É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

744 vistas

⸱

DOI:

10.3791/68617

⸱

7 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Resumo

Ao usar métodos tradicionais de detecção de imagem de hibridização in situ (ISH) baseados em sonda, os microRNAs (miRNAs) são difíceis de capturar devido ao seu tamanho, que varia de 19 a 25 nucleotídeos. No entanto, como os miRNAs são reguladores epigenéticos chave que contribuem para a fisiologia normal e inúmeras condições patológicas, entender o comportamento espaço-temporal dos miRNAs é importante para desvendar sua função nos níveis celular e subcelular. Isso cria uma clara necessidade de técnicas adequadas de detecção e visualização. Portanto, criamos a amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado (MARLIN), que foi desenvolvida e otimizada utilizando coloração de imunofluorescência multiplex e sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) direcionadas a um miRNA. Este método pode quantificar miRNAs com expressão de proteínas multiplexadas, o que permite a quantificação de miRNAs intracelulares e extracelulares dentro do microambiente tumoral (TME) com alta sensibilidade e reprodutibilidade. O uso combinado de ensaios de detecção de miRNA e captura de proteínas também pode fornecer uma compreensão abrangente das funções celulares e mecanismos regulatórios dentro desse TME.

Introdução

microRNAs
Embora os microRNAs (miRNA) sejam incrivelmente pequenos, variando de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento, essas moléculas de RNA de fita simples são potentes reguladores na expressão gênica, modulando RNAs mensageiros (mRNAs) pós-transcricionalmente por meio de interações específicas de sequência1. Em essência, os miRNAs atuam como reguladores negativos ligando-se aos mRNAs alvo, impedindo sua tradução ou promovendo sua degradação por meio da clivagem do mRNA, dependendo do grau de complementaridade, o que acaba levando à diminuição da produção de proteínas do gene alvo. Embora os miRNAs sejam basicamente RNA não codificante, aproximadamente 40% de todos os miRNAs ainda são encontrados em íntrons ou éxons de genes codificadores de proteínas2. O propósito funcional dos miRNAs abrange vários processos biológicos importantes, como proliferação celular, angiogênese, apoptose, etc. Notavelmente, a desregulação de miRNAs tem sido implicada na tumorigênese, pois a expressão aberrante de miRNAs específicos e a regulação gênica mediada por miRNA têm sido associadas à transformação oncogênica em vários tipos de câncer3.

Desde sua descoberta, os miRNAs têm sido extensivamente pesquisados em várias doenças devido à sua expressão específica do tecido e funções regulatórias, com sua desregulação ligada a muitas doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos, distúrbios autoimunes e vários tipos de câncer 4,5,6. Os padrões de expressão dos miRNAs podem ser correlacionados com o tipo, estágio e variáveis clínicas do câncer, tornando o perfil do miRNA uma ferramenta valiosa para o diagnóstico e prognóstico do câncer 4,5,6,7. A descoberta de novos miRNAs também foi acelerada por avanços nas tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, aprimorando a compreensão do envolvimento dos miRNAs em diversos processos biológicos8. A importância dos miRNAs foi ressaltada pelo Prêmio Nobel de Medicina de 2024 concedido a Victor Ambros e Gary Ruvkun por sua descoberta da função do miRNA na regulação pós-transcricional9.

Como biomarcadores valiosos para o diagnóstico e prognóstico de doenças, o potencial terapêutico dos miRNAs tem sido explorado, levando ao desenvolvimento de drogas direcionadas a miRNAs. O potencial terapêutico dos miRNAs no tratamento do câncer reside em sua capacidade de regular coordenadamente os módulos dos genes, potencialmente restaurando as funções celulares normais10. Anteriormente, as terapias anticancerígenas baseadas em miRNA foram desenvolvidas como monoterapia ou em combinação com terapias direcionadas existentes para melhorar as respostas ao tratamento e aumentar as taxas de cura11. O espectro dinâmico dos miRNAs os posicionou como recursos essenciais para estratégias inovadoras de tratamento do câncer. No contexto da resistência terapêutica, o direcionamento de miRNAs tem se mostrado promissor na redução da recorrência e resistência aos tratamentos tradicionais contra o câncer, potencialmente melhorando a sobrevida do paciente ao direcionar as células cancerígenas12. Ao explorar os papéis dos miRNAs na modulação das atividades de vários tipos de células no microambiente tumoral (TME), tratamentos de câncer únicos e clinicamente relevantes podem ser descobertos.

Ensaios disponíveis para detectar miRNAs
Atualmente, o método mais comum para medição de miRNA depende do RNA extraído para PCR quantitativo em tempo real (q-RT-PCR) ou Sequenciamento de Nova Geração (NGS), perdendo contexto espacial. Existem empresas que fornecerão ensaios de microRNA TaqMan, que usam primers de alça de haste específicos para síntese de cDNA, e produtos químicos à base de corante SYBR Green com síntese universal de cDNA. Esses ensaios podem oferecer alta sensibilidade e especificidade e podem ser executados em uma variedade de instrumentos q-RT-PCR. Infelizmente, os ensaios TaqMan não podem fornecer quantificação absoluta, o que pode levar a problemas como falsos positivos e variabilidade nos resultados13. Além disso, apesar de sua alta sensibilidade, a aplicação desses ensaios em diferentes tipos de amostra pode ser limitada pela necessidade de preparação extensiva da amostra e potencial interferência de outros componentes da amostra.

Sequenciamento de próxima geração (NGS): o miRNA-seq é cada vez mais popular para análise de expressão diferencial em todo o miRNome de biofluidos. Um benefício das tecnologias NGS como o miRNA-seq é que elas permitem análises paralelas massivas da expressão de miRNAs em todo o genoma, permitindo a quantificação de miRNAs individuais, a identificação de variações de sequência e a descoberta de novos miRNAs14. Uma desvantagem substancial dos métodos baseados em sequenciamento, como o IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit, é a indução de vieses quantitativos, afetando a precisão das análises de expressão diferencial, devido em grande parte à homologia e menores comprimentos de leitura dos miRNAs14. Não apenas isso, mas a presença de isomiRs (variantes que diferem em sequência ou comprimento da sequência canônica de miRNA) e artefatos técnicos podem complicar a interpretação dos dados, potencialmente levando a detecções errôneas e fatores de confusão em ensaios de biomarcadores14. Além disso, diferentes ferramentas para análise de dados de miRNA-seq, como sRNAbench e miRDeep2, podem produzir resultados variados, afetando a consistência e a confiabilidade da descoberta de novos miRNAs15,16. Mesmo algo como a tecnologia de microarray pode ser insuficiente na maioria dos casos. Embora possa fornecer uma plataforma poderosa e de alto rendimento para detectar níveis de miRNA ou expressão gênica, tornando-a adequada para estudos de todo o genoma, a tecnologia ainda é limitada pelo número de miRNAs previamente identificados e não pode verificar diretamente as interações miRNA-alvo, o que limita sua utilidade em estudos funcionais17.

O fator mais importante que pode ser enfatizado aqui ao comparar todas essas opções disponíveis é a falta de contexto espacial. Eles não fornecem nenhum contexto em relação à morfologia do tecido ou distribuição espaço-temporal dentro das células. A visualização do comportamento espaço-temporal dos miRNAs é necessária para desvendar sua função nos níveis celular e subcelular. Atualmente, os ensaios de hibridização in situ ( ISH) do miRNAscope estão acessíveis, geralmente utilizando métodos de detecção cromogênica. Embora esses ensaios permitam a visualização de miRNA com resolução de célula única, os resultados carecem de qualidade, dificultando a diferenciação entre a expressão do miRNA e o fundo da amostra. Geralmente, muitos deles produzem ensaios de baixa qualidade, que não são confiáveis e geralmente requerem quantificação manual.

Portanto, desenvolvemos amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado (MARLIN) usando coloração de imunofluorescência multiplex (por coloração de proteína Opala) e sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) direcionadas a um miRNA, dentro de tecidos embebidos em parafina fixados em formalina (FFPE). Conseguimos isso implementando um sistema de amplificação de sinal de tiramida (TSA) que é ativado por um anticorpo conjugado anti-digoxigenina (DIG) peroxidase de rábano (HRP). O HRP atua como um catalisador para o TSA, enquanto o Anti-DIG se conecta à sonda LNA. Este ensaio é particularmente útil para entender a natureza essencial dos miRs na modificação pós-transcriptômica com proteínas e potencialmente outros RNAs simultaneamente. Além disso, devido à falta de um ensaio comercialmente disponível que possa quantificar a expressão de miRNA e proteína, o MARLIN fornece uma maneira eficaz de entender as relações in situ de miRs e proteínas em amostras de FFPE.

Os resultados iniciais da quantificação de miR-181c-3p usando MARLIN demonstraram a viabilidade da análise paralela de miRNAs e proteínas dentro do contexto espacial nativo do tecido FFPE ovariano humano. Além deste exemplo, com base nos componentes do MARLIN, é teoricamente possível expandir para até quatro proteínas utilizando fluoróforos multiplexadores fluorescentes comerciais como Alexa Fluor ou outros corantes de moléculas pequenas18.

Além disso, uma vez que esta metodologia emprega variações nos métodos histológicos padrão, deve ser compatível com outros tecidos FFPE de mamíferos, dada a seleção apropriada de sonda e anticorpos. Essa metodologia preserva a arquitetura espacial e permite a quantificação de miRNAs celulares e subcelulares e colocalização de proteínas. Essa abordagem aborda uma lacuna crítica na biologia espacial, mapeando padrões de co-expressão miRNAs-proteínas e distribuição espacial, que podem ser diretamente contextualizados em arquiteturas de tecidos nativos. Aqui apresentamos o MARLIN com uma visão geral gráfica detalhada na Figura 1. Embora o protocolo apresentado seja otimizado para miR-181c-3p, outros miRs são possíveis de estudar, dado um design de sonda apropriado. Os parâmetros críticos para este método incluem: a avaliação da qualidade do tecido e a otimização das concentrações da sonda. Recomenda-se avaliar a integridade do RNA do bloco tecidual usando uma métrica DV200, utilizando duas seções de 10 μm e extraindo o RNA usando um protocolo que preserva todos os tamanhos de fragmentos de RNA. Amostras com pontuação DV200 superior a 50 ou melhor e concentrações de protocolo precisam ser testadas sistematicamente.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Este protocolo usa tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de seções de tecido tumoral de ovário humano de pacientes com HGSC. Essas amostras foram coletadas de pacientes não tratadas anteriormente submetidas à cirurgia citorredutora primária para câncer de ovário. Todas as amostras e dados clínicos foram obtidos do repositório de câncer de ovário do Departamento de Oncologia Ginecológica e Medicina Reprodutiva sob protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Texas MD Anderson. O consentimento informado por escrito dos pacientes foi obtido pela equipe da recepção e os estudos foram conduzidos de acordo com diretrizes éticas reconhecidas.

1. Preparação de tecidos

  1. Asse todas as amostras FFPE durante a noite a 60 ° C e limpe cada equipamento e ferramentas com água livre de RNAse. Certifique-se de que as seções tenham cerca de 5 μm de espessura.
    NOTA: Este protocolo foi otimizado para tumores ovarianos, mas pode ser usado com outros tipos de tecido após testes adicionais.
  2. Realize a desparafinização com três rodadas de xileno por 5 min cada rodada e 10 rodadas de reidratação por 3 min cada rodada (100% etanol (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). Lave com 1x solução salina tamponada com tris (TBS) por 2 min, uma vez.
    NOTA: Esta etapa de desparafinagem, embora recomendada, é opcional e depende do tipo de tecido.
  3. Após desparafinização e reidratação, aplique uma solução de Peróxido de Hidrogênio a 3% (H2O2) por 10 min. Lave por 2 min com 1x TBS, 2x. Em seguida, aplique uma solução de Paraformaldeído (PFA) a 3,7% por 10 min. Lave por 2 min com 1x TBS, 2x.
    NOTA: Esta etapa é opcional e só deve ser considerada para tecidos adiposos ou amostras propensas a descolamento.
  4. Prossiga para a primeira rodada de recuperação de antígeno. Este protocolo usa o sistema IR EZ-Retriever. Seguindo as instruções do sistema, coloque as amostras no micro-ondas enquanto submersas em tampão EZ-AR1 fresco a 95 °C por 15 min. Deixe esfriar por 20 min.
  5. Lave por 2 min com 1x TBS. Em seguida, por 2 min com 1x TBS-T (1x TBS com 0,1% de interpolação), 2x.

2. Aplicação de proteínas

  1. Desenhe uma barreira ao redor de cada seção de tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica.
  2. Adicionar 1x solução de bloqueio de anticorpos (suficiente para cobrir toda a área do tecido) e incubar por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara de umidade (umidade ambiente e descontrolada).
  3. Em seguida, diluir o primeiro anticorpo primário com a mesma solução de bloqueio, aplicar o suficiente para cobrir toda a área do tecido e deixar incubar por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara de umidade.
    NOTA: Durante o desenvolvimento deste protocolo, o Anti-CD8 foi usado em uma diluição de 1:75.
  4. Lave por 2 min em 1x TBS-T, 3x. Em seguida, adicione o Anti-Ms + Rb HRP e deixe as amostras incubarem por 10 min em temperatura ambiente em uma câmara de umidade (umidade ambiente e não controlada).
  5. Lave por 2 min em 1x TBS-T, 3x. Diluir o primeiro fluoróforo com o diluente de amplificação a 1:100 e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente na câmara de humidade.
    NOTA: Durante o desenvolvimento deste protocolo, foi utilizado um fluoróforo de emissão de 690 nm. A partir deste ponto, recomenda-se usar iluminação mínima para o resto do procedimento após a aplicação da primeira rodada de fluoróforo.
  6. Lave por 2 min em 1x TBS-T, 3x. Comece a segunda rodada de coloração de anticorpos com a segunda rodada de recuperação de antígeno no micro-ondas, submergindo novamente as amostras em tampão EZ-AR1 fresco a 95 ° C por 15 min e depois resfriando por 20 min.
  7. Lave por 2 min com 1x TBS. Em seguida, lave por 2 min com 1x TBS-T, 2x.
  8. Aplique a solução de bloqueio de anticorpos 1x novamente por 30 min em uma câmara de umidade à temperatura ambiente (umidade ambiente e não controlada).
  9. Diluir o segundo anticorpo primário com a mesma solução de bloqueio, aplicar o suficiente para cobrir toda a área do tecido e deixar incubar durante a noite a 4 °C numa câmara de humidade durante pelo menos 16 h.
    NOTA: Durante o desenvolvimento deste protocolo, o Anti-EpCAM foi usado em uma diluição de 1:200.
  10. Comece no dia seguinte lavando por 2 min em 1x TBS-T, 3x. Em seguida, adicione o Anti-Ms + Rb HRP e deixe as amostras incubarem por 10 min em temperatura ambiente em uma câmara de umidade (umidade ambiente e não controlada).
  11. Lave por 2 min em 1x TBS-T, 3x. Diluir o segundo fluoróforo com o diluente de amplificação a 1:100 e incubar durante 10 min à temperatura ambiente na câmara de humidade.
    NOTA: Durante o desenvolvimento deste protocolo, foi utilizado um fluoróforo de emissão de 620 nm.

3. Aplicação da sonda

  1. Lave por 2 min em 1x TBS-T, 3x.
  2. Inicie a terceira e última recuperação do antígeno com EZ-AR1 Elegance no micro-ondas a 107 °C por 15 min. Deixe esfriar por 20 min. Lave por 3 min em 1x TBS.
  3. Aplicar RNAscope Protease Plus (suficiente para cobrir toda a área do tecido) e manter a 40 °C durante 30 min. Use um forno. Lave por 5 min em 1x TBS, 2x.
  4. Realize a preparação da sonda por desnaturação a 90 ° C por 4 min da sonda de miRNA LNA. Em seguida, dilua imediatamente a sonda usando tampão miRNA-ISH. Vórtice e gire a solução da sonda.
    NOTA: Durante o desenvolvimento deste protocolo, a sonda alvo miR-181c-3p foi usada em uma diluição de 1:250.
  5. Aplique a sonda (o suficiente para cobrir toda a área do tecido) e coloque de volta no forno por 1 h a 60 °C. Lave por 5 min em tampão 5x Citrato de Sódio Salino (SSC).
  6. Realize cinco lavagens rigorosas em SSC pré-aquecido a 60 ° C na seguinte ordem e diluições por 5 min em cada rodada: uma rodada de 5x SSC, duas rodadas de 1x SSC e duas rodadas de 0,2x SSC.
  7. Lave por 5 min em SSC 0,2x em temperatura ambiente. Incubar com tampão de bloqueio por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Use uma combinação de 1x TBS e 0,5% de pó de reagente bloqueador, certifique-se de vórtice e gire a solução de bloqueio antes da aplicação.
  8. Aplique um conjugado HRP anti-digoxigenina (camundongo) (para essas amostras, foi utilizada uma diluição de 1:500) e incube por 30 min em temperatura ambiente em câmara umidificada.
  9. Lave por 5 min em 1x TBS-T, 3x Aplique uma diluição recomendada de 1:50 do fluoróforo Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) por 10 min em uma câmara de umidade em temperatura ambiente (umidade ambiente e não controlada). Certifique-se de que faz vórtice e centrifugação da solução TSA+Cy3 antes da aplicação.
  10. Lave por 5 min em 1x TBS-T, 3x.

4. Coloração e montagem nuclear

  1. Aplicar a solução de trabalho 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (suficiente para cobrir toda a área do tecido) durante 5 min à temperatura ambiente numa câmara humidificada (humidade ambiente e não controlada).
    NOTA: Para este protocolo, foi utilizada uma diluição de 1:1000, com o estoque DAPI de trabalho diluído em TBS.)
  2. Lave por 5 min em 1x TBS-T, 3x. Ao finalizar, aplique lamínulas usando mídia de montagem e deixe as lâminas secarem por 10 min. Armazene as lâminas a 4 °C no escuro entre 24-72 h antes da imagem e até três meses depois.

5. Imagem e análise

  1. Para imagens, use um microscópio de varredura de lâminas (preferencial) com ampliação de 40x.
  2. Realize análises quantitativas subsequentes para enumerar pontos utilizando DAPI e contracoloração de proteínas para segmentação celular e fenotipagem.
    NOTA: Durante este protocolo, utilizamos imagens com um Phenoimager HT. As varreduras de lâminas completas foram capturadas com uma ampliação de 40x utilizando filtros apropriados para os fluoróforos presentes, e as imagens multiplexadas foram então exportadas como arquivos OME-TIFF. As imagens digitalizadas foram então carregadas no software de análise de imagem Visiopharm para análise quantitativa.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Ao testar este protocolo, é importante ter duas seções seriais da mesma amostra representativa para precisão e comparação. Nesse caso, uma amostra de câncer de ovário de alto grau (HGSC) foi usada para comparar os resultados. Foram utilizadas uma lâmina de controle (Figura 2A-B) que passaria apenas pela coloração de miRNA e uma lâmina de teste que passaria pela coloração de proteína e miRNA (

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Embora a importância dos miRNAs seja reconhecida e compreendida, as observações do desenvolvimento normal e dos estados de doença são atualmente prejudicadas pela dificuldade de estudar os miRNAs usando métodos padrão. A escassez de métodos in situ levou ao desenvolvimento do MARLIN (ensaio de miRNA FISH). Dada a homologia e o curto comprimento dos miRNAs, torna-se um desafio visualizar sua localização e efeito na regulação pós-transcriptômica. O desenvolvimento deste protocolo ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer às seguintes pessoas, Chi Lam Au Yeung e Manjunath Nimmakayalu, que fizeram parte do comitê de tese de Basant enquanto o ensaio estava em desenvolvimento. Além disso, Samuel Mok, que seccionou e forneceu as amostras utilizadas. Por fim, agradecemos a Johan Doré e Dan Winkowski, que prestaram ampla assistência durante a análise e o uso do software Visiopharm. Esta pesquisa foi financiada em parte pela Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), pela Sie Foundation e pelo Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Esta pesquisa foi realizada em colaboração com o Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, que é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde por meio do MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 e do Especialista em Pesquisa 1 R50 CA243707-01A1 do NCI de Jared Burks.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x SALO com TIS bufferizado (TBS) pH 7,6 Thermo Fisher Scientific  J62662  K7Para lavagens intermitentes entre etapas
1x Diluente/Bloqueio de Anticorpos Opal/nbsp;Akoya BiosciencesARD1001EASolução bloqueadora de proteínas
Diluente de Amplificação de Automação 1x PlusAkoya Biosciences FP1609Usado para diluir fluoróforos de opala
20x Concentrado  Tamponador de Citrato de Sódio Salino (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LPara lavagens de miRNA após hibridização com sonda
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Thermo Fisher Scientific/InvitrogenEN62248 / 62248Para coloração nuclear
Sistema de Hibridização ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Forno usado para regular a temperatura durante o protocolo miRNAscope
Anti-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAbTecnologias de Sinalização Celular85336SExemplo de anticorpo primário usado para otimizar esse protocolo
Anti-Digoxigenina (Mouse) HRP conjugadoRevvity Health Sciences IncNEF832001EAReagente secundário usado para detecção de miRNA
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbTecnologias de Sinalização Celular93790Exemplo de anticorpo primário usado para otimizar esse protocolo
Pó de Reagente de BloqueioAkoya Biosciences FP1012Solução bloqueadora de miRNA
Álcool Etílico 100% (200 Proof)Pharmco111000200Para a desparafinização
EZ-AR1 BufferBioGeneXHK521-XAKUsado para coleta de antígeno em seções de tecido FFPE na etapa proteica
EZ-AR1 Elegance BufferBioGeneXHK546-XAKUsado para coleta de antígenos em seções de tecido FFPE na etapa da sonda de miRNA
Sistema IR EZ-RetrieverBioGeneXMW015-IRMicro-ondas usado para coleta de antígenos em seções de tecido FFPE
Solução de Água Oxigenada 30% Sigma-Aldrich HX0640-5 Para preparação de lenços. Ajuda a bloquear a atividade endógena da peroxidase e a produzir produtos altamente coloridos
Sonda de miRNA miR-181c-3pQiagen339112Exemplo de sonda de miRNA usada para otimizar esse protocolo
Conjunto de Buffer de miRNA miRNA miRCURY (FFPE)Qiagen339450 Usado para diluir a sonda de miRNA
Opal 620Akoya Biosciences FP1495001KTFluoróforo para identificar anticorpos primários
Opal 690 Akoya Biosciences FP1497001KTFluoróforo para identificar anticorpos primários
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EAAnticorpo secundário usado como agente de detecção
Pierce 16% Formaldeído (w/v), Livre de MetanolThermo Fisher Scientific28908Produzir 3,7% de PFA para preparação de tecidos
Antidesfaçamento de Diamante ProLongThermo Fisher ScientificP36970Mídia de montagem
RNAscope Protease PlusACD Biotechne322331Para permeabilizar seções de tecido   digerindo parcialmente proteínas & expor moléculas de miRNA alvo
Água livre de RNAse  Corning 46-000-CM Limpar e preparar todo o equipamento, e usar como diluiente quando necessário    
Tween 20Sigma-AldrichP1379-25MLPara fazer o TBS-T
Amplificação do Sinal de Tiramida Mais Cianina 3Akoya Biosciences NEL744001KTFluoróforo para identificar miRNA
Sondas de miRNA U6 e ScrambleQiagen339459Sondas de controle opcionais
Grau histológico dos xilenosThermo Fisher ScientificUN1307Para a desparafinização

Referências

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Detec o de microRNAImunofluoresc ncia MultiplexMicroambiente TumoralColocaliza o de Prote nasTecido FFPEAmplifica o de Sinal por Tiramidamica EspacialAnticorpo EpCAM
Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.