Detecção sequencial de biomoléculas em amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina com imagens por espectrometria de massa

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de imagem por espectrometria de massa para detecção de metabólito sequencial, glicano ligado a N e peptídeo tríptico em amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina.

Abstract

Os tecidos são ambientes celulares complexos, compostos por uma vasta gama de tipos de células e biomoléculas, todas interagindo entre si para realizar as funções do órgão. Tradicionalmente, as técnicas de análise de biomoléculas, como metabólitos, glicanos e proteínas, envolviam a homogeneização do tecido, destruindo todas as informações espaciais. Esses métodos tradicionais inibiram a compreensão completa de interações moleculares intra e extracelulares complexas. A imagem por espectrometria de massa (MSI), por outro lado, não apenas preserva as informações espaciais das biomoléculas no tecido, mas também permite que várias classes de analitos sejam detectadas na mesma seção de tecido por meio de análise sequencial em uma resolução quase de célula única. Isso nos permite obter uma imagem mais completa das interações moleculares em diferentes classes de biomoléculas. O protocolo apresentado aqui descreve as etapas para realizar imagens de espectrometria de massa de metabólitos, glicanos ligados a N e peptídeos trípticos sequencialmente da mesma seção de tecido com resolução de 20 μm. A consideração consciente da ordem em que as classes de analitos são fotografadas, juntamente com o manuseio cuidadoso das seções para garantir a integridade, permite que várias imagens de alta qualidade sejam coletadas da mesma seção. Esses dados podem ser posteriormente integrados a outros dados ômicos espaciais (transcriptômica, imuno-histoquímica, etc.) coletados de seções seriadas, onde a mesma célula pode ser analisada nessas seções adjacentes.

Introduction

A imagem por espectrometria de massa (MSI) é uma técnica poderosa que permite a detecção e visualização de centenas a milhares de biomoléculas de seções finas de tecido, sem a necessidade de conhecimento a priori das moléculas exatas presentes no tecido, tornando-se uma excelente ferramenta para a descoberta de biomarcadores¹. Embora vários tipos de MSI sejam usados por diferentes laboratórios, incluindo Ionização por Eletrospray de Dessorção (DESI)^2,3, Ionização por Eletrospray de Dessorção a Laser Assistida por Matriz Infravermelha (IR-MALDESI)⁴ e Espectrometria de Massa de Íons Secundários (SIMS)⁵, a Dessorção/Ionização a Laser Assistida por Matriz (MALDI) continua sendo a mais comumente usada e mais versátil. A maioria das classes de biomoléculas pode ser detectada por MSI adaptando a preparação da amostra, incluindo lavagem / pré-tratamento do tecido, digestão enzimática e a matriz / solvente usado ^6,7. MALDI MSI tem sido usado para a detecção de metabólitos, lipídios, glicanos, proteínas e peptídeos proteolíticos.

Os estudos MSI têm sido usados em uma variedade de estudos clínicos e pré-clínicos para entender melhor os mecanismos da doença ^8,9, melhorar a classificação e o estadiamento do câncer^10,11, prever o resultado do tratamento¹², melhorar o diagnóstico¹³ e determinar as margens moleculares do tumor¹⁴, entre outros. A maioria desses estudos se concentrou na detecção de apenas uma única classe de analitos. No entanto, muitas vezes é interessante analisar mais de uma classe de biomoléculas da mesma amostra. Tradicionalmente, isso tem sido realizado com cortes seriados de tecidos. Mas, mais recentemente, foram mostrados exemplos de análise sequencial de várias classes de analitos da mesma seção de tecido. Por exemplo, Yagnik et al. demonstraram imagens lipídicas de tecido congelado seguidas de imuno-histoquímica MALDI da mesma seção para classificação do tipo de célula¹⁵. Clift et al. mostraram aplicação sequencial de PNGaseF, colagenase e tripsina em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) para imagens de glicanos ligados a N, proteínas da matriz extracelular e proteínas gerais, respectivamente¹⁶. Escobar et al. demonstraram a análise sequencial de glicanos ligados a N, O-GlcNAc e peptídeos trípticos da mesma seção de tecido congelado¹⁷. Esses tipos de experimentos são realizados por meio de um planejamento experimental cuidadoso para analisar primeiro os analitos mais facilmente perdidos, seguidos por aqueles que são mais estáveis no tecido. Em muitos casos, as lavagens usadas para remover classes indesejadas de moléculas ajudam a melhorar outras classes de moléculas⁶, uma propriedade que pode ser aproveitada, onde cada lavagem que remove a matriz aplicada anteriormente também ajuda a melhorar o sinal da próxima classe de analitos a ser fotografada.

Recentemente, publicamos um fluxo de trabalho para a análise sequencial de metabólitos, glicanos ligados a N e peptídeos trípticos da mesma seção do tecido de câncer de ovário FFPE¹⁸. Aqui, apresentamos o fluxo de trabalho detalhado para a análise dessas três classes de biomoléculas da mesma seção de tecido; uma visão geral do protocolo é detalhada na Figura 1. Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo que descreve em detalhes esse fluxo de trabalho para imagens sequenciais do tecido FFPE. Resumidamente, as seções de tecido são desparafinadas com xileno antes de serem revestidas com matriz de 1,5-diaminonaftaleno (10 mg / mL em acetonitrila a 50%) para imagem de metabólitos de modo de íon negativo. A matriz é então removida, as seções reidratadas e recuperadas com antígeno, antes de serem pulverizadas com PNGase F (0,1 μg/μL em bicarbonato de amônio) para liberar glicanos ligados a N in situ. Após a incubação, as seções são revestidas com ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) (10 mg / mL em matriz de acetonitrila a 70%, ácido trifluoroacético a 0,1%) e fotografadas no modo de íon positivo. A matriz é então removida novamente, a reidratação e a recuperação do antígeno repetidas, e as seções são pulverizadas com tripsina (0,075 μg / μL em bicarbonato de amônio) e incubadas antes de serem novamente revestidas com matriz CHCA (10 mg / mL em acetonitrila a 70%, ácido trifluoroacético a 0,1%) e imagens em modo de íon positivo. Todas as soluções devem ser feitas frescas, imediatamente antes do uso e, se possível, os experimentos devem ser realizados durante 3 dias consecutivos. Se houver atrasos, as seções devem ser armazenadas em um freezer a -80 °C sob dessecação.

Protocol

Este protocolo usa tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) coletados de pacientes não tratados anteriormente submetidos a cirurgia citorredutora primária para carcinoma de ovário seroso de alto grau. Todos os dados clínicos foram obtidos do repositório de câncer de ovário do Departamento de Oncologia Ginecológica e Medicina Reprodutiva sob protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Texas MD Anderson. O consentimento informado por escrito dos pacientes foi obtido pela equipe da recepção e os estudos foram conduzidos de acordo com diretrizes éticas reconhecidas.

1. Preparação da amostra de imagem de metabólitos

NOTA: Este protocolo pressupõe que seções de tecido fixado em formalina e embebido em parafina (4 μm de espessura) já foram montadas em lâminas de microscópio de vidro, pois as amostras clínicas geralmente devem ser seccionadas dentro de um núcleo de patologia clínica por histotécnicos. Como o trabalho apresentado aqui é realizado no instrumento TOF referenciado, a medição ortogonal do TOF alivia a necessidade de lâminas condutoras tradicionalmente usadas em experimentos MSI. O uso de lâminas de microscópio padrão também é mais propício aos fluxos de trabalho padrão em laboratórios de patologia clínica, além de permitir o uso de tecido de arquivo já nas lâminas.

1. Faça marcas fiduciais nos quatro cantos do slide usando um escriba de diamante.
2. Desparafinizar cortes por submersão em xileno de grau histológico por 3 min.
   NOTA: O xileno é nocivo e deve ser usado em uma capela de exaustão química.
3. Mergulhe as seções em xileno fresco por 3 min.
4. Deixe a lâmina secar à temperatura ambiente.
5. Coloque o slide em um Slide Adapter Target.
6. Adquira uma imagem óptica da lâmina usando um scanner de mesa com resolução de 4.800 dpi.
7. Faça uma matriz MALDI dissolvendo 15 mg de 1,5-diaminonaftaleno (DAN) em 1,5 mL de ACN a 50%. Sonicar até dissolver completamente, ~5 min. Filtrar a solução da matriz antes de o carregar no circuito de amostras.
   NOTA: DAN é suspeito de ser cancerígeno e deve ser usado com equipamento de proteção individual adequado. A pulverização da matriz deve ser realizada em uma capela de exaustão química.
8. Pulverize a lâmina com solução DAN usando um Pulverizador Robótico Reagente com os seguintes parâmetros: Velocidade da Esteira - 1.200 mm/s; Espaçamento entre trilhos - 3 mm; Temperatura do bico - 60 °C; Altura do bico - 40 mm; Vazão - 100 μL/min; Passes - 4; N ₂ Pressão - 10 psi; Padrão - CC
9. Aplique 0,5 μL de fósforo vermelho suspenso em metanol em um local conhecido na lâmina.

2. Coleta de dados de imagem de metabólitos

1. Coloque a(s) lâmina(s) preparada(s) em um Adaptador de Lâmina II e carregue em um espectrômetro de massa timsTOF fleX MALDI QTOF.
2. Carregue o método apropriado para coleta de dados do modo de íon negativo em timsControl com tims OFF. Se o instrumento ainda não estiver no modo de iões negativos, aguarde pelo menos 25 minutos após a comutação de polaridade para o equilíbrio antes da calibração e recolha de dados com os seguintes parâmetros do instrumento para os metabolitos: gama m/z - 50 - 600; Faixa de varredura a laser - 16,0 μm em X e Y; Tamanho do campo resultante - 20,0 μm em X e Y; Tiros de laser - 150; Fluência do laser - ~ 30%; Funil 1 RF - 150,0 Vpp; Funil 2 RF - 200,0 Vpp; RF multipolar - 200,0 Vpp; Energia de colisão - 10,0 eV; Colisão RF - 500,0 Vpp; Tempo de transferência - 55,0 μs; Armazenamento pré-pulso - 5,0 μs (Figura suplementar S1).
3. Execute um Perfil de destino (clique no botão Gerar agora ) e Ajuste de foco (clique no botão Ajustar agora ) na guia Portadora de amostra. Ajuste a posição do laser em X e Y, se necessário na guia do laser para garantir que o laser esteja exatamente alinhado com a mira.
4. Colete um espectro de fósforo vermelho somando pelo menos cinco conjuntos de tiros de laser do ponto na lâmina.
5. Execute uma calibração clicando no botão Calibrar na guia Calibração. Remova quaisquer picos com intensidade muito baixa ou erro de ppm alto.
   NOTA: Mesmo os aglomerados de fósforo (P2 e P4) geralmente dão um sinal muito fraco. A pontuação de calibração deve ser de 100% antes de clicar em aceitar. Caso contrário, limpe o espectro somado e adquira um novo.
6. Inicie o software flexImaging . A GUI de aquisição de imagem será iniciada automaticamente.
7. Selecione Configurar uma nova execução de geração de imagem na janela Escolher execução de imagem .
8. Escolha Fluxo de trabalho clássico na janela Selecionar fluxo de trabalho .
9. Na Janela de Armazenamento de Dados , forneça um Nome de Execução de Geração de Imagens e um Diretório de Resultado para os dados.
   NOTA: Os espaços não devem ser usados em nomes de arquivo.
10. Na janela Configurações de aquisição , escolha Regiões de medida definidas pelo usuário e digite 20 na caixa Largura do raster . Clique em Procurar para selecionar o método timsControl criado anteriormente.
11. Na janela Imagem de amostra , clique em Procurar para selecionar a imagem óptica adquirida usando o scanner de mesa.
12. Na janela Ensinar amostra , execute um alinhamento de três pontos entre a imagem óptica e o slide; em seguida, mova o portador de amostra para o primeiro fiducial gravado no slide e alinhe a mira em timsControl com um recurso distinto na gravação. Aumente o zoom na imagem (100% de zoom recomendado), defina a imagem de amostra para definir pontos de ensino e clique no mesmo local na imagem óptica. Repita esse processo 2x mais para um total de três pontos de ensino. Clique em Avançar para concluir o ensinamento.
13. Clique em OK para sair do Assistente de Nova Execução de Imagens.
14. Verifique a precisão do ensino clicando no botão Posicionar portador de amostra no software. Aumente o zoom e clique em uma característica distinta do quarto ponto fiducial (não utilizado) na imagem; o portador de amostra se moverá para esta posição dentro de timsControl. Confirme se a mira está alinhada com o recurso selecionado. Se eles não se alinharem, limpe o ensino no flexImaging e repita o processo de ensino para melhorar a precisão.
15. No software, selecione a ferramenta Adicionar região de medição de polígono e contorne o(s) tecido(s) a ser visualizado(s). Cada clique do mouse criará um ponto de ancoragem. Pressione o botão backspace no teclado para remover pontos, um por um. Depois que a região for desenhada, clique duas vezes com o mouse para fechar o polígono.
16. Verifique o sinal disparando o laser em alguns locais dentro do tecido. Clique em um local na imagem usando o botão Posicionar Sample Carrier , como na Etapa 2.14, para verificar o ensino. O espectro será dominado por picos de matriz em torno de m / z 157 e 313; Amplie a região M / Z abaixo de 154 e 250-300 para mostrar muitos picos de metabólitos de moléculas pequenas e ácidos graxos, respectivamente. Ajuste a fluência do laser conforme necessário para obter o sinal ideal.
17. Salve o método timsControl.
18. Inicie a aquisição de imagens clicando no botão Iniciar AutoXecute Run no software
    NOTA: A imagem em modo de íons negativos com matriz DAN resulta na detecção de vários metabólitos do ciclo TCA, aminoácidos e ácidos graxos, entre outros.

3. Preparação de amostras para imagens de glicanos ligados a N

1. Depois de remover a amostra do espectrômetro de massa, remova a matriz DAN submergindo a lâmina em etanol 100% (200 provas) por 1 min.
2. Reidrate a lâmina em potes Coplin: Etanol 100% fresco por 1 min; Etanol a 95% por 1 min; etanol 70% por 1 min; Água por 3 min; Água fresca por 3 min.
3. Deixe a lâmina secar por ~ 15 min.
4. Realize a recuperação do antígeno submergindo a lâmina em tampão Tris 100 mM (feito dissolvendo 6,06 g de Base Tris em 500 mL de água e ajuste o pH conforme necessário), pH 9, em um frasco Coplin com uma tampa colocada frouxamente em cima que é colocado em uma Câmara de Desloagem com 500 mL de água na câmara. Aquecer a 95 °C durante 20 min.
5. Retire o frasco de Coplin da câmara de desloagem e coloque-o na bancada para esfriar por 20 min.
6. Troque o slide por água em cinco mudanças. Para os três primeiros, despeje metade da solução e substitua-a por água. Para os dois últimos, despeje toda a solução e substitua-a por água.
7. Deixe a lâmina secar completamente.
8. Crie uma câmara de umidade para incubação da lâmina após a aplicação do PNGaseF. Cortar um círculo de um toalhete absorvente para cobrir o fundo de uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Enrole dois lenços de laboratório para criar travesseiros em cada lado da placa de Petri (Figura 2). Adicione 8 mL de água para saturar esses lenços e tampe a placa de Petri e leve ao forno a 37 °C por pelo menos 30 min para pré-aquecer.
   NOTA: O interior do prato deve parecer fumegante.
9. Prepare o PNGaseF reconstituindo 100 μg de enzima liofilizada em 200 μL de bicarbonato de amônio 100 mM, pH 7,8 e vórtice para misturar. Transfira a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e dilua para 1 mL com água.
10. Pulverize a lâmina com PNGaseF usando o Pulverizador Robótico de Reagentes com os seguintes parâmetros. Use a bomba de seringa para aplicações de baixo volume/baixa vazão: Velocidade da esteira - 1200 mm/s; Espaçamento entre trilhos - 3 mm; Temperatura do bico - 45 °C; Altura do bico - 40 mm; Vazão - 25 μL/min; Passes - 15; N ₂ Pressão - 10 psi; Padrão - CC
11. Coloque a lâmina na placa de Petri pré-aquecida, com o tecido voltado para cima, com uma extremidade em cada uma das almofadas de limpeza de laboratório. Substitua a lâmina e sele a placa de Petri com filme de vedação adesivo. Coloque no forno a 37 °C e coloque uma almofada de aquecimento para répteis ajustada a 40 °C em cima da placa de Petri.
    NOTA: Isso mantém a tampa a parte mais quente do prato e evita que a condensação se forme na tampa e caia no tecido, o que causará artefatos nas imagens.
12. Incubar a lâmina durante 2 h para permitir que a digestão prossiga.
13. Remova a lâmina da placa de Petri e deixe secar por ~ 5 min.
14. Faça a matriz MALDI dissolvendo 15 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) em 1,5 mL de 70% de ACN, 0,1% de TFA, 10 mM de fosfato de amônio.
    NOTA: O TFA é cáustico e deve ser usado em um capuz com equipamento de proteção individual adequado.
15. Sonicar até dissolver completamente, ~5 min.
16. Filtrar a solução da matriz antes de o carregar no circuito de amostras.
17. Pulverize a lâmina com CHCA usando o Pulverizador Robótico de Reagentes com os seguintes parâmetros: Velocidade da Pista - 1.200 mm/s; Espaçamento entre trilhos - 3 mm; Temperatura do bico - 75 °C; Altura do bico - 40 mm; Vazão - 120 μL/min; Passes - 3; N ₂ Pressão - 10 psi; Padrão - HH
18. Aplique 0,5 μL de fósforo vermelho suspenso em metanol em um local conhecido na lâmina.

4. N - Coleta de dados de imagem de glicano ligada

1. Coloque a(s) lâmina(s) preparada(s) no alvo do adaptador de lâmina e carregue no espectrômetro de massa MALDI QTOF.
2. Carregue o método apropriado para coleta de dados do modo de íon positivo em timsControl. Se o instrumento ainda não estiver no modo de íons positivos, aguarde pelo menos 25 minutos após a mudança de polaridade para equilíbrio antes da calibração e coleta de dados com os seguintes parâmetros do instrumento para glicanos: faixa m/z - 700-3500; Faixa de varredura a laser - 16,0 μm em X e Y; Tamanho do campo resultante - 20,0 μm em X e Y; Tiros de laser - 200; Fluência do laser - ~ 25%; Funil 1 RF - 450,0 Vpp; Funil 2 RF - 500,0 Vpp; RF multipolar - 500,0 Vpp; Energia de colisão - 10,0 eV; Colisão RF - 2.700,0 Vpp; Tempo de transferência - 140,0 μs; Armazenamento pré-pulso - 14,0 μs (Figura suplementar S2).
3. Execute um Perfil de Destino (clique no botão Gerar Agora ) e Ajuste de Foco (clique no botão Ajustar Agora ) na guia Portador de amostra . Ajuste a posição do laser em X e Y, se necessário, na guia do laser para garantir que o laser esteja alinhado com a mira.
4. Colete um espectro de fósforo vermelho somando pelo menos cinco conjuntos de tiros de laser do ponto na lâmina.
5. Execute uma calibração clicando no botão Calibrar na guia Calibração. Remova quaisquer picos com intensidade muito baixa ou erro de ppm alto.
   NOTA: A pontuação de calibração deve ser de 100% antes de clicar em aceitar. Caso contrário, limpe o espectro somado e adquira um novo.
6. Abra o arquivo .mis usado anteriormente para imagens de metabólitos no software.
7. Salve o arquivo com um novo nome indicando que são dados de glicanos.
8. Em Editar | Propriedades de execução de imagem, altere o método de aquisição para o método de glicano desejado.
9. Limpar o ensinamento anterior usando Editar | Pontos de ensino claros.
   NOTA: O slide não estará exatamente na mesma posição depois de removê-lo e recarregá-lo no adaptador de slide.
10. Realizar um novo ensino usando Editar | Definir pontos de ensino; defina 3 pontos como foi feito no Imaging Wizard original (Etapa 2.12).
11. Verifique a precisão do ensino clicando no botão Posicionar portador de amostra no software. Aumente o zoom e clique em uma característica distinta do quarto ponto fiducial (não utilizado) na imagem. O portador da amostra se moverá para esta posição dentro do timsControl; Confirme se a mira está alinhada com o recurso selecionado.
    NOTA: Se a mira não se alinhar, limpe o ensino e repita o processo de ensino para melhorar a precisão.
12. Salve o arquivo.
13. Verifique o sinal disparando o laser em alguns locais dentro do tecido. Clique em um local na imagem usando o botão Posicionar portador de amostra como na Etapa 4.11 para verificar o ensino. Confirme se o espectro tem picos abundantes de glicanos com picos dominantes tipicamente em m / z 1.663 e 1.809. Ajuste a fluência do laser conforme necessário para obter o sinal ideal.
14. Salve o método timsControl.
15. Inicie a aquisição de imagens clicando no botão Iniciar execução do AutoXecut.

5. Preparação da amostra para imagem de peptídeo tríptico

1. Remova a matriz CHCA submergindo a lâmina em etanol 100% (200 provas) por ~ 1 min
2. Reidrate a lâmina em potes Coplin da seguinte forma: Etanol 100% fresco por 1 min; Etanol a 95% por 1 min; etanol 70% por 1 min; Água por 3 min; Água fresca por 3 min.
3. Deixe a lâmina secar por ~ 15 min.
4. Realize a recuperação do antígeno submergindo a lâmina em tampão Tris 100 mM, pH 9, em um frasco Coplin com uma tampa colocada frouxamente na parte superior que é colocada em uma câmara de desativação com 500 mL de água na câmara. Aquecer a 95 °C durante 20 min.
   NOTA: Esta segunda recuperação de antígeno é necessária para desnaturar as proteínas para um acesso mais eficiente da tripsina aos locais de clivagem.
5. Retire o frasco de Coplin da câmara de desloagem e coloque-o na bancada para esfriar por 20 min.
6. Troque o slide por água em cinco mudanças. Para os três primeiros, despeje metade da solução e substitua-a por água. Para os dois últimos, despeje toda a solução e substitua-a por água.
7. Deixe a lâmina secar completamente.
8. Prepare a tripsina reconstituindo 100 μg de enzima liofilizada em 200 μL de ácido acético 100 mM e pipete para cima e para baixo para misturar. Alíquota em tamanhos apropriados para experimento (normalmente 40 μL) e armazenar a -20 °C.
9. Prepare uma alíquota de 40 μL de tripsina adicionando 350 μL de bicarbonato de amônio 100 mM, pH 7,8 e 39 μL de ACN. Misture bem.
   NOTA: A acetonitrila (10% ACN) aumenta a atividade da tripsina em comparação com a solução aquosa e reduz a tensão superficial da solução para pulverização¹⁹.
10. Pulverize a lâmina com tripsina usando um pulverizador robótico de reagentes com os seguintes parâmetros. Use a bomba de seringa para aplicações de baixo volume/baixa vazão: Velocidade da esteira - 750 mm/s; Espaçamento entre trilhos - 3 mm; Temperatura do bico - 30 °C; Altura do bico - 40 mm; Vazão - 10 μL/min; Passes - 12; N ₂ Pressão - 10 psi; Padrão - HH
11. Coloque um quadrado de lenço absorvente no fundo de uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro; certifique-se de que os cantos apenas toquem na borda do prato e distribua 1 mL de água sobre o lenço.
12. Coloque a lâmina em cima do lenço, com o tecido voltado para cima, coloque a tampa na placa de Petri e sele a placa de Petri com filme de vedação adesivo.
13. Incubar a lâmina durante 4 h a 37 °C para permitir que a digestão prossiga.
14. Remova a lâmina da placa de Petri e deixe-a secar por ~ 5 min.
15. Faça a matriz MALDI dissolvendo 15 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) em 1,5 mL de 70% de ACN, 0,1% de TFA, 10 mM de fosfato de amônio.
16. Sonicar até dissolver completamente, ~5 min.
17. Filtrar a solução da matriz antes de o carregar no circuito de amostras.
18. Pulverize a lâmina com CHCA usando um Pulverizador Robótico Reagente com os seguintes parâmetros: Velocidade da Pista - 1200 mm/s; Espaçamento entre trilhos - 3 mm; Temperatura do bico - 75 °C; Altura do bico - 40 mm; Vazão - 120 μL/min; Passes - 4; N ₂ Pressão - 10 psi; Padrão - HH
19. Aplique 0,5 μL de fósforo vermelho suspenso em metanol em um local conhecido na lâmina.

6. Coleta de dados de imagem de peptídeo tríptico

1. Coloque a(s) lâmina(s) preparada(s) em um adaptador de lâmina e carregue em um espectrômetro de massa timsTOF MALDI QTOF.
2. Carregue o método apropriado para coleta de dados do modo de íon positivo em timsControl. Se o instrumento ainda não estiver no modo de íons positivos, aguarde pelo menos 25 minutos após a mudança de polaridade para equilíbrio antes da calibração e coleta de dados usando os seguintes parâmetros do instrumento para peptídeos: faixa m/z - 600-4500; Faixa de varredura a laser - 16,0 μm em X e Y; Tamanho do campo resultante - 20,0 μm em X e Y; Tiros de laser - 200; Fluência do laser - ~ 25%; Funil 1 RF - 450,0 Vpp; Funil 2 RF - 500,0 Vpp; RF multipolar - 600,0 Vpp; Energia de colisão - 10,0 eV; Colisão RF - 3400,0 Vpp; Tempo de transferência - 180,0 μs; Armazenamento pré-pulso - 18,0 μs (Figura suplementar S3).
3. Execute um Perfil de destino (clique no botão Gerar agora ) e Ajuste de foco (clique no botão Ajustar agora ) na guia Portadora de amostra. Ajuste a posição do laser em X e Y, se necessário, na guia do laser para garantir que o laser esteja alinhado com a mira.
4. Colete um espectro de fósforo vermelho somando pelo menos cinco conjuntos de tiros de laser do ponto na lâmina.
5. Execute uma calibração clicando no botão Calibrar na guia Calibração. Remova quaisquer picos com intensidade muito baixa ou erro de ppm alto. Confirme se a pontuação de calibração é de 100% antes de clicar em aceitar. Caso contrário, limpe o espectro somado e adquira um novo.
6. Abra o arquivo .mis usado anteriormente para imagens de glicanos.
7. Salve o arquivo com um novo nome indicando que são dados de peptídeos.
8. Em Editar | Propriedades de execução de imagem, altere o método de aquisição para o método de peptídeo desejado.
9. Limpar o ensinamento anterior usando Editar | Pontos de ensino claros.
   NOTA: O slide não estará exatamente na mesma posição depois de removê-lo e recarregá-lo no adaptador de slide.
10. Realizar um novo ensino usando Editar | Definir pontos de ensino; defina três pontos como foi feito no Imaging Wizard original (Etapa 2.12).
11. Verifique a precisão do ensino clicando no botão Posicionar Transportador de Amostras . Aumente o zoom e clique em uma característica distinta do quarto ponto fiducial (não utilizado) na imagem. O portador da amostra se moverá para esta posição dentro do timsControl; Confirme se a mira está alinhada com o recurso selecionado.
    NOTA: Se a mira não se alinhar, limpe o ensino e repita o processo de ensino para melhorar a precisão.
12. Salve o arquivo.
13. Verifique o sinal disparando o laser em alguns locais dentro do tecido. Clique em um local na imagem usando o botão Posicionar portador de amostra como na Etapa 6.11 para verificar o ensino. Confirme se o espectro tem picos peptídicos abundantes com picos dominantes tipicamente em m / z 944, 1.105 e 1.198. Ajuste a fluência do laser conforme necessário para obter o sinal ideal.
14. Salve o método timsControl.
15. Inicie a aquisição de imagens clicando no botão Iniciar execução do AutoXecut.

7. Coloração histológica

NOTA: Existem vários métodos para hematoxilina e eosina disponíveis. Apresentado aqui está um Método Carazzi modificado frequentemente usado neste laboratório.

1. Remova a matriz CHCA submergindo a lâmina em etanol 100% por 1 min.
2. Manchar a lâmina da seguinte forma: etanol a 95% por 30 s; etanol 70% por 30 s; Água por 30 s; Hematoxilina por 2 min; Água por 30 s; etanol 70% por 30 s; etanol a 95% por 30 s; Eosina por 1 min; etanol a 95% por 30 s; 100% etanol por 30 s; Xileno por 2,5 min; Lamínula com suporte de montagem.
3. Deixe a lâmina secar por >1 h e remova quaisquer bolhas pressionando suavemente a lamínula.
4. Digitalize com um scanner de slides digital.

8. Visualização de dados

NOTA: Há uma análise extensa que pode ser feita com o SCiLS Lab que está além do escopo deste protocolo. Aqui, descreveremos apenas a criação básica de arquivos, a visualização de dados e a pesquisa de picos em bancos de dados para identificação putativa.

1. Inicie o SCiLS Lab 2025b e escolha Novo.
2. Selecione o(s) arquivo(s) de dados a serem carregados no software.
   NOTA: Com o SCiLS Lab Pro, vários arquivos de dados coletados com os mesmos parâmetros podem ser carregados juntos para normalização entre si e visualizados simultaneamente.
3. Organize as amostras no layout preferido. Mova as amostras clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando. Gire as amostras clicando com o botão direito do mouse e arrastando. Selecione Avançar.
4. Na janela Configurações do eixo de massa , faça os ajustes necessários. Os valores padrão geralmente funcionam bem para dados timsTOF. Clique em Avançar.
5. Na janela Localização de Recursos , defina os valores apropriados para a separação de pico automatizada durante a importação. Clique em Avançar.
   NOTA: Isso não funciona bem para dados de metabólitos do tecido FFPE e deve ser ignorado.
6. As configurações de importação serão visualizadas na janela Resumo da importação . Clique em Importar.
7. Forneça um nome de arquivo e um local para salvar o arquivo SCiLS.
   NOTA: Dependendo do tamanho do arquivo, pode levar de alguns minutos a várias horas para importar.
8. Quando concluído, uma janela de resumo ficará visível. Clique em Abrir conjunto de dados importado para interagir com o arquivo SCiLS.
9. No canto superior direito do software, clique no menu suspenso ao lado de Normalização e selecione Root Mean Square.
   NOTA: Este é o método mais apropriado para dados timsTOF dada a dispersão dos dados do centróide importados e fornecerá a melhor visualização.
10. Em Arquivo | Propriedades do arquivo, defina a largura do intervalo para um valor apropriado, normalmente de 10 a 15 ppm para dados timsTOF. Confirme se o valor é apropriado avaliando se ele abrange a largura de um pico no espectro médio.
11. Aumente o zoom no espectro médio na parte inferior do software, clicando e arrastando ou rolando a roda do mouse para frente.
12. Selecione um pico para visualizar posicionando a mira no ápice e clicando com o botão esquerdo do mouse na roda do mouse.
13. Adicione íons de interesse à lista ativa de imagens de íons pressionando control + barra de espaço.
14. Salve a lista de recursos selecionados clicando no botão Salvar como lista de recursos na parte inferior da janela de imagens de íons no lado direito do software.
15. Abra uma lista de recursos salvos clicando em Arquivo | Tabela de recursos e pesquisa usando o MetaboScape para IDs de metabólitos ou glicanos putativos, se o MetaboScape estiver instalado e configurado na mesma rede. Como alternativa, converta os arquivos SCiLS em arquivos .imzML para importação em METASPACE (https://metaspace2020.org/) para identificação putativa.
    NOTA: Uma descrição completa dos recursos do SCiLS Lab pode ser encontrada no Manual do usuário na opção de menu Ajuda .

Results

A conclusão deste protocolo deve resultar em três conjuntos de dados MSI robustos da mesma seção de tecido. Na visualização de todo o espectro dos dados de metabólitos, o espectro será fortemente dominado por picos de matriz em m / z 157 e 315. Isso é normal para o tecido FFPE. Muitos sinais de metabólitos e ácidos graxos serão observados ampliando as faixas m / z <155 e entre 250 e 300. A Figura 3 mostra exemplos do espectro completo e das faixas ampliadas, destacando os espectros de met...

Discussion

A coleta de dados sequenciais de MSI de uma única seção de tecido requer atenção cuidadosa aos detalhes. Existem algumas etapas que são absolutamente cruciais para obter dados de alta qualidade. Primeiro, deve-se tomar cuidado se mais de um slide for preparado ao mesmo tempo. Ao colocar as lâminas ou mover-se entre os frascos Coplin, tome cuidado para não colocar duas lâminas na mesma posição no frasco. Isso resultará em exposição inadequada ao solvente da superfície do tecido, ou uma lâ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5-diaminonaftaleno	Fisher Científico	D010125G	Matriz MALDI para imagem de metabólitos
Acetonitrilo	Fisher Científico	A955-4	Solvente de grau LC-MS usado para preparação de matriz
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico	Sigma-Aldrich	70990-1G-F	Matriz MALDI para imagens de glicanos e peptídeos
Bicarbonato de amônio	Fisher Científico	Rolamento A643-500	Tampão para enzimas
Fosfato de amônio	Sigma-Aldrich	Rolamento 467782-50G	Aditivo para reduzir os aglomerados de matrizes durante a aquisição de imagens
Câmara de Deloaking NxGen	Biocare Médico	N/A	Usado para recuperação de antígeno de tecido
Etanol	Fisher Científico	04-355-223	Solvente de grau LC-MS usado para preparação e coloração de matrizes
Pulverizador robótico do reagente M5	Imagens HTX	N/A	Usado para aplicação de enzimas e matrizes em tecidos
Metanol	Fisher Científico	A456-4	Solvente de grau LC-MS para fazer suspensão de fósforo vermelho
Tripsina de grau MS	Fisher Científico	PI90058	Enzima para digestão de proteínas
Adaptador de corrediça MTP II	Bruker Daltonics	8235380	Adaptador para inserir lâminas de micrscope no espectrômetro de massa
Scanner de slides digital NanoZoomer SQ	Hamamatsu Corp	N/A	Usado para gerar imagens de microscopia digital de tecido corado
Scanner de mesa Perfection V600	Epson	N/A	Usado para gerar imagem óptica da lâmina para coleta de dados MSI
Selo de Petri	Fisher Científico	50-212-518	Para selar a placa de Petri durante a digestão enzimática
PNGaseF	Biografia do Bulldog	NZPP550LY	Enzima para clivagem de glicanos ligados a N a partir de proteínas
Fósforo vermelho	Sigma-Aldrich	04004-250G	Calibrante MALDI para modo de íons positivos e negativos
Laboratório SCiLS (2025b)	Bruker Daltonics	N/A	Software para visualização de dados MSI
espectrômetro de massa timsTOF fleX QTOF	Bruker Daltonics	N/A	Usado para coleta de dados de espectrometria de massa
Ácido trifluoracético	Fisher Científico	85183	Aditivo de matriz para diminuir o pH para imagens de modo de íons positivos
Tris Base	Fisher Científico	BP152-500	Tampão para recuperação de antígenos
Água	Fisher Científico	W64	Solvente de grau LC-MS usado para matrizes, enzimas e coloração
WypAll X60	Fisher Científico	19-413-113	Toalhete absorvente para incubação enzimática umidificada
Xileno	Fisher Científico	X3P-1GAL	Agente de limpeza para coloração