Artigo de método

Hibridização in situ de RNA com imunofluorescência de proteína sequencial em ensaio em tandem

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DOI:

10.3791/68615

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10 de outubro de 2025

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha a hibridização in situ de RNA com imunofluorescência sequencial de proteínas no tecido em uma plataforma automatizada para caracterizar ômicas múltiplas espaciais em nível celular direcionado.

Resumo

A funcionalidade das células dentro de um hospedeiro não depende de sinais isolados. Em vez disso, todos os componentes, desde as menores moléculas de RNA até as maiores proteínas, devem operar em harmonia e coordenação dentro do corpo humano. Como tal, a importância de abordagens que integrem investigações espaciais em nível celular em várias ômicas é fundamental para entender as interações célula-célula e a progressão da doença. Dissecar o proteoma e o transcriptoma no mesmo ensaio espacial nos ajuda a entender como não apenas o que uma célula está sendo instruída a realizar (RNA), mas também como ela está executando essas instruções no contexto do nicho microambiental em que se encontra (proteína). Este manuscrito está focado na integração da imunofluorescência sequencial (SeqIF) com a hibridização in situ de RNA (ISH) com um sistema orientado por microfluídica no tecido para investigação de proteínas e RNA de alto rendimento em um contexto espacial (seqRNA-ISH + seqIF) que permitirá até 12 alvos de RNA e 24 proteínas em uma única execução com alvos de proteínas adicionais possíveis de serem adicionados via execuções sequenciais. Este método fornece uma plataforma multiômica direcionada sequencial que não requer consideração da compatibilidade com fluoróforos e otimização extensiva para plexação mais alta. Isso permite entender quais mensagens a célula está preparando ou enviando para seu microambiente. Essa abordagem direcionada ajuda a validar métodos de transcriptoma completo enquanto examina as interações entre o RNA e as proteínas de maneira mais precisa.

Introdução

O funcionamento complexo das células dentro do corpo humano depende de uma intrincada interação de sinais, de pequenas moléculas de RNA a grandes proteínas, todas trabalhando em coordenação1. Essa interação ressalta a importância de abordagens integrativas que examinam as interações espaciais em nível celular em várias camadas ômicas 2,3. Tais metodologias são essenciais para entender as complexidades das interações célula-célula e a progressão da doença. Muitos métodos tradicionais, como citometria de fluxo4 e sequenciamento de célula única5, isolados de células são usados para investigar amostras desagregadas para identificar proporções em massa de fenótipos presentes em uma amostra específica. No entanto, isolar células para análise pode induzir ativação ou alterações fenotípicas que podem não refletir com precisão sua biologia nativa e função in situ6. Métodos avançados em biologia espacial oferecem novas estratégias para estudar células e seu microambiente sem comprometer o contexto da arquitetura do tecido e as relações espaciais com células vizinhas em vários tipos moleculares 2,7.

A integração de análises de transcriptoma e proteoma no mesmo ensaio espacial, sem isolar células individuais, oferece uma visão abrangente da função celular8. Este método baseia-se em métodos de hibridização insitu fluorescente de RNA de molécula única (FISH), mas não inclui digestão de proteinase que complica interrogações sequenciais de proteínas8. A flexibilidade da abordagem a ser usada em uma única seção fornece maior resolução espacial e menos processamento de imagem para integrar e alinhar seções. Essa abordagem fornece insights sobre as instruções recebidas por uma célula (RNA) e sua execução (proteína) dentro de seu nicho microambiental específico. Ao combinar essas camadas de informações, os pesquisadores podem obter insights mais profundos sobre o comportamento e a comunicação celular.

Embora existam métodos manuais, avanços recentes nas tecnologias ômicas espaciais permitiram análises mais complexas com um maior número de marcadores proteômicos examinados usando multiplexação manual9. Essas abordagens incluíram avanços em ensaios de proteínas e RNA-ISH 10,11,12,13,14 e metodologias automatizadas que requerem anticorpos conjugados específicos do sistema 15,16,17, citometria de massa por imagem (IMC) 18 , 19 , 20 e outras metodologias proteômicas sequenciais fluorescentes automatizadas que utilizam antiboedies primários e secundários prontos para uso 2,21,22. Essas tecnologias facilitaram a proteômica ou a transcriptômica e proteômica combinadas usando abordagens direcionadas e geralmente visualizam o RNA por meio de sondas e proteínas por meio de anticorpos baseados em conjugados semelhantes, permitindo que RNA e proteína simultâneos ou sequenciais sejam co-detectados usando a mesma metodologia ou instrumentos. Ao fornecer uma visão abrangente da atividade celular, esses tipos de abordagens visam melhorar nossa compreensão da comunicação celular entre as células e seu microambiente. Ele oferece uma ferramenta valiosa para decifrar as complexidades da interação celular, potencialmente revelando novos insights sobre processos fisiológicos normais e mecanismos de doenças.

Este protocolo fornece orientação para integrar a hibridização in situ de RNA (ISH) com imunofluorescência sequencial (SeqIF) com um sistema acionado por microfluídica no tecido. Isso fornece uma ferramenta de alto rendimento para a investigação de RNA e proteína dentro de seu contexto espacial nativo. Este método (seqRNA-ISH+seqIF) permitirá até 12 alvos de RNA e 24 proteínas em uma única execução, com alvos de proteínas adicionais possíveis de serem adicionados por meio de execuções sequenciais. Embora este protocolo se concentre em um sistema microfluídico específico, o manuseio de tecidos, a garantia de qualidade do RNA e as diretrizes de seleção e titulação de anticorpos fornecidas podem ser adaptadas a outras metodologias. No entanto, este método usa a recuperação do antígeno pH 9,0 para recuperação eficiente de epítopos sem protease, melhorando a estabilidade proteômica e fornecendo alguns transcriptômicos direcionados, ao contrário do RNA-ISH tradicional em pH 6,0 com protease para aumentar a acessibilidade da sonda de RNA, mas falha em preservar o proteoma8. O método seqRNA-ISH+seqIF é visualmente delineado na Figura 1, demonstrando a amplificação do RNA FISH seguida de clivagem antes de utilizar um método de emparelhamento de anticorpos primário-secundário que utiliza uma remoção química suave de primários e secundários. A natureza sequencial do seqIF e da detecção supera muitas das limitações relacionadas à compatibilidade com fluoróforos, utilizando metodologias sequenciais23. Isso reduz a necessidade de otimização extensiva necessária na coloração simultânea em metodologias de alto plexo que requerem compensação para sobreposição espectral23.

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Protocolo

Este protocolo usa seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) coletadas de pacientes com carcinoma de ovário seroso de alto grau virgens de tratamento que foram submetidas à cirurgia citorredutora primária. Todos os dados clínicos foram obtidos do repositório de câncer de ovário do Departamento de Oncologia Ginecológica e Medicina Reprodutiva sob protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Texas MD Anderson. O consentimento informado por escrito dos pacientes foi obtido pela equipe da recepção e os estudos foram conduzidos de acordo com diretrizes éticas reconhecidas.

NOTA: Todos os reagentes, salvo indicação em contrário, são diluídos em água deionizada livre de nuclease.

1. Corrija e incorpore amostras

NOTA: A escolha do fixador e da duração da fixação afeta fortemente o desempenho dos ensaios e, em geral, os ensaios espaciais são mais frequentemente feitos com FFPE, pois preserva a arquitetura patológica. Este protocolo descreve o uso de tecido FFPE, como tal, o seguinte protocolo é sugerido para amostras de tecido FFPE. No entanto, a qualidade do RNA é afetada pelos processos de fixação, assim como os epítopos de proteínas, mas em menor grau. Esses métodos de fixação, fixação incompleta e degradação da amostra podem aumentar a ligação não específica na proteômica baseada em anticorpos. Em terceiro lugar, a fluorescência constitutiva é normalmente extinta durante o processamento FFPE, mas alguns fluoróforos persistem moderadamente e requerem testes para garantir que sejam extintos.

  1. Corte o tecido com uma espessura de ≤ 5 mm para garantir uma fixação uniforme e evitar barreiras à difusão induzidas por gordura. Fixe imediatamente as seções em formalina tamponada com fosfato a 10% (pH 7,0) a 4 ° C por 24 h para otimizar o RNA e a proteína24.
  2. Processe tecidos fixos em um processador de tecidos ou processados manualmente usando as seguintes etapas
    1. Desidratar seções de tecido em etanol de grau molecular em água livre de nuclease de (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x por 1 h cada).
    2. Em seguida, mergulhe o tecido em xileno 2 vezes por 1 h cada em temperatura ambiente (~ 23 ° C).
  3. Aquecer a cera de parafina a 60 °C. Mergulhe a caixa de lenços de papel em cera de parafina por 2 vezes por 1 hora cada.
  4. Coloque o tecido inflado e oriente os tecidos no molde, encha com cera de parafina fresca e deixe esfriar rapidamente a 4 ° C25.
    NOTA: Os melhores resultados para RNA serão obtidos completando todas as etapas em 48 h.

2. Avaliação da qualidade do RNA

  1. Use três seções seriais, executando todos os três slides em paralelo ou executando slides de controle antes do painel de destino para garantir que o bloqueio seja suficiente. As sondas de controle positivo emparelhadas têm como alvo os genes de manutenção para avaliar a qualidade do tecido e a integridade espacial em todo o tecido, que podem ser afetadas por diferenças de perseverança. Os controles comumente usados incluem UBC (um gene de alta expressão), PPIB (expressão moderada) e POLR2A (baixa expressão)26. Utilize conjuntos de sondas de controle negativo, como Dab1 (um RNA de bactéria do solo) em cada canal de detecção. Opcionalmente, inclua todas as sondas de controle positivo e negativo na mesma amostra ao lado das sondas alvo. Nesta configuração, coloque os controles negativos Dab1 nos canais T2-T4, atribua controles positivos da expressão mais baixa para a mais alta para T1, T5 e T9 e certifique-se de que as sondas alvo ocupem os canais restantes.
    OPCIONAL: Além disso, para amostras com qualidade de RNA desconhecida, pode ser útil determinar um Valor de Distribuição 200 (pontuação DV200). Pontuações DV200 acima de 30 são fortemente recomendadas, com amostras de maior qualidade de 50 ou mais preferidas27. Essa pontuação é uma indicação da qualidade do RNA, e uma qualidade de amostra mais alta aumenta a probabilidade de RNA-ISH funcionar de forma eficaz27.

3. Precauções e preparações de RNA

NOTA: É uma prática recomendada descontaminar a área das RNases e limpá-la e, em seguida, borrifar a área de trabalho com etanol a 70% antes do processamento, além de usar uma área livre de RNase, sempre use luvas limpas, jaleco e máscara para minimizar a introdução de RNases da pele ou respiração. Use apenas água e consumíveis sem RNase e evite colocar a mão em sacos de suprimentos. Essas precauções, além de manter o tecido/lâminas fresco e seco, são essenciais para manter a integridade do RNA durante os experimentos.

  1. Corte as seções em lâminas de vidro carregadas positivamente com um micrótomo e coloque a região de interesse no centro da lâmina, que coordena com a área de imagem (varia de acordo com o sistema; aqui, é aproximadamente 12,5 mm x 12,5 mm).
    NOTA: Lembre-se de que a espessura ideal para cada seção está entre 4-6 μm para tecidos FFPE.
  2. Assar lâminas FFPE em um forno seco sem RNAse, com o tecido voltado para cima, a 60 °C por um mínimo de 1 h e até durante a noite para tecidos adiposos ou tecidos propensos a descolamento.
  3. Pré-tratamento OPCIONAL
    NOTA: Embora o pré-tratamento seja opcional, algumas etapas são adicionalmente opcionais, conforme descrito abaixo.
    1. Prepare peróxido de hidrogênio a 3%: Em um tubo cônico de 50 mL, adicione 5 mL de peróxido de hidrogênio a 30% a 45 mL de 1x PBS. Armazene o peróxido de hidrogênio restante em temperatura ambiente (~ 23 ° C), a tampa fechada com parafilme, por até três meses.
      NOTA: O peróxido de hidrogênio é um oxidante forte. Mantenha longe de materiais combustíveis, fontes de calor e metais. Use em uma área de capela de exaustão química com equipamento de proteção individual (EPI; por exemplo, óculos de proteção, luvas e jaleco). Evite o contato com a pele, olhos e inalação. Lave a pele com água por 15 min se exposta. Procure ajuda médica se ingerido ou inalado. Concentrações mais altas podem causar queimaduras graves e podem inflamar ou explodir com materiais orgânicos ou certos metais. Sempre adicione peróxido de hidrogênio à água para evitar reações violentas.
    2. Prepare formaldeído a 3,7%: Em uma capela de exaustão química, adicione 1 mL de formaldeído a 16% por 3,3 mL de 1x PBS. Armazene o formaldeído embrulhado em parafilme por até três meses.
      NOTA: O formaldeído pode causar sérios danos aos olhos, irritação respiratória e é suspeito de causar câncer. A exposição prolongada ou repetida pode levar à sensibilização da pele e reações alérgicas. Use apenas em uma capela de exaustão química e use EPI apropriado (luvas, óculos/protetor facial, máscara, jaleco, etc.). Evite contato com a pele, contato com os olhos e inalação. Mantenha longe de fontes de calor e chamas abertas. Descarte o paraformaldeído e os materiais contaminados como resíduos perigosos e prepare apenas a quantidade necessária para uso imediato, se possível.
    3. Desparafinizar lavando a lâmina de tecido, colocando-a em tubos cônicos de 50 mL contendo o seguinte: Xileno (40 mL) por 3 lavagens a 5 min cada em uma capela de exaustão química.
      OPCIONAL: Em vez de xileno, um agente de limpeza histológica de base não xileno pode ser usado, mas potencialmente deixará resíduos de parafina e afetará a qualidade da imagem. Isso envolve a colocação das fatias em tubos cônicos de 50 mL contendo o seguinte: Agente de limpeza histológica de base não xileno (40 mL) por duas lavagens a 15 min cada. Seções de blocos feitos com cera de abelha podem ser difíceis de desparafinar com não xileno. Para misturas de cera/parafina desconhecidas, recomenda-se o uso de xileno com as precauções de segurança corretas. O xileno é uma substância perigosa e inflamável, e a exposição prolongada pode causar danos ao sistema nervoso central, fígado e rins. Use apenas em uma capela de exaustão química e use EPI (por exemplo, luvas, máscaras e jalecos). Descarte o xileno e os materiais contaminados como resíduos perigosos. Em caso de exposição, procure atendimento médico imediato.
    4. Reidratar lavando a lâmina do tecido colocando em tubo cônico de 50 mL contendo: etanol 100% (40 mL) por 2 lavagens por 3 min cada; Etanol a 95% (40 mL) para 2 lavagens a 3 min cada; Etanol 70% (40 mL) para 2 lavagens a 3 min cada; Etanol 50% (40 mL), para 2 lavagens a 3 min cada; Etanol a 30% (40 mL) por 2 lavagens a 3 min cada; 1x lavagem PBS (40 mL) para 1 lavagem a 2 min.
    5. A peroxidase bloqueia o tecido colocando em uma câmara de umidade à temperatura ambiente (~ 23 ° C) e cobrindo o tecido com aproximadamente 100-200 μL de peróxido de hidrogênio a 3%, por 1 lavagem a 10 min e depois lave o tecido com 1x lavagem com PBS (40 mL), por 2 lavagens a 2 min cada.
      NOTA: O bloqueio da peroxidase é opcional e extingue as enzimas peroxidase residuais no tecido para reduzir a coloração inespecífica e pode reduzir a autofluorescência do tecido. Isso é especialmente importante para tecidos com alta autofluorescência, como medula óssea, rim, fígado, pulmão, intestino e cérebro, onde fortes sinais de fundo podem interferir na imagem nas bandas de emissão TRITC e FITC 28,29,30,31,32.
    6. Realize a fixação do formaldeído colocando o tecido em uma câmara de umidade à temperatura ambiente e cobrindo o tecido com aproximadamente 100-200 μL de formaldeído a 3,7%, por 1 lavagem a 10 min, depois lave o tecido com 1x lavagem PBS (40 mL), por 2 lavagens a 2 min cada.
      NOTA: Esta etapa é opcional, mas recomendada para tecidos com alto teor de gordura ou outros tecidos que tenham problemas para aderir a lâminas de vidro.

4. Recuperação de antígenos

NOTA: O método de desparafinação e recuperação de antígeno recomendado e descrito aqui difere do método recomendado para seqRNA-ISH+seqIF pelo fabricante, que utiliza um dispositivo de recuperação de antígeno de calor controlado de grande capacidade.

  1. Recuperação de antígeno induzido por calor (HEIR) usando microondas
    1. Usando um micro-ondas com temperatura monitorada, adicione uma solução tampão HEIR de pH 9.0 disponível comercialmente suficiente (aproximadamente 250 mL) para cobrir as lâminas no suporte da lâmina abaixo do termômetro, se aplicável.
      NOTA: A recuperação do antígeno para RNA é normalmente feita em pH 6,0, no entanto, as metodologias a seguir são para pH 9,0 para maior eficiência de ligação de anticorpos.
  2. Insira as lâminas em solução tampão no micro-ondas e contrabalanceie quaisquer câmaras vazias, se aplicável, com água bidestilada Aqueça as lâminas no micro-ondas por 15 min a 107 ° C (o tempo total é geralmente de 30 min para o buffer HEIR atingir a temperatura).
  3. Resfrie as lâminas colocando-as sob uma capela de exaustão química em temperatura ambiente por aproximadamente 20 min.
  4. Lave as lâminas em 1x PBS em um tubo cônico de 50 mL (40 mL), por 1 lavagem por 2 min.
  5. Armazene as lâminas em um envelope de lâminas com tampa de rosca ou tubo cônico de 50 mL cheio de 1x PBS (ou um tampão comercial de multicoloração) e proceda imediatamente, ou armazene a 4 ° C por até 7 dias, mas idealmente menos de 72 h antes de prosseguir com seqRNA-ISH + seqIF.

5. Prepare soluções de estoque

  1. Prepare o tampão de imagem de RNA 40x
    1. Prepare o tampão de imagem de RNA 40x combinando 400 mg de tampão de imagem de RNA em pó e 25 mL de água deionizada livre de nuclease
    2. Vortex a solução resultante até que esteja totalmente dissolvida e, posteriormente, alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mL por tubo)
    3. Congele e armazene a -20 °C por até três meses, evitando ciclos de congelamento e descongelamento.
  2. Prepare 20x tampão de citrato de sódio (SSC)
    1. Dissolver 157,3 g de cloreto de sódio (NaCl) e 88,2 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7) em 800 mL de água deionizada livre de nuclease.
    2. Meça o pH e titule até pH 7,0 gota a gota com ácido clorídrico (HCl) 1 M.
    3. Autoclave para esterilizar.
      NOTA: O SSC estéril 20x também pode ser adquirido de diferentes empresas. Após a abertura, conservar à temperatura ambiente a 4 °C.
    4. Prepare 4x tampão SSC combinando 1 mL de estoque 20x SSC com 4 mL de água deionizada livre de nuclease

6. RNA-ISH sequencial + imunofluorescência sequencial

NOTA: Todas as etapas descritas aqui são adaptadas do protocolo do fabricante para o seqRNA-ISH+seqIF descrito na Tabela de Materiais, como tal, a maioria dos reagentes é identificada como reagentes comerciais compatíveis com o sistema. Esses reagentes são identificados e/ou fornecidos pelo fabricante e projetados para serem compatíveis com o sistema. Modificações são possíveis e descritas na discussão, mas podem exigir testes adicionais e lavagem de fluidos para evitar o acúmulo. O software calculará o volume total de reagentes necessários após o painel e o protocolo terem sido projetados e inseridos. No entanto, são apresentadas as modificações recomendadas. O volume total sempre varia de acordo com quantos ciclos e destinos são usados por protocolo. No entanto, as diluições de anticorpos e RNA-ISH não serão calculadas pelo sistema, a menos que cada combinação individual seja inserida como um item exclusivo no banco de dados. Para este protocolo, são necessários 400 uL de coquetel de anticorpos por lâmina de amostra.

  1. Preparação do sistema
    1. Antes de seqRNA-ISH+seqIF, lave todos os microfluídicos completamente com água livre de nuclease.
    2. Pulverizar fora do sistema com solução de descontaminação de RNAse, seguida de etanol a 70%.
  2. Preparar reagentes gerais
    1. Tampão de lavagem: 50 mL de tampão multicoloração comercial compatível com sistema 20x + 950 mL de água deionizada livre de nuclease
    2. Água: 100 mL de água deionizada livre de nuclease.
    3. Etanol: 100 mL de etanol a 70%.
    4. Tampão de imagem: 16 mL de solução de imagem comercial compatível com sistema 10x + 140 mL de água deionizada livre de nuclease + 4 mL de estoque de imagem comercial compatível com sistema.
    5. Tampão de eluição: 152 de sistema compatível, comercial, Solução de eluição 1 + 8 de sistema compatível, comercial, Solução de eluição 2
    6. Tampão de têmpera: 130 mL de água deionizada livre de nuclease + 14 mL de solução de têmpera comercial compatível com o sistema 1 + 16 mL de solução de têmpera comercial compatível com o sistema 2.
  3. Prepare reagentes de coloração para o protocolo RNA-ISH
    NOTA: Esta etapa pode ser concluída na noite anterior e armazenada a 4 ° C no escuro. Embora as recomendações do fabricante afirmem que as sondas agrupadas podem ser usadas por até um ano, não é recomendado agrupar sondas com mais de uma semana de antecedência devido a preocupações com contaminação. Para sondas, é melhor bater ou pipetar suavemente para cima e para baixo para misturar e centrifugá-los suavemente para girar antes de usar.
    1. Solução de permeabilização compatível com o sistema de carga, comercial, livre de proteinase a 500 μL por lâmina em um tubo de microcentrífuga compatível com o sistema.
    2. Amplificadores de RNA-ISH de pool baseados no ciclo (Tabela 1) para um total de 500 μL por lâmina por cada um dos seguintes em um tubo de microcentrífuga compatível com o sistema: i) árvores de cauda ZZ para caudas T1 a T4, ii) árvores de cauda ZZ para caudas T5 a T8, iii) árvores de cauda ZZ para caudas T9 a T 12.
    3. Fluoróforos específicos da árvore da cauda da piscina, correspondência de amplificadores, para um total de 500 μL por lâmina por cada um dos seguintes em um tubo de microcentrífuga compatível com o sistema: i) Fluoróforo para árvore T1 a T4, ii) Fluoróforo para árvore T5 a T8, iii) Fluoróforo para T9 a T 12.
      NOTA: Esta etapa é sensível à luz
    4. Prepare 1 mL de uma diluição de 1:200 de DAPI comercial (concentração de estoque de 1 mg / mL) em tampão multicoloração comercial feito com água deionizada livre de nuclease por lâmina
      NOTA: O procedimento foi realizado de acordo com o fabricante, que inclui DAPI como parte dos reagentes padrão. Se estiver usando formulações personalizadas de DAPI diluídas em N,N-Dimetilformamida (DMF), as diluições podem variar e testes de titulação precisarão ser realizados. No entanto, recomenda-se o uso de uma concentração em torno de 1:1000-1:2000 de uma concentração estoque de 1 mg/mL. Normalmente, isso ocorre em uma concentração acima do normal do que os protocolos de coloração manual, pois deve durar várias rodadas de imagem e decapagem. As formulações DAPI recém-fabricadas em DMF tendem a ser mais brilhantes do que as formulações DAPI disponíveis comercialmente. Os reagentes com formamida, como o DAPI, devem ser alocados sob uma capela de exaustão química. A formamida pode causar toxicidade reprodutiva e danos aos órgãos e é suspeita de ser cancerígena. Utilize EPI apropriado (por exemplo, luvas e jaleco).
    5. Prepare o tampão de imagem RNA-ISH imediatamente antes do uso com água deionizada livre de nuclease 12.125, 1.5 mL de estoque tampão de imagem 10x B e 275 μL de estoque tampão de imagem 40x A (descongelado ou feito recentemente)
    6. Preparar até 10 pares de anticorpos primários (os anticorpos proteicos primários são descritos no quadro 2) para seqIF de acordo com as diluições testadas de titulação em tampão de coloração múltipla comercial para um total de 400 μL por lâmina num tubo de microcentrífuga compatível com o sistema. Certifique-se de que cada ciclo de seqIF contenha apenas um anticorpo primário por espécie hospedeira.
    7. Preparar fluoróforos secundários (quadro 3) mais DAPI de acordo com as combinações de anticorpos primários no passo 6.3.7 para o seqIF de acordo com as diluições testadas por titulação. Diluir em tampão multicoloração a um total de 400 μL por ciclo em um tubo cônico de 50 mL com um volume morto mínimo de 1 mL. Exemplos de concentrações para anticorpos secundários Alexa Fluor e DAPI são os seguintes: diluição de 1:200 para Alexa Fluor 555, diluição de 1:400 para Alexa Fluor 647, diluição de 1:1800 para DAPI (de 1 mg/mL de DAPI em DMF)
      NOTA: Esta etapa é sensível à luz. A adição de DAPI aos secundários não está de acordo com o protocolo do fabricante, pois pode ajudar a manter a expressão de DAPI em vários ciclos de seqIF, o que auxilia no alinhamento das imagens após a execução. A maioria dos softwares de processamento de imagem, como o incluído neste sistema, utiliza o sinal DAPI para confirmar o alinhamento da imagem cíclica para colocalização fluorescente.
  4. Inicialização do sistema
    1. Carregar cada um dos reagentes do passo 6.3 pela ordem especificada pelo sistema. Observe que geralmente a ordem será a acima, mas sempre certifique-se de que os reagentes correspondam ao local onde estão sendo carregados
    2. Carregue a lâmina recuperada do antígeno no suporte e certifique-se de que a janela de imagem da lâmina esteja alinhada no centro do espaço de imagem antes de colocar o chip microfluídico compatível com o sistema na parte superior e travá-lo no lugar.
      NOTA: Os chips microfluídicos podem ser reutilizados para testes de titulação seqIF se limpos e armazenados adequadamente até uma vez adicional, desde que as juntas permaneçam intactas. Os chips microfluídicos não podem ser reutilizados se estiver executando um painel de RNA devido à potencial contaminação.
    3. Prepare a solução de clivagem misturando 1,35 mL de 4x SSC e 150 mL de solução comercial de clivagem 10x.
      NOTA: A solução de clivagem 10x oxida rapidamente e é armazenada em uma ampola de vidro que só deve ser quebrada imediatamente antes do uso em uma execução experimental de seqRNA-ISH+seqIF.

7. Execução do sistema

  1. Execute o sistema de acordo com as instruções do fabricante, os tempos de execução aproximados para duas lâminas em um seqRNA-ISH de 12 plex com um seqIF de proteína de 20 plex são de 48 h para uma janela de imagem de 12,5 cm x 12,5 cm.
  2. Após a conclusão da execução do seqRNA-ISH+seqIF, a lâmina pode ser removida e armazenada em 1x PBS ou imediatamente utilizada para seqIF adicional (para até 40 proteínas).
    NOTA: É importante limpar e lavar a microfluídica do sistema usando água livre de nuclease antes e depois de cada execução para reduzir o potencial de contaminação.

8. OPCIONAL: Imagem e análise estatística

  1. Prossiga com a análise de imagem e estatística por meio de ferramentas de análise de imagem ou análise de patologia.

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Resultados

Como exemplo desse método, executamos o seguinte seqRNA-ISH (Tabela 1) + SeqIF (Tabela 2 e Tabela 3) em duas lâminas de um carcinoma seroso de ovário humano de alto grau.

A Figura 2 ilustra a sobreposição de seqRNA-ISH+seqIF em uma amostra de tecido tumoral ovariano. Marcadores de proteínas estruturais, como o colágeno 1, são utilizados para identificar regiões tumorais, enquanto marcadores fenotípicos e funcionai...

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Discussão

A etapa mais crítica na preparação e manuseio de amostras é reduzir a contaminação por RNAse. Isso pode ser alcançado utilizando máscaras para evitar a contaminação da respiração e limpando as superfícies de trabalho com uma solução de descontaminação RNase e etanol 70% feito com água livre de nuclease. Para lâminas FFPE, é melhor cortar várias lâminas adjacentes de blocos FFPE para seqRNA-ISH+seqIF e armazená-las a 4 °C com dessecante. Para controle de qualidade, além de testar o DV200 ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada em parte pela Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), pela Sie Foundation e pelo Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Esta pesquisa foi realizada em colaboração com o Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, que é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde por meio do MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 e do Especialista em Pesquisa 1 R50 CA243707-01A1 do NCI de Jared Burks.

Também gostaríamos de agradecer a Emily Martersteck da Lunaphore pela assistência técnica e treinamento.

O(s) autor(es) recebeu(m) um conjunto de sondas direcionadas e de controle RNAScope como parte de um programa de acesso antecipado da Bio-Techne a um preço com desconto, e alguns reagentes foram fornecidos gratuitamente para uso neste estudo. O fabricante não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
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4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Para coloração nuclear (produto usado durante este estudo, 62247 foi descontinuado)
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cônico de 50mLThermo Fisher Científico339652Usado para alíquotas & soluções secundárias mistas
Álcool isopropanol estéril 70%TexwipeTX3270Para descontaminação de superfícies
AnticorposVárioVárioUsado para alvos primários, varia de acordo com o canal usado
APOE - Hospedeiro: Mouse, Clone: 960318R& DMAB41443-100(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
aSMA - Hospedeiro: Mouse, Clone: 1A4CST69319SF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Micrótomo de corte automáticoLeica14051956472Secção de tecido
CD10 - Hospedeiro: Coelho, Clone: E5P7SCST65534S(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD11c - Hospedeiro: Coelho, Clone: D3V1ECST93233SF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD163 - Hospedeiro: Coelho, Clone: D6U1JCST93498S(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD163 - Hospedeiro: Coelho, Clone: ja51-30InvitrogenMA5-32684(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD20 - Hospedeiro: Mouse, Clone: L26BetilA500-017ACF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD31 - Hospedeiro: Mouse, Clone: 3F8E2Tecnologia de Proteína66065-2-IG(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD33 - Hospedeiro: Coelho, Clone: BLR061GBetilA700-061CF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD4 - Hospedeiro: Coelho, Clone: EPR6855AbcamAB181724(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD45 - Hospedeiro: Coelho, Clone: BL-178-12C7BetilA700-012(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD45RO - Hospedeiro: Mouse, Clone: UCHL1BetilA500-020ACF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD56 - Hospedeiro: Coelho, Clone: BLR152JBetil99746(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD66b - Hospedeiro: Coelho, Clone: BLR111HInvitrogenMA5-44413(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD68 - Hospedeiro: Mouse, Clone: KP-1Biolenda916104(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD8 - Hospedeiro: Mouse, Clone: C8/144BBiolenda372902(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
CD86 - Hospedeiro: Coelho, Clone: E2G8PCST76755SF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Col 1A1 - Hospedeiro: Mouse, Clone: E3E1XCST66948S(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Tubos DNA LoBind 2mLEppendorf22431048Usado para soluções mistas de sonda de RNA
Drierite 21005 Indicando DessecanteCole-Palmer21005Dessecante para dessecador
Lâminas de micrótomo Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistologia - Usado ao seccionar amostras
Álcool etílico 100% (200 provas)Pharmco111000200Para desparafinização
Amortecedor de elegância EZ-AR2BioGeneXHK547-XAKUsado para recuperação de antígeno de seções de tecido FFPE
FOXP3 - Hospedeiro: Coelho, Clone: PoliclonalBetilA700-034CF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
IgG anti-rato de cabra (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21425(nota: Específico para este estudo) F(ab')2-IgG de camundongo (H+L) anticorpo secundário adsorvido cruzado, Alexa Fluor™ 555
IgG anti-rato de cabra (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(nota: Específico para este estudo) F(ab')2-IgG de camundongo (H+L) anticorpo secundário adsorvido cruzado, Alexa Fluor™ Mais 647
IgG anti-coelho de cabra (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21430(nota: Específico para este estudo) F(ab')2-IgG de Coelho (H+L) Anticorpo Secundário Cross-Adsorbed Anticorpo, Alexa Fluor™ 555
Cabra anti-coelho IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21246(nota: Específico para este estudo) F(ab')2-IgG de Coelho (H+L) Anticorpo Secundário Cross-Adsorbed Anticorpo, Alexa Fluor™ 647
GZMB - Hospedeiro: Coelho, Clone: PoliclonalTecnologia de Proteína13588-1-AP(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Hs-POLR2A-T1ACD Biotechne310457-T1Sonda humana de baixa expressão
Hs-PPIB-T5ACD Biotechne313907-T5Controle de sonda de expressão média humana
Hs-UBC-T9ACD Biotechne310047-T9Controle de alta expressão humana
Solução de peróxido de hidrogênio 30%Sigma-AldrichHX0640-5Para preparação de tecidos. Ajuda a bloquear a atividade da peroxidase endógena e a produzir produtos altamente coloridos. Para fazer solução de peróxido de hidrogênio a 3%
Ker8/18 - Hospedeiro: Mouse, Clone: PolyclonalTecnologia de Proteína66187-1-PBS(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
LRP5 - Hospedeiro: Coelho, Clone: HPA030505SigmaHPA030505-100UL(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Tampão multicoloração Lunaphore 20xBio-TechneBU06Usado como diluente e para lavagens para o COMET
Lunaphore COMET ChipBio-TechneMK03chip mcirofluídico para instrumento COMET
Lunaphore COMETBio-TechneCM10-SColoração automática Seq-IF
Kit tampão de eluição de lunóforoBio-TechneBU07-LSolução 1 & Solução 2 para as etapas de eluição do COMET
Kit de tampão de imagem de lunaphoreBio-TechneBU09Soluto e Solvente usado para imagens durante a execução do COMET
Tampões de têmpera de lunóforoBio-TechneBU08-LSolução 1 & Solução 2 para as etapas de têmpera do COMET
MicropipetaVárioN/Apara preparação de reagentes
Periostin - Hospedeiro: Mouse, Clone: 1A11A3Tecnologia de Proteína66491-1-PBS(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Pierce 16% de formaldeído (p/v), sem metanolThermo Fisher Científico28908Para fazer 3,7% de PFA para preparação de tecidos
Entrada de 320102 de sonda (canal T2)ACD Biotechne300040Controlo negativo DapB em T2
Entrada de 320102 de sonda (canal T3)ACD Biotechne300040Controlo negativo DapB em T3
Entrada de 320102 de sonda (canal T4)ACD Biotechne300040Controlo negativo DapB em T4
Solução de estoque de clivagem HiPlex RNAscopeBio-TechneP / N 324399Reagente para clivagem durante o ensaio de RNAScope
RNAscope HiPlex Pro para COMET 12-plex, kit de 20 lâminasBio-Techne322075Reagentes e Tampões para RNAScope
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-APOE-T2ACD Biotechne433093-T2(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-APOE-T2
Sonda RNAscope HiPlex - HS-ARG1-T4ACD BiotechneRolamento 401581-T4(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-ARG1-T4
Sonda RNAscope HiPlex - HS-CD274-T1ACD Biotechne600863-T1(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-CD274-T1
Sonda RNAscope HiPlex - HS-CD40-T6ACD BiotechneRolamento 445973-T6(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-CD40-T6
Sonda RNAscope HiPlex - HS-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-T12(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-CXCL1-01-T12
Sonda RNAscope HiPlex - HS-GZMB-T7ACD BiotechneRolamento 468453-T7(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-GZMB-T7
Sonda RNAscope HiPlex- Hs-IFNG-T3ACD Biotechne310503-T3(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-IFNG-T3
Sonda RNAscope HiPlex - HS-IL23a-T8ACD BiotechneRolamento 562853-T8(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-IL23A-T8
Sonda RNAscope HiPlex- HS-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-IL6-T9
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-TNFa-T11ACD Biotechne310423-T11(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-TNFa-T11
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-VEGFa-T5ACD BiotechneRolamento 423163-T5(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-VEGFa-T5
Sonda RNAscope HiPlex - HS-VISTA-T10ACD BiotechneRolamento 491513-T10(nota: Específico para este estudo) Acesso antecipado RNAscope™ Sonda HiPlex CS - Hs-VISTA-T10
Sonda de controle negativo RNAscope HiPlex12 CSACD Biotechne324347Painel de controle negativo completo de 12 plex recomendado pelo fabricante. DapB em T1-T12.
Sonda de controle positivo RNAscope HiPlex12 CS-HSACD Biotechne324317Painel de controle positivo humano completo de 12 plex recomendado pelo fabricante. Hs -RTU para seguir o gene de manutenção nos canais T1 a T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
Água livre de RNAseCorning46-000-CMPara limpar e preparar todos os equipamentos e usar como diluente quando necessário
Solução de descontaminação RNaseZap RNaseThermo Fisher CientíficoAM9782Uma solução de descontaminação de superfície que destrói RNases
RNeasy FFPE KitQiagen73504 e 19093Para extração de RNA e Medição DV200
Envelope de slidesSimport CientíficoM9504MApara armazenar lâminas em tampão líquido.
Lâmina de barbear industrial de uso geral de design cirúrgicoThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histologia - Usado ao seccionar amostras
TOX 1/2 - Hospedeiro: Coelho, Clone: E613QCST62886SF(nota: Específico para este estudo) Anticorpo de proteína primária
Grau histológico de xilenoThermo Fisher CientíficoUN1307Para desparafinização

Referências

  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

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