HCl 0,10 M, CuSO4 0,05 M (pH 7,4) e, em seguida, 0, 20, 40, 60, 80 μL de tampão estoque HDP-2P para ajustar nas amostras de lipossomas as razões molares HDP-2P / fosfolipídio 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 e 0,004, respectivamente.
  8. Incubar as amostras de lipossomas durante 30 minutos num termóstato a 37 °C; Em seguida, medir a densidade óptica das amostras de lipossomas a 600 nm com um espectrofotómetro. Siga as etapas descritas na seção 3 para todas as seis amostras de lipossomas e repita 3x para garantir leituras triplicadas de densidade óptica para cada ponto de dados.
    NOTA: O desvio padrão dos pontos de dados experimentais deve estar sempre dentro de ±5% da média.

Resultados

Simulação de modelagem molecular da interação de HDP-2P com IP e fosfoinositídeos
O programa de modelagem molecular calcula os nove melhores locais de ligação na superfície molecular de um receptor (molécula maior), que é alvo de um ligante (molécula menor). Esses locais são determinados pela liberação das nove entalpias mais altas, que designam os locais com as melhores afinidades de ligação. As afinidades de ligação são expressas como valores negativos, indicando que a ligação intermolecular é um processo exotérmico. No caso de HDP-2P interagindo com PI, a simulação previu quatro locais de ligação (# 3, # 6, # 7 e # 8) para PI na superfície molecular de HDP-2P dentro do centro ativo (Tabela 1). Além disso, os cinco locais de ligação para PI foram encontrados fora do centro ativo de HDP-2P. As notações das porções carregadas e polares na cabeça polar de PI são ilustradas na Figura 1.

O centro ativo do HDP-2P consiste em cinco resíduos de aminoácidos principais: Gly30, Gly32, His48, Asp49 e Lys69, que facilitam o alinhamento adequado do substrato fosfolipídico no centro ativo para garantir a hidrólise catalítica. Algumas estruturas acopladas representativas mostram a ligação de PI a alguns resíduos de aminoácidos do centro ativo, enquanto no sítio de ligação # 6, PI se envolve com todos os cinco principais resíduos de aminoácidos do centro ativo por meio de ligações iônicas, iônicas e hidrogênio (Tabela 1). A Figura 2 ilustra como o PI interage com todos os cinco principais resíduos de aminoácidos no centro ativo do HDP-2P no local de ligação # 6.

A simulação de acoplamento da interação entre HDP-2P e PI-4-P, que contém um grupo fosfato na posição 4 do anel de inositol, previu apenas o local de ligação # 1 como o local onde o PI-4-P se liga ao centro ativo do HDP-2P. Especificamente, neste local, o PI-4-P interage com três resíduos de aminoácidos principais do centro ativo - Gly30, Gly32 e Lys69 - por meio de ligações iônicas, iônicas e de hidrogênio (Tabela 2). A Figura 3 ilustra a interação do PI-4-P com o centro ativo do HDP-2P. Nos oito locais de ligação restantes na superfície molecular do HDP-2P, o PI-4-P se liga a locais fora do centro ativo.

As simulações de docking molecular das interações HDP-2P com PI-4,5-P₂ (contendo grupos fosfato nas posições 4 e 5 do anel inositol) não revelaram nenhuma ligação ao centro ativo da enzima em todos os nove locais de ligação previstos. Em vez disso, o PI-4,5-P₂ liga-se consistentemente a uma cavidade semelhante a um sulco adjacente ao centro ativo (Figura 4), formando ligações iônicas polares e de hidrogênio com os três resíduos HDP-2P, Trp31, Gly33 e Gln34).

Embora a ligação de PI-4,5-P₂ a uma cavidade em forma de sulco perto do centro ativo do PLA2s celular ou veneno não tenha sido documentada anteriormente, características estruturalmente análogas estão bem estabelecidas nos domínios de homologia pleckstrin31 (PH) e homologia N-terminal de epsina32 (ENTH). Esses domínios de sinalização utilizam arquiteturas de sulco hidrofóbico-polar-catiônico semelhantes para reconhecimento específico de PI-4,5-P2 31,32, apesar de sua natureza não enzimática. A presença de um motivo estrutural comparável no HDP-2P levanta possibilidades intrigantes de mimetismo evolutivo ou evolução convergente para facilitar o reconhecimento do domínio da membrana pelo HDP-2P. Se verificado por outros métodos, este estudo pode representar o primeiro caso relatado de um veneno PLA2 utilizando tal mecanismo para reconhecimento de fosfoinositídeos.

Curiosamente, simulações de docking molecular de CL e PS interagindo com HDP-2P previram a ligação de ambos os fosfolipídios ao centro ativo de HDP-2P em oito dos nove locais de ligação, enquanto o único local de ligação de CL e PS exterior ao centro ativo não estava localizado na cavidade em forma de sulco (dados não mostrados). Também é importante notar que, como PI, o PC se liga ao centro ativo do HDP-2P em quatro dos nove locais de ligação, e tanto o PI quanto o PC, como CL e PS, não se ligam à cavidade em forma de ranhura (dados não mostrados). Esses achados sugerem que os grupos fosfato no anel de inositol do IP têm uma alta afinidade de ligação com a cavidade em forma de sulco localizada adjacente ao centro ativo. Análises estruturais identificaram cavidades análogas em forma de sulco com manchas de superfície hidrofóbica-polar-catiônica perto do centro catalítico nas enzimas PLA 2 celulares33 e veneno34. A ligação de fosfoinositídeos a essas cavidades pode induzir alterações conformacionais fisiologicamente significativas, potencialmente inibindo a atividade enzimática. Notavelmente, entre os fosfoinositídeos, PI-4,5-P2 demonstra características de substrato particularmente pobres - as isoformas humanas de PLA2 (tipos citosólicos, independentes de cálcio e secretados) mostram atividade hidrolítica mínima a indetectável em relação a PI-4,5-P235. Isso sugere que a ligação do fosfoinositídeo a essas características estruturais conservadas pode servir a uma função fisiológica distinta (por exemplo, inibição alostérica) em vez de funções catalíticas em toda a superfamília PLA2, o que requer verificação experimental futura.

Atividade hidrolítica de HDP-2P em lipossomas PC enriquecidos com PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS ou CL monitorados usando coenzima A acilada com ácidos graxos livres
A atividade hidrolítica de HDP-2P em amostras lipossomais foi avaliada usando solução de coenzima A. A solução de coenzima A é incolor, mas torna-se roxa após a acilação por ácidos graxos livres liberados durante a hidrólise de fosfolipídios catalisada por HDP-2P. O aumento resultante na densidade óptica, correspondente à extensão da acilação da coenzima A, foi medido espectrofotometricamente a 550 nm. Portanto, o aumento da densidade óptica em amostras lipossomais tratadas com coenzima A e HDP-2P é diretamente proporcional à atividade hidrolítica da HDP-2P.

A Figura 5 apresenta as curvas de atividade hidrolítica em função da razão molar HDP-2P/fosfolipídio em várias amostras lipossomais. A atividade hidrolítica do HDP-2P é expressa em unidades arbitrárias (u.a.) de densidade óptica (OD) medida a 550 nm. Não construímos uma curva de calibração para relacionar os valores de u.a. com as concentrações molares de ácidos graxos livres, pois nossos ensaios experimentais mostraram que os ácidos graxos em solventes orgânicos, quando adicionados a soluções aquosas contendo coenzima A e acil-coenzima A sintetase, não produziram alteração detectável de DO a 550 nm. Isso indica que esses ácidos graxos formam micelas em vez de se ligarem à coenzima A. Em contraste, apenas os ácidos graxos gerados pela membrana (produzidos pela atividade do PLA2 ) se ligam à coenzima A associada à membrana, resultando em uma alteração mensurável do OD. A natureza anfipática da coenzima A - tendo regiões hidrofóbicas e hidrofílicas em sua superfície molecular - localiza-a preferencialmente na interface membrana-água, o que facilita a ligação dos ácidos graxos produzidos pela atividade do PLA2 à coenzima A. No entanto, nessas condições de ensaio, não é possível determinar a concentração molar de ácidos graxos. Por esse motivo, os pesquisadores que usam o ensaio de coenzima A expressam a atividade hidrolítica do PLA2 em unidades arbitrárias de OD medidas a 550 nm20.

O maior aumento na densidade óptica, correspondente à maior atividade hidrolítica da HDP-2P, foi observado nos lipossomas PC enriquecidos com CL ou PS. Esse achado se alinha bem com o maior número de locais de ligação para CL e PS no centro ativo de HDP-2P. A atividade hidrolítica de HDP-2P em lipossomas PC enriquecidos com PI foi 3,0 e 2,5 vezes menor do que em lipossomas enriquecidos com CL ou PS, respectivamente, mas maior do que em lipossomas PC puros. Isso sugere que a afinidade de ligação ao centro ativo de HDP-2P de PI é maior do que a de PC, apesar de ambos os lipídios terem o mesmo número de locais de ligação no centro ativo.

Essa aparente discrepância pode ser explicada por diferenças estruturais nos grupos de cabeça polar de PI e PC. Enquanto o PC é uma molécula neutra, seu grupo trimetilamônio catiônico se estende para fora na solução, enquanto seu grupo fosfato aniônico está posicionado mais próximo da área hidrofóbica da membrana. Essa distribuição de carga no grupo principal de PC pode criar uma repulsão eletrostática contra o HDP-2P básico, reduzindo sua afinidade de ligação. Em contraste, a natureza ácida do PI o torna uma espécie lipídica mais atraente para interação com o HDP-2P básico, o que poderia explicar sua maior atividade hidrolítica em comparação com os lipossomas PC puros.

A atividade hidrolítica de HDP-2P em lipossomas PC enriquecidos com PI-4-P, conforme mostrado na Figura 5, sugere hidrólise catalítica mínima de fosfolipídios. Notavelmente, a curva de densidade óptica obtida a partir de lipossomas PC enriquecidos com PI-4,5-P indica uma abolição completa da atividade hidrolítica por HDP-2P nesta amostra de lipossomas. Esses achados se alinham bem com as simulações de encaixe, que preveem um local de ligação para PI-4-P no centro ativo de HDP-2P, enquanto PI-4,5-P2 não mostra nenhuma afinidade de ligação com o centro ativo. Isso sugere que os grupos fosfato ligados ao anel inositol impedem a ligação do fosfolipídio ao centro ativo do HDP-2P. Propomos que os grupos fosfato no anel de inositol se estendam para fora da solução e, ligando-se ao HDP-2P por meio de interações intermoleculares iônicas e íon-polares, eles mantêm o HDP-2P à distância da superfície da membrana, protegendo assim a membrana da atividade hidrolítica do HDP-2P. Isso é consistente com descobertas recentes que revelam que as enzimas PLA2 citosólicas, independentes de cálcio e secretadas humanas mostraram atividade hidrolítica quase indetectável ou nenhuma atividade hidrolítica em direção aos substratos PI-4-P e PI-4,5-P2 35.

Alterações de permeabilidade induzidas por HDP-2P em membranas lipossomais de PC enriquecidas com PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS ou CL: Avaliação via reação de substituição de ligantes em solução de CuSO4 com NH₃ encapsulado

O impacto da atividade hidrolítica de HDP-2P na permeabilidade da membrana de lipossomas PC enriquecidos com PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS ou CL foi investigado usando uma reação de substituição de ligante em um sistema iônico complexo, onde o ligante substituto foi encapsulado dentro do volume interno dos lipossomas. Este método simples e confiável é baseado no deslocamento de quatro moléculas de água atuando como ligantes no íon complexo [(H2O)6]2+ por NH3

[(H2O) 6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Durante o processo de substituição de moléculas de água por NH3 no íon complexo [(H2O)6]2+, a cor azul pálida de [(H2O)6]2+ faz a transição para a cor azul escura de [(H2O)2(NH3)4]2+. Em um sistema onde o NH3 é encapsulado no volume interno dos lipossomas e [(H2O) 6] 2 + está presente na solução externa, essa mudança de cor - monitorada espectrofotometricamente - indica um aumento na permeabilidade da membrana lipossomal ao NH3.

Para estabelecer tal sistema, sonicamos uma dispersão de fosfolipídios em tampão Tris-HCl contendo NH3, formando lipossomas sonicados com NH₃ dentro e fora dos lipossomas. O NH3 externo foi removido por diálise, após o que a solução de CuSO4 foi adicionada à amostra de lipossomas contendo NH3 em seu volume interno. Em seguida, tratamos os lipossomas com HDP-2P e monitoramos as alterações na densidade óptica espectrofotometricamente.

Para determinar o comprimento de onda ideal para medir as mudanças na densidade óptica, registramos os espectros de absorbância de [(H2O) 2 (NH3) 4] 2 + em uma solução de CuSO4 de 0,025 M, NH3 de 0,100 M e [(H2O) 6] 2 + em uma solução de CuSO4 de 0,025 M, usando luz visível na faixa de 500 nm a 900 nm. Conforme mostrado na Figura 6, a irradiação a 600 nm produziu absorbância máxima para [(H2O) 2 (NH3) 4] 2 + e absorbância mínima para [(H2O) 6] 2 +, levando-nos a selecionar 600 nm como o comprimento de onda ideal para nossos experimentos de permeabilidade à membrana.

A Figura 7 mostra que a permeabilidade da membrana ao NH₃ é maior em lipossomas PC enriquecidos com CL aniônico e PS. Esta observação é consistente com nossos dados relatados anteriormente, mostrando que o HDP-2P, um grupo IIA PLA2, interage eficientemente com o fosfolipídio aniônico palmitoiloleoil-glicerofosfoglicerol, levando à hidrólise do substrato - um efeito não observado com o fosfolipídio neutro palmitoiloleoilglicerofosfocolina36. Em geral, a maioria das enzimas PLA2 do grupo IIA exibe atividade hidrolítica significativamente maior em relação aos fosfolipídios aniônicos 33,37,38. A permeabilidade dos lipossomas PC+PI é menor do que a dos lipossomas PC+CL e PC+PS, mas permanece maior do que a dos lipossomas PC puros. Esses achados se alinham bem com os resultados das simulações de acoplamento e ensaios de atividade hidrolítica HDP-2P. Em outras palavras, espera-se que as amostras lipossomais que apresentam baixa permeabilidade sejam estruturalmente estáveis devido à incapacidade do HDP-2P de hidrolisar fosfolipídios e devido a uma menor afinidade do HDP-2 em se ligar ao IP e aos fosfoinositídeos, conforme previsto pelos dados de docking molecular (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Portanto, a atividade hidrolítica da enzima por HDP-2P (Figura 5) e a permeabilidade da membrana, conforme mostrado na Figura 7, devem ser positivamente correlacionadas.

No entanto, nos lipossomas PC+PI-4-P e PC+PI-4,5-P2 , a permeabilidade não aumentou após o tratamento com HDP-2P. Embora os resultados de permeabilidade em lipossomas PC+PI-4,5-P2 se correlacionem bem com simulações de docking e dados de atividade hidrolítica HDP-2P para os mesmos lipossomas, a ausência de permeabilidade aumentada em lipossomas PC+PI-4-P não se alinha totalmente com os resultados da atividade hidrolítica, pois um pequeno grau de atividade hidrolítica foi registrado nesses lipossomas. Esses achados sugerem que um ligeiro aumento localizado na atividade hidrolítica em lipossomas PC + PI-4-P não perturba o empacotamento de fosfolipídios em bicamada a um grau que alteraria a permeabilidade da membrana ao NH3.

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Figura 1: Notações de porções carregadas e polares da cabeça polar do fosfatidilinositol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Interação do PI com o centro ativo de HDP-2P previsto para o local de ligação #6 pelo software de docking molecular. PI é dado na representação do bastão e HDP-2P é dado em representações de linha (diagrama à esquerda) e superfície molecular (diagrama à direita). Para as representações em bastão, esmeralda representa carbono, laranja é fósforo, vermelho é oxigênio e branco é hidrogênio. Para a superfície molecular e as linhas, o verde representa o carbono, o azul é o nitrogênio, o vermelho é o oxigênio, o branco é o hidrogênio e o amarelo é o enxofre. Linhas tracejadas amarelas identificam ligações intermoleculares. As setas apontam para resíduos de aminoácidos no centro ativo. Abreviaturas: PI = Fosfatidilinositol; HDP-2P = subunidade básica da fosfolipase do veneno da víbora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Interação de PI-4-P com o centro ativo de HDP-2P previsto para o local de ligação # 1 por software de acoplamento molecular. PI-4-P é dado em representação de bastão e HDP-2P é dado em representações de linhas (diagrama à esquerda) e superfície molecular (diagrama à direita). Para os bastões, a esmeralda representa o carbono, o laranja é o fósforo, o vermelho é o oxigênio e o branco é o hidrogênio. Para superfície molecular e linhas, verde representa carbono, azul é nitrogênio, vermelho é oxigênio, branco é hidrogênio e amarelo é enxofre. Linhas tracejadas amarelas identificam ligações intermoleculares. As setas apontam para resíduos de aminoácidos no centro ativo. Abreviaturas: PI-4-P = Fosfatidilinositol-4-fosfato; HDP-2P = subunidade básica da fosfolipase do veneno da víbora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Interação de PI-4,5-P2 com a superfície molecular de HDP-2P prevista para o local de ligação # 6 por software de docking molecular. O PI-4,5-P2 se liga a uma caverna em forma de sulco localizada abaixo do centro ativo do HDP-2P. Os cinco principais resíduos de aminoácidos no centro ativo são dados na notação de três letras. PI-4,5-P2 é dado em representação de bastão e HDP-2P é dado em representações de linha (diagrama à esquerda) e superfície molecular (diagrama à direita). Para os bastões, a esmeralda representa o carbono, o laranja é o fósforo, o vermelho é o oxigênio e o branco é o hidrogênio. Para superfície molecular e linhas, verde representa carbono, azul é nitrogênio, vermelho é oxigênio, branco é hidrogênio e amarelo é enxofre. Abreviaturas: PI-4,5-P2 = Fosfatidilinositol-4,5-difosfato; HDP-2P = subunidade básica da fosfolipase do veneno da víbora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Curvas de atividade hidrolítica de amostras de lipossomas em várias razões molares HDP-2P / fosfolipídios. Lipossomas feitos de PC+CL (verde escuro), PC+PS (laranja), PC+PI (azul escuro), PC+PI-4-P (azul), PC+PI-4,5-P2 (verde) e PC (roxo). Os valores de densidade óptica em unidades arbitrárias representam as médias de leituras triplicadas a 550 nm. As barras de erro indicam o DP das leituras triplicadas. A significância estatística das diferenças nos valores de densidade óptica entre as amostras de lipossomas foi avaliada por meio de ANOVA, com todos os valores de p bem abaixo de 0,05. Abreviaturas: PC = fosfatidilcolina; CL = cardiolipina de coração bovino ; PS = fosfatidilserina; IP = Fosfatidilinositol; PI-4-P = Fosfatidilinositol-4-fosfato; PI-4,5-P2 = Fosfatidilinositol-4,5-difosfato; u.a. = unidades arbitrárias; HDP-2P = subunidade básica da fosfolipase do veneno da víbora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Espectros de absorbância de soluções aquosas de complexos de cobre. Complexos de cobre [(H2O)6]2+ (linha laranja) e [(H2O)2(NH3)4]2+ (linha azul), irradiados por luz visível na faixa de 500 nm a 900 nm. O complexo de cobre [(H2O)6]2+ foi feito em uma solução de 0,025 M CuSO4 e o complexo de cobre [(H2O)2(NH3)4]2+ foi feito em uma solução de 0,025 M CuSO4 contendo 0,100 M NH3. Os valores de absorbância nesta figura para cada ponto de dados são as médias das leituras de absorbância feitas em triplicado. As barras de erro representam o SD das leituras triplicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Curvas de permeabilidade da membrana de amostras de lipossomas. Lipossomas feitos de PC+CL (roxo), PC+PS (azul), PC+PI (azul escuro), PC+PI-4-P (verde escuro), PC+PI-4,5-P2 (laranja) e PC (verde) em várias razões molares HDP-2P/fosfolipídios. Os valores de permeabilidade da membrana são expressos como valores de densidade óptica em unidades arbitrárias (u.a.) medidas a 600 nm. Cada ponto de dados representa a média das leituras triplicadas. As barras de erro indicam o DP das leituras triplicadas. A significância estatística das diferenças nos valores de densidade óptica entre as amostras de lipossomas foi avaliada por meio de ANOVA, com todos os valores de p bem abaixo de 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Energias de ligação de afinidade previstas para complexos moleculares candidatos de HDP-2P com PI. Simulações de modelagem molecular foram usadas para prever os tipos de ligações e afinidades de locais de ligação, bem como as porções carregadas e polares do grupo principal de fosfatidilinositol e dos resíduos de aminoácidos HDP2P que participam de suas interações intermoleculares. Os grupos carregado e polar do fosfatidilinositol são destacados na Figura 1. Observe que Pb em NHpbδ+ denota uma ligação peptídica. Abreviaturas: PI = Fosfatidilinositol; HDP-2P = subunidade básica da fosfolipase do veneno da víbora. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Energias de ligação de afinidade previstas para complexos moleculares candidatos de HDP-2P com PI-4-P. Simulações de modelagem molecular foram usadas para prever os tipos de ligações e afinidades de locais de ligação, bem como as porções carregadas e polares do grupo principal de fosfatidil-inositol-4-fosfato (PI-4-P) e dos resíduos de aminoácidos HDP2P que participam de suas interações intermoleculares. Observe que Pb em NHpbδ+ denota uma ligação peptídica. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Fluxo de trabalho de encaixe molecular. Visão geral do procedimento de docking molecular usando o AutoDock, incluindo construção de ligantes, preparação de receptores, configuração de caixa de grade e execução de simulações de docking para prever interações PI-HDP-2P. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, investigamos se os grupos fosfato ligados covalentemente ao anel inositol no fosfatidilinositol (PI) podem prevenir a degradação das membranas fosfolipídicas pela enzima fosfolipase A2 (PLA2). Para avaliar a progressão da degradação da membrana fosfolipídica causada pela atividade hidrolítica do PLA2, projetamos um método simples, mas altamente sensível e preciso, para medir as mudanças na permeabilidade da membrana, que deve aumentar à medida que a degradação estrutural progride.

O método é baseado em uma reação de substituição de ligantes envolvendo o complexo hexaaquacobre (II), [(H2O) 6] 2 +, suspenso no ambiente aquoso fora dos lipossomas fosfolipídicos, enquanto a amônia (NH3) é encapsulada dentro dos lipossomas. A amônia tem uma afinidade maior pelo2+ do que pelas moléculas de água, mas o NH3 deve permear a membrana lipossomal para acessar a fase aquosa externa, onde substitui as moléculas de H2O em [(H2O)6]2+. Se a integridade estrutural da membrana lipossomal for comprometida devido à hidrólise de fosfolipídios catalisada por PLA2, o aumento da permeabilidade da membrana ao NH3 facilitará a substituição do ligante, levando a uma mudança de cor do azul pálido de [(H2O)6]2+ para o azul escuro de [(H2O)2(NH3)4]2+. Monitoramos essa transformação quantitativamente empregando espectrofotometria para registrar a mudança na densidade óptica em 600 nm.

Anteriormente, usamos 1H-NMR com ferrocianeto de íons paramagnéticos, [Fe(CN)6]3-, para estudar mudanças na permeabilidade da membrana afetadas por HDP-2P24 e por cardiotoxinas de veneno de cobra 24,25,26,27,28,39. Também usamos uma variedade de sondas fluorescentes e fosforescentes para estudar os efeitos das cardiotoxinas do veneno de cobra na permeabilidade das membranas lipossomais 20,23,40. No entanto, ferrocianeto e sondas fluorescentes/fosforescentes são grandes entidades moleculares não fisiológicas que penetram nas membranas lipídicas quando a integridade da membrana é significativamente danificada. Em contraste, nosso novo ensaio de substituição de ligantes utiliza NH₃ - um pequeno metabólito celular natural capaz de permear as membranas lipídicas em perturbações sutis de empacotamento lipídico. Essa sensibilidade aprimorada de nosso novo método de permeabilidade à membrana é evidenciada por sua capacidade de detectar alterações na permeabilidade da membrana a uma razão molar HDP-2P / lipídio de 0,001, em comparação com 0,004 necessária para a detecção de ¹ H-NMR / ferrocianeto23.

No mesmo estudo, usamos a extinção da fosforescência da eritrosina por ferroceno para examinar os efeitos da HDP-2P na troca lipídica intermembrana, avaliada pela mudança na razão entre o tempo de vida da eritrosina nas amostras de teste (τn) e na amostra controle (τ0)23. Em uma razão molar HDP-2P / lipídio de 0,004, o valor τn / τ0 diminuiu para 0,423, indicando um estado de fluidez da membrana permeável a cátions divalentes24. Assim, nosso ensaio de substituição de ligantes baseado em NH₃ detecta a permeabilidade da membrana em uma razão molar HDP-2P/lipídio de 0,001, enquanto os ensaios convencionais (1H-NMR/ferrocianeto e extinção da sonda de fosforescência) detectam a permeabilidade da membrana apenas em uma razão molar de 0,004. Isso demonstra que nosso ensaio baseado em NH3 é quatro vezes mais sensível do que os ensaios convencionais.

A sensibilidade excepcional de nosso ensaio baseado em NH3 produziu dados de permeabilidade que se correlacionaram intimamente com as medições de atividade hidrolítica, com apenas uma discrepância aparente: os lipossomas PC + PI-4-P mostraram hidrólise insignificante sem alterações de permeabilidade, sugerindo que a produção local mínima de lisofosfolipídios / ácidos graxos não afeta o empacotamento lipídico global, o que não influencia a integridade estrutural e a permeabilidade da membrana. Assim, este estudo demonstrou que a reação de substituição do ligante em um sistema iônico complexo, envolvendo um ligante encapsulado no volume interno dos lipossomas, produziu resultados que se alinharam excelentemente com os dados de atividade hidrolítica do HDP-2P. Esses achados, por sua vez, estavam em forte concordância com estudos in-silico sobre a ligação de PI e fosfoinositídeos à superfície molecular de HDP-2P.

No geral, a simulação do AutoDock no presente estudo revelou que o PI se liga ao centro ativo em quatro dos nove locais de ligação identificados, enquanto o PI-4-P se liga ao centro ativo em apenas um dos nove locais previstos. A atividade hidrolítica de HDP-2P em lipossomas PC+PI-4-P foi aproximadamente 5x menor do que em lipossomas PC+PI. Além disso, estudos in-silico não previram nenhuma ligação de PI-4,5-P2 ao centro ativo de HDP-2P. Consistentemente, os ensaios de atividade de PLA2 e os experimentos de reação de substituição de ligantes mostraram que o PI-4,5-P2 inibiu completamente a hidrólise de fosfolipídios e o aumento da permeabilidade da membrana, enquanto o PI-4-P mostrou menos atividade hidrolítica não significativa e evitou totalmente as alterações de permeabilidade da membrana. Essas observações estão em boa concordância com estudos de atividade in vitro de enzimas PLA2 citosólicas, independentes de cálcio e secretadas humanas em direção a PI, PI-4-P e PI-4,5-P235. Esses estudos mostraram que apenas o PLA2 citosólico do Grupo IVA exibiu atividade catalítica relativamente alta em relação a PI e PI-4-P, enquanto sua atividade em direção a PI-4,5-P2 foi quase indetectável. Todas as outras enzimas PLA2 testadas não mostraram atividade em relação a PI-4,5-P235. Essa falta de atividade tem sido atribuída aos grupos fosfato altamente hidrofílicos no anel de inositol, que interferem nas interações produtivas entre a superfície da membrana e as enzimas PLA2 35. Sugerimos que a extensão externa dos grupos fosfato no anel de inositol para dentro da solução e sua capacidade de formar ligações iônicas polares e de hidrogênio com resíduos da cavidade em forma de sulco do HDP-2P provavelmente impede que o HDP-2P se aproxime da superfície da membrana o suficiente para exercer sua atividade hidrolítica, estabilizando assim a membrana e reduzindo a degradação das membranas fosfolipídicas pelo HDP-2P, que pode ser prejudicial para as células ao ativar as vias de morte celular. Esse mecanismo parece estar alinhado com o potencial papel protetor dos fosfoinositídeos em condições de doença envolvendo atividade enzimática aberrante.

A forte correlação entre os resultados obtidos em ensaios de permeabilidade de membrana, medições de atividade hidrolítica e estudos de docking molecular in silico destaca a confiabilidade do método de reação de substituição de ligantes. Essa abordagem, utilizando um ligante encapsulado em lipossomas, prova ser uma ferramenta precisa e eficaz para avaliar as alterações de permeabilidade da membrana causadas por perturbações estruturais na organização estável da bicamada de fosfolipídios. Embora reconheçamos que os estudos de docking molecular usando o AutoDock apresentados neste artigo não fornecem uma compreensão completa de como os fosfolipídios podem interagir com o HDP-2P de maneira dinâmica e longitudinal, estudos de dinâmica molecular precisam ser realizados no futuro para identificar mecanismos moleculares adicionais de como o HDP-2 pode permeabilizar bicamadas fosfolipídicas compostas por vários fosfolipídios. É importante observar que a realização de estudos de dinâmica molecular requer altos recursos computacionais, como computadores e clusters de alto desempenho, que não estão disponíveis em muitas instituições acadêmicas que possuem recursos e financiamento de pesquisa limitados. Finalmente, reconhecemos o uso de um receptor rígido (HDP-2P) no presente artigo de técnicas e a falta de um ambiente de solvente / membrana. No entanto, queremos enfatizar que a realização de dockings moleculares de HDP-2P com vários fosfolipídios usando um receptor rígido é a abordagem convencional para fazer estudos iniciais de docking para identificar uma primeira passagem de estruturas candidatas encaixadas que podem ser acompanhadas no futuro com um receptor flexível, uma vez que os resíduos críticos de aminoácidos dentro do lado catalítico que se ligam aos substratos são identificados para focar em regiões moleculares que podem ser tornadas flexíveis em seguir estudos de docking molecular e em ambiente solvatado. Portanto, alavancar colaborações com outras instituições que possuem mais recursos pode ser uma forma de ajudar a corroborar algumas das descobertas iniciais fornecidas pelo AutoDock e identificar mecanismos moleculares adicionais de interações substrato-enzima.

Em conclusão, os achados deste estudo demonstram que o método de reação de substituição de ligantes, utilizando um ligante encapsulado em lipossomas, pode ser efetivamente aplicado a estudos de permeabilidade de membrana em vários processos mediados por membrana. Isso inclui interações ligante-receptor, interações lipídio-proteína, troca intermembranar, fusão e fissão de membrana e contrações neuromusculares, entre outras. Além disso, essa abordagem possui um potencial significativo para investigar produtos farmacêuticos membranotrópicos. Ao mesmo tempo, reconhecemos que, embora novos métodos em membranas modelo sejam inestimáveis para dissecar mecanismos específicos de interações de membrana, suas simplificações inerentes limitam sua capacidade de replicar totalmente a complexidade estrutural, composicional e funcional das membranas biológicas in vivo. Portanto, é essencial interpretar os dados dos sistemas modelo com cautela e validar os achados usando modelos celulares ou de organismos sempre que possível.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os estudos neste artigo foram apoiados pela doação inicial da Beijing Chaoyang KaiWen Academy (ESG) e pelo Prêmio SEPA, NIH 5R25MD019151-03 (RKD). O trabalho referente à preparação do HDP-2 foi apoiado por uma doação da Fundação Russa de Ciência nº 24-15-00280 (YNU). Os autores gostariam de agradecer à Dra. Maryam Barancheshmeh por escrever o roteiro e desenvolver o vídeo sobre a aplicação da simulação de docking molecular, que foi preparado após a publicação deste artigo de pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Subunidade básica HDP-2P do veneno de víbora de V. nikolskii PLA2, HDP-2, pureza 98,5%  Instituto de Química Bioorgânica, MoscouHDP-2 isolado de acordo com o potocol no PMID:18083205. HDP-2P purificado do HDP-2 pela DEAE Sephadex A-50 & nbsp;  
Cardiolipina (coração, bovina) (sal de sódio), >99%MacklinC916138
Coenzima A, FUJIFILM Wako' s NEFA kit Lexington, MA, EUA
Corte de peso molecular da membrana da celulose do tubo de diálise 1,0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Xangai, China & nbsp;
Termostato de tanque de água controlado digitalmente YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Pequim, China & nbsp;
Balanço analítico eletrônico de alta precisão FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., China
Espectrofotômetro de alcance UV-Visível JingHua 752  Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Xangai, China
L-&alfa;-fosfatidilcolina (Ovo, Frango), ≥ 95%MacklinL799415
L-&alfa;-fosfatidilinositol (fígado, bovino) (sal de sódio), ≥ 99%MacklinL780292
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cérebro, suíno) (sal de amônio), ≥ 99%MacklinL996223
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfato (cérebro, suíno) (sal de amônio), 99%MacklinL970250
L-&alfa;-fosfatidilserina (cérebro, porcino) (sal de sódio), >99%MacklinL864755
Agitador magnético JB-3 Leici JB-3 de Xangai
Medidor de pH PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., China
Microcentrífuga TGL-16B  Shanghai 3 Anting Co., Xangai, China
Dispensador Ultrassônico Yt-JY96-IIN Shanghai Yetuo technology Co., Ltd., China
Bomba de vácuo TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, China

Referências

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