Papel potencial do eixo de sinalização PGE 2-EP4-CA2+ na osteoartrite pós-traumática

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para delinear sistematicamente o estabelecimento e os métodos de avaliação de modelos de ratos com osteoartrite, por meio de comparação, fornecendo evidências científicas para a patogênese diferente entre a osteoartrite induzida por lesão mecânica aguda e a osteoartrite crônica induzida por fator metabólico/ambiental. O modelo ACLT é o foco principal, enfatizando alterações na via de sinalização da disfunção mitocondrial EP4-Ca²⁺.

Resumo

A osteoartrite pós-traumática (PTOA) é uma doença articular degenerativa desencadeada por trauma ou estresse mecânico intenso, levando à degeneração da cartilagem articular e comprometimento funcional. A prostaglandina E2 (PGE₂) contribui significativamente para a degradação da cartilagem após lesão mecânica, ativando seu receptor, o receptor 4 da prostaglandina E (EP4), nas membranas dos condrócitos. A homeostase da cartilagem articular depende principalmente do equilíbrio dinâmico entre a degradação e o reparo da cartilagem, um processo finamente regulado pelos condrócitos. A via de sinalização da proteína quinase II dependente de Ca²⁺/Calmodulina (CAMKII) demonstrou desempenhar um papel crítico na mediação da restauração da função dos condrócitos. Neste estudo, observamos aumento da expressão de EP4, receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) e CaMKII fosforilado em condrócitos estimulados por interleucina-1 beta (IL-1β), sugerindo uma possível ligação entre a sinalização de EP4 e a desregulação do cálcio. No entanto, ainda faltam evidências diretas que confirmem o envolvimento do eixo EP4-Ca²⁺/CaMKII na PTOA. Mais investigações usando intervenções genéticas ou farmacológicas são necessárias para esclarecer esse mecanismo potencial. Esses achados fornecem uma base preliminar para explorar a homeostase do cálcio e a sinalização EP4 como alvos para o tratamento com PTOA.

Introdução

Embora a atividade física seja amplamente promovida por seus benefícios à saúde, ela continua sendo uma das principais causas de lesões musculoesqueléticas nos membros inferiores, o que pode levar a vários resultados adversos¹. Entre estes, o PTOA tornou-se um fardo crescente para adolescentes e adultos jovens que sofrem lesões articulares em tenra idade². De forma alarmante, aproximadamente 48-52% dos indivíduos que sofrem lesões articulares relacionadas ao esporte desenvolvem PTOA dentro de 11-17 anos ^3,4. A articulação do joelho, uma das articulações mais frequentemente lesadas em esportes juvenis e atividades recreativas, é particularmente vulnerável na progressão da lesão articular para PTOA. Um estudo prospectivo relatou que indivíduos com lesões no joelho têm um risco 10 vezes maior de desenvolver osteoartrite do joelho confirmada radiograficamente 12-20 anos após a lesão em comparação com indivíduos não lesionados⁵. Além disso, em adultos jovens, avaliações radiográficas mostraram que jogadoras de futebol com lesões de transecção do ligamento cruzado anterior (LCT) têm um risco de 51% de desenvolver PTOA em 12 anos, enquanto jogadores do sexo masculino têm um risco de 41% em 14 anos⁵. Esses achados destacam o impacto negativo a longo prazo das lesões articulares relacionadas ao esporte na saúde musculoesquelética. Portanto, entender os mecanismos patológicos irreversíveis subjacentes ao desenvolvimento da PTOA é crucial para identificar estratégias de intervenção apropriadas destinadas a mitigar a progressão da doença.

A desregulação precoce da homeostase do Ca²⁺ é um dos principais indicadores para o início da PTOA⁶. O Ca²⁺ liga-se à calmodulina (CaM) para formar um complexo Ca²⁺/CaM que pode interagir com o CaMKII, aliviando sua conformação autoinibitória e regulando a atividade da quinase⁷. Tanto na OA humana quanto na murina, a expressão de CaMKII fosforilada (a forma ativada de CaMKII) é aumentada, enquanto o uso de inibidores de CaMKII bloqueia essa elevação nos níveis de fosforilação, levando à destruição da cartilagem articular⁸, demonstrando o importante papel regulatório de Ca²⁺/CaMKII na mediação da homeostase da cartilagem da OA. Normalmente, essas alterações são influenciadas de forma crucial pela ativação de mecanismos inflamatórios no desenvolvimento da PTOA. Altos níveis de PGE₂, como um importante mediador pró-inflamatório da dor, influenciam a progressão da OA ativando o receptor EP4. Especificamente, o nocaute condicional de EP4 na cartilagem articular aumenta a formação da cartilagem e o metabolismo anabólico, enquanto inibe a hipertrofia e o catabolismo dos condrócitos, promovendo assim a regeneração da cartilagem articular estável e madura em vez da fibrocartilagem e aliviando a dor nas articulações⁹. Dado o papel crucial da via de sinalização Ca²⁺/CaMKII na fisiologia dos condrócitos e o reconhecido envolvimento do receptor EP4 na progressão da osteoartrite, este estudo teve como objetivo explorar se a ativação do EP4 está associada a alterações na sinalização de cálcio e disfunção mitocondrial durante o desenvolvimento do PTOA. Embora a relação causal entre a desregulação de EP4 e Ca²⁺ ainda não tenha sido determinada, os dados aqui sugerem uma possível ligação mecanicista que justifica uma investigação mais aprofundada.

Este estudo enfoca os mecanismos potenciais que ligam a ativação do receptor EP4 com a sinalização de Ca²⁺ e disfunção mitocondrial durante o desenvolvimento do PTOA. Em comparação com os métodos diagnósticos tradicionais, como técnicas de imagem que detectam a progressão da PTOA, e as abordagens terapêuticas atuais, como anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) para alívio dos sintomas, nossa abordagem visa revelar distúrbios precoces da sinalização intracelular na patogênese da PTOA. Essa visão mecanicista fornece uma compreensão mais precisa do início e progressão da doença, oferecendo novos caminhos para o diagnóstico precoce e intervenções direcionadas. Portanto, este estudo estabeleceu um modelo de PTOA em ratos induzido por transecção do ligamento cruzado anterior (ACLT) para mimetizar lesões mecânicas comumente vistas em atletas com controle motor prejudicado durante atividade física aguda ou crônica. Este modelo serve como uma representação ideal do dano articular mecânico pós-traumático, oferecendo uma plataforma reprodutível para investigar alterações histopatológicas e mecanismos moleculares subjacentes. Um grupo de dieta hiperlipídica mais exposição ao ambiente úmido (DF) serve como um controle positivo, com o objetivo de simular fatores de risco metabólicos e ambientais associados à osteoartrite crônica. O primeiro modelo lesão aguda causada por trauma mecânico, enquanto o segundo representa um modelo de doença de ocorrência natural induzida por distúrbio metabólico e fatores ambientais, embora a patogênese final neste grupo possa não seguir o eixo EP4-Ca²-mitocondrial.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (número de aprovação ética: 2024014-2). O estudo foi conduzido de acordo com os regulamentos sobre o uso ético de animais de laboratório estipulados pelo Conselho de Estado da República Popular da China.

1. Animais

1. Use ratos SPF endogâmicos Sprague-Dawley (SD) para reduzir potenciais efeitos de confusão associados ao ciclo estral. Seleccionar um total de nove ratos SD machos, com 4 semanas de idade e pesando entre 90 g e 100 g, para esta experiência.
   NOTA: Esses ratos foram provenientes de um fornecedor licenciado de animais de laboratório na China (número do certificado: 20240410Aazz0619000774).
2. Manter todos os animais em um ambiente específico livre de patógenos (SPF). Mantenha um ambiente controlado a uma temperatura de 24 ± 2 °C com umidade média de 60 ± 1% e um ciclo claro/escuro de 12 horas.
3. Certifique-se de que os ratos tenham livre acesso a água acidificada e uma dieta padrão para ração de roedores.

2. Construção e intervenção de modelos animais

1. Aclimatar os ratos por um período de 2 semanas no centro de alimentação. Distribua aleatoriamente os ratos em três grupos com 6 semanas de idade: grupo controle, grupo PTOA e grupo DF, com três ratos em cada grupo.
2. Atualizar o grupo Controle em condições padrão.
3. Anestesiar o grupo PTOA com isoflurano (4% para indução e 1%-2% para manutenção).
4. Exponha cirurgicamente as articulações bilaterais do joelho por meio de uma incisão longitudinal na pele usando uma abordagem parapatelar medial.
5. Realize o ACLT usando um bisturi e confirme a transecção completa realizando um teste de gaveta anterior positivo.
   NOTA: A transecção bilateral do LCA foi realizada para garantir a consistência do modelo e reduzir a variabilidade individual. Os dados de ambos os joelhos foram calculados para obter um valor por animal para análise.
6. Transferir periodicamente os ratos dos grupos DF para uma câmara climatizada, situada na mesma instalação. Sujeite esses ratos a uma dieta rica em gordura.
   NOTA: A dieta rica em gordura continha 20% de sacarose, 15% de banha, 1,2% de colesterol, 0,2% de colato de sódio, 10% de caseína, 0,6% de hidrogenofosfato de cálcio, 0,4% de pó de calcário, 0,4% de pré-mistura e 52,2% de ração basal. O perfil nutricional da ração controle foi o seguinte: 19% de proteína, 31% de gordura e 50% de carboidratos, com uma relação calórica de 17% de proteína, 37% de gordura e 46% de carboidratos.
7. Manter as condições ambientais dentro da câmara climática a uma temperatura de 24 ± 2 °C, um nível de umidade de 90 ± 4% e um ciclo de luz diário de 12 horas.
   NOTA: Devido ao aumento do risco de crescimento bacteriano em um ambiente de alta temperatura e umidade, esterilize a água potável e os alimentos e reabasteça-os diariamente para minimizar a contaminação. A duração total da intervenção experimental foi de 12 semanas.

3. Análise da marcha (pegadas)

1. Realizar a análise da pegada 12 semanas após o início do tratamento nos ratos modelo, usando um método previamente descrito¹⁰.
2. Cubra as superfícies ventrais das patas traseiras dos ratos com tinta vermelha, e eles foram autorizados a caminhar ao longo de um caminho de 100 cm de comprimento e 8 cm de largura, coberto com papel branco.
3. Para encorajar os ratos a se moverem, coloque uma câmara escura no final do caminho para incentivar o movimento para frente.
4. Faça três medições sequenciais para obter valores médios para cada parâmetro, incluindo comprimento da passada e comprimento do passo, que foram usados para avaliar a irregularidade.
5. Determine o comprimento da passada (cm) medindo a distância percorrida pela mesma pata traseira entre dois passos sucessivos.
6. Defina o comprimento do passo (cm) como a distância horizontal entre as patas traseiras esquerda e direita.
7. Meça o ângulo da pata (°) como o ângulo entre o segundo dedo do pé e o calcâneo, em relação a uma linha horizontal¹¹.
8. Meça o comprimento da passada, o comprimento do passo e o ângulo da pata diretamente nas imagens digitalizadas usando o software Image-Pro Plus (versão 6.0), utilizando suas ferramentas integradas de medição de distância e ângulo.
   NOTA: Esses parâmetros da marcha são cruciais para identificar deficiências funcionais sutis nos estágios iniciais da osteoartrite. Os pacientes podem apresentar passada e comprimento de passo reduzidos para proteger as articulações doloridas, enquanto o aumento do ângulo de saída e assimetria da marcha geralmente ocorrem como respostas compensatórias à instabilidade articular induzida pela dor.

4. Medição do diâmetro da junta

1. Meça o diâmetro da junta usando um micrômetro espiral calibrado (mm) após a modelagem em cada grupo.
   NOTA: À medida que a osteoartrite progride, os pacientes geralmente apresentam inchaço e dor nas articulações. Um grau mais alto de inchaço pode indicar um estágio mais grave da doença.

5. Medição da força de preensão

1. Meça a força de preensão dos membros posteriores usando um medidor digital de força de preensão equipado com uma grade de tração, medidor de força equipado com uma grade de tração (90 mm × 90 mm).
   1. Segure suavemente o rato pela cauda e pela pele na nuca.
   2. Abaixe o animal até que seus membros posteriores agarrem firmemente a grade e, em seguida, puxe o animal horizontalmente ao longo do eixo do sensor de força até que ele solte o aperto.
   3. Repetir o teste três vezes por animal. Registre o valor mais alto como a força máxima de preensão.
      NOTA: Durante o teste de força de preensão dos membros posteriores, imobilize os membros anteriores prendendo-os a uma superfície de papelão para evitar o envolvimento acidental dos membros anteriores com a grade de tração. A diminuição da força de preensão é indicativa de diminuição da função muscular e potenciais déficits motores relacionados à dor associados à progressão osteoartrítica.

6. Isolamento e cultura de condrócitos primários

1. Isole os condrócitos primários de ratos Sprague-Dawley machos com 6 semanas de idade.
2. Dissecar as cabeças femorais e os platôs tibiais para coletar aproximadamente 100-150 mg de tecido cartilaginoso.
3. Lave o tecido duas vezes com PBS contendo 1% de penicilina-estreptomicina.
4. Digerir a cartilagem em 5 ml de tripsina-EDTA a 0,25% a 3 °C durante 30 min.
5. Corte a cartilagem em^{1-2 mm 3} pedaços e digerir em 10 mL de colagenase II a 0,2% a 37 ° C por 4 h em um agitador de temperatura constante.
6. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm, centrifugar a 300 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
7. Ressuspenda o pellet celular em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
8. Incubar as células a 3 °C em atmosfera humidificada com 5% de CO₂.

7. Tratamento celular

1. Conte os condrócitos isolados usando um hemocitômetro.
2. Semeie os condrócitos em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10⁵ células por poço em 0,1 mL de meio de cultura completo (DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina).
3. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO₂ por 24 h para permitir a adesão.
4. Para estabelecer um modelo de PTOA inflamatório in vitro , trate os condrócitos aderentes com IL-1β (10 ng/mL) por 48 h quando a confluência celular atingir aproximadamente 80%.
5. Para o controlo positivo do FD, dissolver o ácido palmítico (PA, CAS n.o 57-11-4) em clorofórmio numa diluição de 1:1000 para preparar uma solução-mãe de 500 μM.
   1. Quando a confluência celular atingir aproximadamente 80%, adicione 1 μL da solução estoque de PA por 1 mL de meio de cultura para atingir uma concentração final de PA de 500 nM. Trate os condrócitos com esta solução por 48 h.
6. Adicione 1 μL de clorofórmio (controle veículo) por 1 mL de meio de cultura para células de controle sem PA.

8. Coleta de amostras, descalcificação e preparação para incorporação

1. Eutanasiar animais 12 semanas após a intervenção por inalação de uma sobredosagem de isoflurano (≥5%) em uma câmara selada por pelo menos 5 minutos e confirmar a cessação completa da respiração e dos batimentos cardíacos.
   NOTA: Este método foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal e cumpriu as diretrizes nacionais para a eutanásia humanitária de animais de laboratório.
2. Colete ambas as articulações do joelho de três ratos por grupo (n = 3, total = 6 joelhos) para avaliação histológica.
3. Fixe as amostras em paraformaldeído (PFA) a 4% em uma proporção de volume tecido-fixador superior a 1:20 por mais de 48 h em um agitador a ° C.
4. Enxágue os lenços em água corrente da torneira por 1-2 h para remover o fixador residual.
5. Descalcifique os tecidos em solução de EDTA 0,5 M (pH 7,4, ~ 15%) a uma proporção tecido-solução de 1:20 por 21 dias a 3 ° C e substitua por solução nova a cada 3 dias.
6. Avalie a conclusão da descalcificação sondando o osso com uma agulha para amolecer.
7. Lave os lenços descalcificados em água corrente da torneira por 2 h e coloque-os em de embutir.
8. Desidratar amostras através de uma série graduada de etanol: etanol 75% por 2 h (ou durante a noite), etanol 80% por 2 h, etanol 95% por 0,5 h e etanol absoluto duas vezes por 60 min. Em seguida, mergulhe em xileno:etanol 1:1 por 20 min.
9. Limpe os tecidos em xileno duas vezes (10 min e 60 min).
10. Infiltre os tecidos com parafina na seguinte ordem: xileno: parafina (1:1) por 15 min, parafina mole a 52-5 °C por 1 h (duas vezes) e, em seguida, parafina dura a 56-5 °C por 30 min.
11. Incorpore os tecidos usando um sistema de inclusão de parafina (por exemplo, Leica, ajustado para 6 ° C) e transfira os blocos para uma placa fria a -2 ° C por 2 h.
12. A parafina de seção bloqueia sagitalmente na espessura de μm usando um micrótomo.
13. Flutue as fitas em banho-maria a 4 °C e monte-as em lâminas de vidro limpas.
14. Seque as secções montadas ao ar e coze-as num forno a 60 °C durante 2 h para remover a parafina residual.
15. Desparafinize as seções imergindo sequencialmente em xileno (10 min), xileno fresco (10 min), etanol absoluto (5 min), etanol absoluto fresco (5 min), etanol 90% (5 min) e etanol 75% (5 min) e, em seguida, enxágue com água da torneira antes da coloração.

9. Coloração de hematoxilina e eosina (HE)

1. Seções de tecido desparafinizado e reidratado imersas foram imersas em solução de coloração de hematoxilina a 0,5% por 3-5 min em temperatura ambiente (RT; ~ 2 ° C), seguido de enxágue completo em água corrente da torneira.
2. Trate brevemente as seções com solução de diferenciação de hematoxilina por 2-5 s e enxágue em água corrente da torneira.
3. Realize o azulamento imergindo seções em solução de hematoxilina azulada por 2-5 s, seguido de enxágue.
4. Desidrate as seções em etanol a 85% e 95% por 5 min cada, depois comente em 0,05% de eosina Y (alcoólica) por 5 min.
5. Desidratar duas vezes em etanol absoluto (5 min cada), depois limpar em xileno (5 min), seguido de xileno fresco (5 min).
6. Monte as seções com bálsamo neutro e cubra com uma lamínula.
   NOTA: Na cartilagem bem preservada, a hematoxilina cora os núcleos de azul e a eosina cora a matriz de rosa. A cartilagem danificada mostra perda de condrócitos, fibrilação e matriz desorganizada.

10. Safranin O - coloração verde rápida (SOFG)

1. Pinte as seções com solução Fast Green a 2% por 1-5 min em RT. Lave em água corrente da torneira até que a cartilagem fique incolor.
2. Diferencie brevemente as seções em ácido clorídrico a 1% por 10-15 s e depois enxágue abundantemente com água corrente.
3. Seções de coloração com solução de Safranin O a 0,2% por 5-10 s, depois desidratar rapidamente por meio de quatro trocas de etanol absoluto (3-5 s cada).
4. Seções claras em xileno (5 min), seguidas de xileno fresco (5 min).
5. Monte as lâminas com bálsamo neutro e cubra com uma lamínula.
   NOTA: Safranin O mancha os proteoglicanos da cartilagem de vermelho, enquanto o Fast Green mancha os ossos / tecidos fibrosos de verde. A perda de vermelho indica depleção e degeneração de proteoglicanos.
6. Avalie as alterações histológicas usando o sistema de pontuação da Osteoarthritis Research Society International (OARSI). Meça a largura do espaço articular e a espessura da cartilagem para avaliar a degeneração estrutural. Capture imagens sob um microscópio óptico (por exemplo, ECLIPSE Ti2-E) a 4× (barra de escala = 50 μm) e 20x (barra de escala = 10 μm).
   NOTA: Use o software de imagem do sistema para captura de imagem e ImageJ (v1.48v) para análise. Calibre imagens por meio de Analisar > Definir escala com um micrômetro. Para cada articulação, quantifique cinco campos aleatórios de três cortes sagitais usando análise cega por três observadores independentes.

11. Micro-μ TC

1. Dissecar as articulações do joelho de ratos 12 semanas após a intervenção e fixá-las imediatamente em paraformaldeído a 4% em RT por 24 h para preservar a morfologia do tecido.
2. Enxágue as amostras fixas com PBS e armazene-as em etanol a 70% até a digitalização.
3. Monte cada amostra da articulação do joelho em um suporte de amostra dedicado antes da digitalização. Alinhe a junta ao longo de seu eixo longo para minimizar artefatos de movimento.
4. Realize a varredura de micro-μCT usando um sistema de micro-μCT com os seguintes parâmetros de varredura: tensão de raios-X 70 kV, corrente de 100 μA e potência de 7 W.
5. Adquira quatro quadros por projeção e empilhe-os para melhorar a qualidade da imagem, com um tamanho de passo rotacional de 0,72°, completando uma rotação completa de 360°.
6. Defina o tamanho do voxel resultante (espessura do corte) em 15 μm, fornecendo imagens de alta resolução adequadas para análise do osso trabecular.
7. Defina a região de interesse (ROI) entre a placa de crescimento tibial proximal e o planalto tibial, concentrando-se no osso subcondral do fêmur e da tíbia.
8. Reconstrua os dados brutos de digitalização em imagens transversais usando o software de reconstrução.
9. Importe as pilhas de imagens reconstruídas para um software apropriado para análise morfométrica quantitativa.
10. Avalie os principais parâmetros, incluindo fração de volume ósseo (BV/TV, %), densidade mineral óssea (DMO, g/cm³) e separação trabecular (Tb.Sp, mm).
11. Para visualização qualitativa e tridimensional, use um software de visualização 3D para gerar renderizações volumétricas da microarquitetura óssea.
12. Realizar uma avaliação visual para confirmar a integridade estrutural e as alterações morfológicas observadas nos dados quantitativos.
    NOTA: Todo o processamento e análise de imagens foram conduzidos por operadores cegos para garantir resultados imparciais.

12. Elisa

1. Anestesiar os ratos 12 semanas após a intervenção. Exponha e disseque cuidadosamente a aorta abdominal para coletar amostras de sangue.
2. Deixe o sangue coletado coagular em RT por 30 min e, em seguida, centrifugue-o a 755 × g (equivalente a 3000 rpm, usando uma centrífuga com um raio de rotor de 7,5 cm) a ° C por 15 min.
3. Separe e armazene o soro para medição subsequente dos níveis de PGE₂ usando um kit ELISA disponível comercialmente.
4. Paralelamente, semear condrócitos primários e cultivá-los por 24 h, seguido de tratamento com IL-1β e PA por 48 h, de acordo com o protocolo de tratamento celular estabelecido. Após a intervenção, coletar e analisar os sobrenadantes da cultura para concentração de PGE₂ usando o mesmo kit ELISA.

13. RT-PCR quantitativo

1. Extraia o RNA total de amostras de células usando o reagente comercial de extração de RNA (TRIzol).
2. Sintetize o cDNA usando um kit de transcrição reversa (com removedor de gDNA) e armazene o cDNA resultante a -8 ° C para análise subsequente.
3. Realize PCR quantitativo usando SYBR Green e calcule os níveis de expressão relativos usando o método 2−ΔΔCt.
   NOTA: As sequências de primers utilizadas foram as seguintes: β-actina direta: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-actina reversa: CTGACCCATACCCACCATCAC; EP4 atacante: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 atacante: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; Atacante COX-2: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 reverso: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Análise de Western blotting

1. Lisar as células com tampão RIPA no gelo por 30 min.
2. Separe as amostras de proteínas por SDS-PAGE por 90 min e transfira-as para membranas de nitrocelulose por 2 h.
3. Bloqueie as membranas com 5% de BSA e lave-as com solução tamponada com fosfato.
4. Realize immunoblotting usando anticorpos específicos.
   NOTA: Os anticorpos e suas respectivas diluições foram os seguintes: anti-MMP9 (1:1000), anti-colágeno II (1:1000), anti-COX2 (1:1000), anti-CaMKII (1:1000), anti-p-CaMKII (1:1000), anti-IP3R (1:1000), anti-Cyt-C (1:1000) e anti-β-actina (1:2000).
5. Após incubação noturna com anticorpos primários, lave as membranas com TBST e incube por 1 h com anticorpos secundários: HRP de camundongo (1:2000) ou HRP de coelho (1:2000) no escuro.
6. Após outra lavagem com TBST, realize a detecção de proteínas usando um kit de quimioluminescência aprimorado.
7. Analise os dados com o software ImageJ (versão 1.48v).

15. Coloração de imunofluorescência

1. Cultivar condrócitos em lamínulas em placas de 12 poços até atingirem 80% de confluência.
2. Após o tratamento com IL-1β e PA por 48 h, ou nenhum tratamento como controle, fixar as células com paraformaldeído a 4% em PBS por 15 min em RT.
3. Permeabilize as células com PBS contendo 0,2% de Triton X-100 por 15 min.
4. Lave as células três vezes com PBS (5 min cada) e, em seguida, incube-as com anticorpo primário (anti-IP3R, diluição 1:200) em tampão de diluição de anticorpos a °C durante a noite.
5. Exponha as células a uma diluição de 1:500 de anticorpo secundário anti-IgG de cabra marcado com isotiocianato de fluoresceína por 1 h.
6. Contra-corar as células com 5 μg/ml de solução de DAPI durante 10 min.
   NOTA: As imagens de fluorescência foram adquiridas usando uma lente objetiva de 40x (barra de escala = 2 μm). Todas as imagens foram processadas com o software ZEN e quantificadas com o ImageJ (versão 1.48v), seguindo procedimentos de calibração consistentes.

16. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando o GraphPad Prism (versão 8.0.2).
2. Antes de aplicar testes paramétricos, avaliar os dados quanto à distribuição normal usando o teste de Shapiro-Wilk e quanto à homogeneidade da variância usando os testes de Brown-Forsythe e Bartlett.
3. Use ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações entre vários grupos e aplique um teste t de Student não pareado bicaudal para comparações de dois grupos.
4. Considere o valor de P menor que 0,05 como estatisticamente significativo.
5. Apresente todos os dados como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três experimentos independentes.

Resultados

A PTOA induzida por ACLT exibe destruição prematura da cartilagem e déficits comportamentais em relação à OAJ crônica induzida por DF (Figura 2 e Figura 3)
O estreitamento do espaço articular e a degeneração da cartilagem são os principais desfechos da OA. Estudos anteriores identificaram o excesso de peso e fatores ambientais (por exemplo, clima úmido) como potenciais contribuintes para o aparecimento da OA<...

Discussão

Em comparação com a OA crônica induzida por fatores ambientais e dietéticos, o trauma articular induzido pelo LCA leva a uma progressão mais rápida da doença. Nossos resultados, baseados em avaliações comportamentais, incluindo edema articular, força de preensão dos membros posteriores e análise da marcha, revelaram diferenças significativas entre o grupo controle, o grupo PTOA e o grupo controle positivo induzido por fatores ambientais e dietéticos. Após 12 semanas de intervenção, obser...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,2% de colagenase II	Sigma-Aldrich, EUA	Nº CAS: 9001-12-1	Isolamento e cultura de condrócitos primários
0,2% Triton X-100	Beyotime, China	ST795	Imunofluorescência
0,25% de tripsina-EDTA	Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.	AR1071	Descalcificação
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco, EUA	25200072	Isolamento e cultura de condrócitos primários
Solução fixadora de paraformaldeído a 4%	Biyuntian, China	Pág. P0099-3L	Fixação tecidual
Anticorpo anti-CaMKII	Huabio, China	ET1608-47	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-colágeno II	Abcam, Reino Unido	AB34712	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-COX2	Abcam, Reino Unido	AB179800	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-Cyt-C	Selleck, China	F2534	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-IP3R (B-2)	Santa Cruz, EUA	SC-377518	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-MMP9	Abcam, Reino Unido	AB76003	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-p-CaMKII	Selleck, China	F0342	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-beta-actina	Tecnologia de Sinalização Celular (CST), EUA	8H10D10	Western blot (1:2000)
Solução de bloqueio BSA	Sigma Aldrich, EUA	N/A	5% BSA para bloqueio de Western blot
Centrífuga (5424 R)	Eppendorf, Alemanha	N/A	755 &vezes; g velocidade de centrifugação
Clorofórmio	Sigma Aldrich, EUA	N/A	Solvente para PA
Câmara climatizada (RXZ-158A)	Fabricante nacional, China	N/A	Modelo de ambiente úmido
Kit de transcrição reversa colorida	Invitrogen, Suzhou, China	N/A	síntese de cDNA
CTAm software	Bruker	versões 1.9 e 4.1	Para análise morfométrica quantitativa
Software CTVol	Bruker	Versão 2.0	Para visualização qualitativa e tridimensional
Solução de coloração DAPI	Beyotime, China	N/A	Coloração nuclear (5 µ g/mL)
Medidor digital de força de preensão	Instrumento Puxin	N/A	Medindo a força de preensão dos membros posteriores
Meio DMEM/F12	Corning, EUA	N/A	Meio de cultura celular
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)	Aladdin	N/A	Descalcificação dos tecidos ósseos
Kit ELISA para PGE2	Elabscience, Wuhan, China	PGE2E-EL-0034	Detecção de ELISA
Kit de quimioluminescência aprimorada	Millipore, Estados Unidos	WBKLS0500	Detecção de Western blot
Etanol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Desidratação tecidual
Soro fetal bovino (FBS)	Corning, EUA	N/A	Concentração de 10% para cultura
IgG anti-coelho de cabra com rótulo FITC	Beyotime, China	Kit P0179	Imunofluorescência (1:500)
Prisma do GraphPad	GraphPad Software, EUA	Versão 8.0.2	Análise de dados
Hematoxilina e Eosina (H& E) Kit de coloração	Servicebio, Wuhan	G1005	Histologia
IL-1β	PeproTech, EUA	400-01B	10 ng/mL para o modelo de célula PTOA
ImagemJ	NIH, EUA	Versão 1.48v	Análise de imagem
Software Image-Pro Plus	Cibernética da mídia	Versão 6.0	Análise quantitativa da marcha a partir de pegadas digitalizadas
Isoflurano	Xangai Yaji Biológico	YS1412C	Anestesia para cirurgia animal
Centro de Incorporação Leica	Leica Microsystems	Por exemplo, 1160	Incorporação de parafina
Micrótomo Leica	Leica Microsystems	RM2235	Seccionamento de tecidos embebidos em parafina
Banho-maria Leica	Leica Microsystems	HI1210	Seções de parafina flutuantes
Microscópio óptico (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Japão	N/A	Observação histológica
Scanner Micro-CT (ZKKS-MCT-Sharp)	Fabricante nacional, China	N/A	Imagem óssea
Anticorpo secundário de Mouse-HRP	Tecnologia de Sinalização Celular (CST), EUA	7076	Diluição 1:2000
Software de imagem NIS-Elements	Nikon	N/A	Captura e análise de imagens de microscópio
Software NRecon	Bruker, Alemanha	Versão 1.6	Reconstrução por TC
Ácido Palmítico (PA)	Sigma Aldrich, EUA	Pág. 0500	500 µ Estoque M para modelo de célula FD
Cera de Parafina para Seccionamento, Grau de Patologia, Ponto de Fusão 52-54 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500 ouros	Usado para incorporação de parafina durante o processamento de tecidos
Cera de Parafina para Seccionamento, Grau de Patologia, Ponto de Fusão 56-58 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500 ouros	Usado para incorporação final de cera dura no corte de tecidos
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Lavagem de células e enxágue de tecidos
Penicilina-estreptomicina	Corning, EUA	N/A	1% para cultura de células
Membrana PVDF (0,45 µ m)	Millipore, Estados Unidos	IPVH00010	Membrana Western blot
Anticorpo secundário Rabbit-HRP	Tecnologia de Sinalização Celular (CST), EUA	7074	Diluição 1:2000
Tinta vermelha	HERÓI	HERÓI 204	Rastreamento de pegadas na análise da marcha
Tampão de lise RIPA	Keygen, China	N/A	Extração de proteínas
Safranin O– Kit de coloração verde rápida	Servicebio, Wuhan	G1053	Coloração histológica
Micrômetro espiral (paquímetro)	Huangshan, China	N/A	Medição da largura da junta
Software de Análise de Osso Subcondral (CTAn)	Bruker, Alemanha	Versões 1.9 e 4.1	Análise morfométrica
SYBR Green PCR Master Mix	AG Scientific, China	N/A	Análise de qPCR
Reagentes Western blot (tampão RIPA, componentes de gel SDS-PAGE, tampão de carregamento, TBST, etc.)	Beyotime Biotechnology (China)	N/A (usado como uma entrada de grupo)	Todos os reagentes de rotina usados para procedimentos de Western blotting
Xileno	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 1330-20-7	Limpeza de tecidos