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Artigo de método

Cartografia Molecular de Modalidade Dupla: Integrando a Detecção de RNA Multiplex com a Citometria de Massa por Imagem de Proteínas

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DOI:

10.3791/68616

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14 de novembro de 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha uma metodologia para detecção de mRNA multiplex com citometria de massa de imagem de proteína em seções de tecido embebidas em parafina fixada em formalina.

Resumo

A capacidade de detectar proteína e mRNA no mesmo ensaio nos ajuda a entender como a célula está se preparando para uma chegada e quais pistas ela recebe à medida que viaja e interage no ambiente em que se encontra. A imagem de maior plexação agora permite a caracterização de mRNA espacialmente resolvido (transcriptômica espacial) e proteína (proteômica espacial) simultaneamente. Para evitar redundância, esses analitos podem ser analisados em uma única seção de tecido. Existem muitas tecnologias que permitem muitas proteínas e poucos mRNAs ou o inverso, mas como os analitos de ação central são proteínas, este manuscrito está focado na integração da citometria de massa (IMC) de imagem de proteínas com hibridização in situ de mRNA (ISH) utilizando sondas de metal. Isso nos permite entender quais mensagens a célula está preparando ou enviando rapidamente para o mundo à medida que se comunica em seu microambiente. Ele também supera as limitações relacionadas à detecção de proteínas secretadas ou marcadores desafiadores que geralmente são difíceis de quantificar e visualizar utilizando apenas anticorpos. Este protocolo também minimiza a necessidade de compensações ou pós-processamento observados em métodos baseados em fluorescência de plexo superior, pois não há transbordamento espectral fluorescente em um sistema de detecção baseado em sonda de metal, nem há considerações de autofluorescência específicas do tecido.

Introdução

Os cânceres apresentam diversidades estruturais e funcionais em vários pacientes. O microambiente tumoral (TME), composto por células normais e malignas, é heterogêneo entre os pacientes. A metástase resulta de um resíduo do tumor primário que escapa para a corrente sanguínea como aglomerados de células e células únicas, o que fornece pistas sobre a progressão da doença e a resposta terapêutica 1,2. A complexidade desses microambientes precisa ser compreendida1. Embora os tumores sejam amplos tipos celulares, o padrão clínico é histologicamente baseado em um único marcador, que está começando a mudar 1,2. As tecnologias de imagem multiplexada proporcionaram novas direções na patologia. Proteômica, genômica, metabolômica e lipidômica espacialmente resolvidas de cânceres humanos agora são possíveis na resolução de uma única célula ou perto dela 3,4,5,6.

Essas tecnologias podem dissecar as localizações celulares heterogêneas e as interações nos tumores. A utilização da metodologia apropriada de bioimagem de célula única permite a geração de perfis de muitos biomarcadores de proteínas associados à doença em biópsias de pacientes para informar o projeto de terapias contra o câncer. Os insights dos mapas celulares espaciais serão capazes de orientar a escolha da terapia combinada que pode eliminar eficientemente os cânceres com redução de alvos errados, resistência e recaída1. Em questão está a capacidade de sindicalizar essas muitas tecnologias variadas que normalmente não funcionam em harmonia na mesma seção do tecido7. Este protocolo, visualmente delineado na Figura 1, oferece a oportunidade de examinar espacialmente a proteômica e um subconjunto direcionado de mRNAs na mesma seção de tecido e na mesma célula simultaneamente em uma plexidade mais alta do que o que é possível com proteína fluorescente + RNA-ISH8 simultâneo. Isso também pode servir como uma ponte para análises paralelas 3,4,6, com o objetivo de desconvoluir a análise dos dados. Embora a detecção dupla esteja presente, também é possível examinar células que iniciaram rapidamente a produção de mRNA, mas para as quais a proteína secretada permanece indetectável devido à sensibilidade limitada e à falta de amplificação de sinal inerente aos métodos de anticorpos primários marcados diretamente, tornando a detecção de moléculas secretadas particularmente desafiadora. O protocolo a seguir é adaptado de uma detecção fluorescente/cromogênica de 12 plex para ser aplicável à detecção baseada em metal por meio de sondas modificadas com redução de tiol para detecção simultânea em IMC.

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Protocolo

Este protocolo usa tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) coletados de pacientes não tratados anteriormente submetidos a cirurgia citorredutora primária para carcinoma de ovário seroso de alto grau. Todos os dados clínicos foram obtidos do repositório do Departamento de Oncologia Ginecológica e Medicina Reprodutiva sob protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Texas MD Anderson. O consentimento informado por escrito dos pacientes foi obtido e os estudos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas reconhecidas.

1. Precauções e preparações

  1. Sempre utilize água livre de nuclease (NFW) para preparar todos os reagentes necessários.
  2. Execute todas as etapas usando recipientes de plástico e sem o uso de vidro para reduzir a ligação do metal ao vidro e à contaminação do metal.
  3. Mantenha a área de trabalho bem limpa e borrife superfícies e pipetas com solução de descontaminação RNase, seguida de etanol 70% preparado com NFW.
  4. Conjugar sondas de detecção de mRNA tiolado (T1-T12) a metais adequados por meio de um ligante de malemida, conforme descrito por Schulz et al7, mais detalhado em protocol.io na Tabela de Materiais.
    NOTA: Os alvos proteicos devem ser escolhidos para indicar a localização de uma célula dentro do tecido (marcadores estruturais), identificar quais células estão presentes (marcadores fenotípicos) e o que as células estão fazendo (marcadores funcionais). Como alguns marcadores funcionais são expressos transitoriamente, a inclusão de alvos de mRNA permite a identificação de células geradoras desses alvos.

2. Preparação e pré-processamento de amostras

  1. Cozer secções de tecido durante a noite num forno seco a 60 °C.
  2. Realize a desparafinização: Três rodadas de xileno por 5 min cada rodada e 10 rodadas de reidratação (100% etanol (EtOH) x2, 95% EtOH x2, 70% EtOH x2, 50% EtOH x2, 30% EtOH x2), por 3 min cada rodada. Lave com 1x solução salina tamponada com tris (TBS) por 2 min, uma vez. De acordo com quantas amostras estão sendo processadas ao mesmo tempo, utilize tubos cônicos de 50 mL (máximo de 2 lâminas) ou de coloração IHC de 350 mL (máximo de 24 lâminas).
    NOTA: Esta etapa de desparafinagem, embora recomendada, é opcional e depende do tipo de tecido.
  3. Aplique uma solução de paraformaldeído (PFA) a 3,7% por 10 min, incubando as lâminas de tecido em um tubo de 50 mL com solução de PFA suficiente para cobrir a seção do tecido.
  4. Recuperação de antígeno induzido por calor (HEIR) usando micro-ondas: Usando um micro-ondas com temperatura monitorada, encha uma bandeja com tampão de recuperação de antígeno HEIR pH 6 (350 mL) e as bandejas restantes com NFW. Coloque as seções de tecido em uma prateleira de coloração para lâminas de microscópio e adicione-as à bandeja com tampão de recuperação de antígeno.
    NOTA: Ao realizar a recuperação do antígeno, certifique-se de que o tampão de recuperação do antígeno esteja em temperatura ambiente (RT) antes de usar.
  5. Realize a recuperação do antígeno a 107 ° C por 15 min e, em seguida, deixe as lâminas de tecido esfriarem em RT por 20 min em uma capa química.
  6. Durante a recuperação do antígeno, enxágue o papel umidificador em água, coloque-o em uma bandeja de coloração deslizante de controle de umidade e coloque a bandeja em um forno de hibridização a 60 ° C.
  7. Enxágue as lâminas em TBS sem RNase por 3 min e, em seguida, seque as lâminas por 3 min.

3. Tratamento de protease

  1. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor de cada seção de tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica. Deixe a barreira secar completamente por aproximadamente 2 min.
  2. Carregue as lâminas secas no suporte da corrediça da bandeja de umidade abrindo o giro clamp.
  3. Adicione gotas suficientes de protease para cobrir inteiramente a seção do tecido. Remova a bandeja de controle de umidade pré-aquecida (60 °C, etapa 2.6) do forno de hibridização e insira o suporte deslizante na bandeja de controle de umidade. Feche novamente a bandeja de controle de umidade e coloque-a de volta no forno de hibridização. Incubar a 40 °C durante 30 min.
  4. Durante esta incubação, prepare os materiais do ensaio RNA-ISH.
    1. Prepare 500 mL de tampão de lavagem 1x RNA-ISH diluindo o estoque 50x com NFW. Armazene na RT por até um mês.
      NOTA: Se ocorrer precipitação no tampão de lavagem 50x, ressuspenda aquecendo o tampão a 40 °C por 10-20 min antes de preparar o tampão de lavagem 1x.
  5. Prepare 1 L de DTBS-T (0,5% Tween) em NFW adicionando 5 mL de Tween a 1 L de DPBS-T.
  6. Prepare sondas-alvo emparelhadas com RNA-ISH ZZ:
    1. Aqueça os estoques de sonda de mRNA e o diluente de RNA-ISH a 40 ° C em um forno seco por 10 min. Vortex as sondas e gire-as em uma minicentrífuga de bancada.
    2. Prepare 1x mistura (até 12 sondas, Tabela 1) diluindo as sondas 50x em diluente RNA-ISH, certificando-se de ter volume final suficiente para cobrir toda a seção do tecido.
    3. Vortex bem e deixe as sondas mistas e o diluente de RNA-ISH em RT até o uso.
  7. Remova a bandeja de controle de umidade do forno de hibridização e remova o suporte da corrediça. Retorne a bandeja ao forno.
  8. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em NFW com leve agitação por 5 min.
  9. Repita a etapa de lavagem com NFW fresco por 5 min.

4. Hibridização de sondas alvo

  1. Remova o excesso de líquido das lâminas. Remova a bandeja de controle de umidade do forno e coloque o suporte deslizante na bandeja.
  2. Adicione o suficiente da mistura de sonda apropriada para cobrir inteiramente cada seção de tecido. Feche a bandeja e coloque-a no forno por 2 h a 40 °C.
  3. Coloque o reagente RNA-ISH Amplifier 1 (árvores de cauda ZZ para caudas T1 a T4) para equilibrar em RT 30 min antes do final da incubação, para usar na etapa 5.2.
  4. Assim que a incubação estiver concluída, remova a bandeja de controle de umidade do forno de hibridização e remova o suporte da lâmina. Retorne a bandeja ao forno.
  5. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem com leve agitação por 2 min.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1x Wash Buffer fresco por 2 min em RT.

5. Hibridizar amplificador RNA-ISH 1

  1. Remova o excesso de líquido das lâminas e coloque-as no suporte da lâmina da bandeja de umidade. Insira o suporte deslizante na bandeja de controle de umidade.
  2. Amplificador de vórtice RNA-ISH 1 e adicione-o para cobrir inteiramente cada seção. Feche a bandeja e insira-a no forno de hibridização por 30 min a 40 °C. Coloque o reagente RNA-ISH Amplifier 2 (árvores de cauda ZZ para caudas T5 a T8) em RT, para usar na etapa 6.2.
  3. Remova a bandeja de controle de umidade do forno de hibridização e remova o suporte da corrediça. Retorne a bandeja ao forno.
  4. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem com leve agitação por 2 min.
  5. Repita a etapa de lavagem com tampão de lavagem fresco 1x por 2 min em RT.

6. Hibridizar amplificador RNA-ISH 2

  1. Remova o excesso de líquido das lâminas. Remova a bandeja de controle de umidade do forno e coloque o suporte deslizante na bandeja
  2. Amplificador de vórtice RNA-ISH 2 e adicione-o para cobrir cada seção. Feche a bandeja e insira-a no forno de hibridização por 30 min a 40 °C.
  3. Coloque o RNA-ISH Amplifier 3 (árvores de cauda ZZ para caudas T9 a T 12) reagente em RT, para usar na etapa 7.2. Remova o suporte deslizante da bandeja. Coloque a bandeja de volta no forno.
  4. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem com leve agitação por 2 min.
  5. Repita a etapa de lavagem com tampão de lavagem fresco 1x por 2 min em RT.

7. Hibridizar amplificador RNA-ISH 3

  1. Remova o excesso de líquido das lâminas. Remova a bandeja de controle de umidade do forno e coloque o suporte deslizante na bandeja
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 e adicione-o para cobrir inteiramente cada seção. Feche a bandeja e insira-a no forno de hibridização por 30 min a 40 °C.
  3. Durante a incubação, prepare a mistura de oligos metálicos para a etapa 8. Cada oligo é usado na concentração de 1:15 (a partir do estoque de 10uM, certificando-se de ter volume final suficiente para cobrir toda a seção do tecido). Vortex bem e deixe os oligos de metal misturados em RT até o uso. Retire a bandeja de controle de umidade do forno e, em seguida, remova o suporte deslizante da bandeja. Depois, coloque a bandeja de volta no forno
  4. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem com leve agitação por 2 min.
  5. Repita a etapa de lavagem com 1x Wash Buffer fresco por 2 min em RT.

8. Hibridizar oligos metálicos

  1. Remova o excesso de líquido das lâminas. Remova a bandeja de controle de umidade do forno e coloque o suporte deslizante na bandeja. Adicione oligos metálicos mistos preparados na etapa 7.3 (vórtice antes do uso).
  2. Feche a bandeja e insira-a no forno de hibridização por 45 min a 40 °C.
  3. Remova a bandeja de controle de umidade do forno de hibridização e remova o suporte da corrediça. Retorne a bandeja ao forno.
  4. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem com leve agitação por 2 min.
  5. Repita a etapa de lavagem com 1x Wash Buffer fresco por 2 min em RT.

9. Anticorpos conjugados com metal

  1. Para bloquear locais não específicos, aplique volume suficiente de tampão de bloqueio para cobrir toda a seção do tecido e incube por 30 min em RT.
  2. Durante a incubação, prepare a mistura de anticorpos a ser usada na etapa 10.1 diluindo os anticorpos (Tabela 1) em tampão diluente de anticorpos.

10. Incubação com anticorpos conjugados metálicos

  1. Depois de bloquear a incubação do tampão, descarte o tampão de bloqueio das lâminas de tecido e dispense volume suficiente da mistura de Ab (da etapa 9.2) para cobrir toda a seção do tecido.
  2. Coloque a lâmina em uma câmara de umidade e incube durante a noite (~16 h) a 4 °C.

11. Coloração de DNA

  1. Prepare uma nova solução Ir-Intercalator.
    1. A partir de uma solução de estoque de 500 μM, prepare uma solução de trabalho 1:2000 em TBS livre de RNase. A solução de trabalho pode ser aliquotada e armazenada a -20 °C (não congelar-descongelar).
  2. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em tampão TBS-T com leve agitação por 5 min.
  3. Repita a lavagem em TBS-T.
  4. Lâminas de coloração com solução de trabalho Ir (da etapa 11.1.1) por 5 min em RT.
  5. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas transparente pré-lavado com NFW. Lave as lâminas em tampão TBS-T com leve agitação por 5 min.
  6. Repita a lavagem em TBS-T.
  7. Lave duas vezes em TBS, 5 min (mexa lentamente).
  8. Mergulhe a lâmina rapidamente em ddH2O para evitar a cristalização dos sais presentes no TBS no tecido.
  9. Secar a lâmina sob uma capa química (10 min) e conservar a 4 °C até à aquisição da imagem.

12. Aquisição de imagem

  1. Carregue a corrediça na câmara de ablação do IMC.
  2. Capture uma imagem panorâmica para identificar a região de interesse (ROI).
  3. Mapeie os ROIs no software de aquisição de imagens.
  4. Aplique o modelo de aquisição.
  5. Ajuste a potência do laser (energia de ablação) com base no tipo de amostra. O padrão é definido em 0 dB.
    NOTA: É aconselhável testar a energia de ablação com várias pequenas áreas de tecido (30 μm x 30 μm), aumentando a potência em 1 dB de cada vez. Selecione a energia de ablação mais baixa que limpa a amostra sem queimar na lâmina. Normalmente, isso resulta em uma potência de laser de 3-4 dB. Ocasionalmente, se o tecido for mais espesso do que o recomendado, a potência do laser aumentará para 5 dB.
  6. Inicie a ablação a laser. O sistema direciona o laser para o ROI e elimina as proteínas marcadas com metal, gerando plumas de aerossol que são transferidas para a tocha de plasma indutivamente acoplado (ICP), onde as plumas são vaporizadas, atomizadas e ionizadas no plasma.
  7. Meça a quantidade de cada isótopo que é medida pelo detector e convertida em dados.

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Resultados

A capacidade de detectar proteína e mRNA no mesmo ensaio nos ajuda a entender como a célula está se preparando para uma chegada, mas também quais filas ela está recebendo enquanto viaja e interage com seu ambiente. Como visto nos dados representativos, a detecção de mRNA e proteínas são componentes críticos na pesquisa de biologia espacial, pois os limites inferiores de detecção podem ser bastante desafiadores com base na forma como as etapas de marcação, detector e/ou imagem progridem. ...

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Discussão

A multiômica multiplex é uma evolução crítica nos dados coletados, visando as interações célula a célula e célula a vizinhança que afetam a progressão e o tratamento da doença. Analisar esses dados na mesma amostra e, portanto, na mesma célula é crítico, pois muitos alvos proteicos são expressos transitoriamente ou diferem no nível de expressão de mRNA e proteína, trazendo assim uma detecção de mRNA direcionada combinada com proteína permite a acomodação de alvos difíceis de detectar ou ...

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Divulgações

Jared K. Burks é consultor da Standard BioTools.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi realizada em colaboração com o Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, que é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde por meio do MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672. Esta pesquisa também foi apoiada em parte pelo Prêmio de Desenvolvimento de Subsídio de Apoio do MD Anderson's Cancer Center, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. O esforço do JKB foi apoiado em parte pelo P30 CA016672 e pelo NCI Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1. O esforço do SFB foi apoiado em parte pela Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), The Honorable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research, o MDACC Ovarian Cancer SPORE Developmental Research Program, NIH 1R01CA261952-01A1. O esforço SFB, JKB e BG foi apoiado em parte pela doação 1U01CA294459-01. Os autores gostariam de agradecer a Samuel Mok, que seccionou e forneceu as amostras utilizadas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Conjugação oligonucleotídeo-polímero para citometria de massa de imagem V.2 
10x TBS sem RNAseThermo Fisher Scientific J62780. K7Para lavagens intermitentes entre etapas
Sistema de Hibridização ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Forno para lâminas de papel de assamento
Diluente de AnticorposDakoS0809 Buffer diluente de anticorpos
Anticorpo: B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFClone: BLR025F, BLR026F
Anticorpo: B7-H4Thermo Fisher Scientific 14-5949-82Clone: H74
Anticorpo: BRD4(6F11)BethylA700-005CFClone: BL-151-6F11
Anticorpo: CCR6R& DMAB195-100Clone: 53103
Anticorpo: CD11bAbcam ab209970Clone: EPR1344
Anticorpo: CD25Abcam ab215378Clone: EPR6452
Anticorpo: CD278/ICOSCST 89601BFClone: D1K2T
Anticorpo: CD31Abcam AB207090Clone: EPR3094
Anticorpo: CD33Abcam ab238784Clone: SP266
Anticorpo: CD3e & nbsp;CST85061BFClone: D7A6E
Anticorpo: CD4Abcamab181724Clone: EPR6855
Anticorpo: CD44Thermo Fisher Scientific MA1-10225Clone: IM7
Anticorpo: CD45Thermo Fisher Scientific 14-9457-82Clone: CD45-2B11
Anticorpo: CD8aCST 85336BFClone: D8A8Y
Anticorpo: CXCL13R& DAF801Clone: Policlonal
Anticorpo: CXCR5R& DMAB190-100Clone: CXCR5
Anticorpo: gamma-H2AXBethylA700-053CFClone: BLR053F
Anticorpo: Granzima BSanta CruzSC-8022 XClone: 2C5
Anticorpo: KAP1BethylA700-014CFClone: BL-248-2G6
Anticorpo: Ki67BethylA700-021CFClone: BLR021E
Anticorpo: LCK & nbsp;CST2984BFClone: D88
Anticorpo: MFAP5N/AN/APMID: 31332047 / Clone: 130A & nbsp; (Nota: projetado sob medida) 
Anticorpo: SMACST56856BFClone: 1A4
Anticorpo: VEGFSTB-Fluidigm3163028DClone: G153-494
Anticorpo: VISTACST64953BFClone: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKBuffer de recuperação de antígeno
Álcool Etílico 100% (200 Proof)Pharmco111000200Para a desparafinização
EZ & ndash; Retriever IRBioGeneXMW016-IRSistema de Coleta de Antígeno para Seções de Tecido FFPE
Sistema de Hibridização HybEZ IIACD Biotechne321710O sistema compreende: forno HybEZ (PN 321710/321720), uma bandeja de controle de umidade (PN 310012) e Papel Umidificador HybEZ (2 folhas PN 310025), Bandeja de Lavagem EZ Batch (PN 321717), Suporte de Ferrolho EZ Batch (PN 321716)
Caneta PAP de Barreira Hidrofóbica ImmEdge & nbsp;VectorLabsH-4000Cerca-barreira hidrofóbica
Solução Intercalador IrThermo Fisher Scientific NC1038184Usado para identificar células nucleadas
KERATIN 18/08CST 4546BFClone: C51
Metal OligosVáriosVáriosEtiqueta metálica variando de T1 a T12, dependendo de qual for necessária
Água livre de nuclease (NFW)Corning 46-000-CM Limpar e preparar todos os equipamentos, e usar como diluiente quando necessário
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 Usado para permeabilizar membranas celulares de amostras
Suporte de lâminas de lote EZ RNAscopeACD Biotechne310017Projetado para processar manualmente em lote até 20 slides de forma eficiente
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 ACD Biotechne324409Reagentes para RNAScope
Sonda RNAscope HiPlex - Sondas-alvoACD BiotechneVáriosVaria de T1 a T12, dependendo de qual é necessário
Solução de Descontaminação RNase RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9782Uma solução de descontaminação superficial que destrói RNases
Suporte para cesta de lâminas para microscópio de coloração 24 lugares Plástico resistente a produtos químicosCiência Ótima3028Para colorir múltiplos slides
Tween 20Thermo Fisher Scientific AAJ20605APPara lavagens intermitentes entre etapas
Bloqueio de Proteína UltravisãoThermo Fisher Scientific TA125PBQBuffer de bloqueio

Referências

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