Perfil espacial abrangente de transcriptomas agnósticos de espécies via Stereo-seq

Summary

Este artigo apresenta um protocolo para realizar um perfil transcriptômico espacial abrangente do RNA do hospedeiro, viral, fúngico e microbioma a partir de seções de tecido embebidas em parafina fixadas em formalina usando Stereo-seq, que permite o mapeamento de alta resolução de diversos transcriptomas, preservando a arquitetura do tecido.

Abstract

A composição espacial das células dentro do hospedeiro, bem como as bactérias ou cargas virais dentro do tecido, podem afetar a interação dos tipos de células e analitos que conduzem a célula por meio de processos específicos do tipo de célula. O Stereo-seq para tecidos FFPE usa priming aleatório para códigos de barras espaciais, o que é diferente dos métodos transcriptômicos espaciais padrão, que usam A'tailing para capturar RNA mensageiro (mRNA) ou baseado em sonda para capturar transcritos específicos da espécie. Esses métodos não abrangem o conhecimento mais atual sobre o impacto e a importância de outros tipos de RNA de RNA longo não codificante, RNA mitocondrial, microRNA ou outras espécies, RNA, como microbiano, viral e fúngico. Aqui está descrito um procedimento passo a passo desde o seccionamento do tecido até a preparação da biblioteca para aplicação de stereo-seq agnóstico de espécie espacial com detecção de RNA usando uma metodologia de sonda aleatória, que é compatível com tecidos embebidos em parafina fixada em formalina (FFPE). Este método Stereo-seq tem um cordão de captura aleatória de 0,22 μm de tamanho que reaparece em uma matriz a cada 0,5 μm, permitindo a resolução subcelular de uma tecnologia baseada em sequenciamento. Como esse método detecta RNA hospedeiro e não hospedeiro, o protocolo requer considerações específicas para permitir a determinação do que está dentro do tecido versus o que foi depositado no tecido durante o processo de coleta, preservação, corte e detecção (ou seja, contaminantes ambientais e de manuseio). Por fim, este protocolo permite ter uma resolução de alto nível (célula única) de espécies multi-RNA dentro de um contexto espacial, fornecendo informações sobre o intra e inter-actome de tipos celulares e espécies patológicas.

Introduction

As tecnologias espaço-ômicas revolucionaram o estudo da heterogeneidade celular do tecido, permitindo a quantificação simultânea de múltiplos alvos, DNA (genômica), RNA (transcriptômica), metabólitos (metabolômica) ou proteína (proteômica)¹. A resolução desses diferentes ensaios geralmente varia, fornecendo diferentes limitações ao medir analitos, seja com maior esparsidade ao medir uma única célula ^2,3 ou contexto espacial nativo⁴. Em contraste, métodos em massa, como o sequenciamento de RNA, fornecem apenas expressão gênica média em amostras inteiras e heterogeneidade celular obscura², ou sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ^{2 , 3} , que requer dissociação de tecido para sequenciamento de célula única, geralmente requer filtragem. Portanto, esses métodos excluem células grandes e agregados, enquanto os métodos de bioinformática tentam remover fragmentos e dublês, os quais induzem vieses ^5,6,7. A transcriptômica espacial retém a arquitetura do tecido, fornecendo informações críticas sobre a organização e as interações celulares. A maioria dos métodos de sequenciamento espacial não direcionado não possui resolução de célula única, exigindo assim a deconvolução de áreas de captura espacial que contenham de 10 a 100 células ^8,9,10. No entanto, na última década, a transcriptômica espacial ultrapassou as necessidades desses métodos, pois houve avanços na resolução, maiores áreas de captura e integração de abordagens multiômicas, seja usando estratégia experimental ou novas técnicas ^1,11,12.

Resolução Espacial Aprimorada O sequenciamento ômico (Stereo-seq) fornece resolução em nanoescala (500 nm) e uma área de captura em escala centimétrica, com captura transcriptômica total independente de espécie, permitindo a captura de RNA¹³ codificante, não codificante e não hospedeiro. Este método é atualmente a resolução mais alta para transcriptômica espacial e tem opções para fornecer os maiores campos de visão. No entanto, esse método tem algumas limitações notáveis, incluindo requisitos de tempo e mão de obra de cerca de 15 horas, abrangendo 4 dias para concluir as bibliotecas prontas para sequenciamento. Em comparação, outras tecnologias transcriptômicas espaciais baseadas em sequenciamento, como transcriptômica espacial baseada em sonda, transcriptômica espacial baseada em matriz de captura poliA, Slide-seq e código de barras determinístico em tecido para sequenciamento ômico espacial (DBiT-seq) normalmente requerem 5 a 8 h de tempo prático durante 2 a 3 dias (Tabela 1). Para muitos pesquisadores, esses avanços superam os desafios técnicos e são ideais para a construção de atlas espaciais transcriptômicos completos para estudar a progressão da doença nos níveis celular e subcelular, particularmente se em camadas com outras tecnologias¹.

O protocolo Stereo-seq tem possibilidades além da transcriptômica tradicional de mRNA, que depende de sondas poli-T para capturar transcritos de mRNA poliadenilados. Esses métodos podem ser modificados adicionando poliadenilação a tecidos frescos¹⁴ ou sondas específicas da espécie para conjuntos de genes predefinidos¹⁵ para análise de expressão espacial. Em vez disso, o Stereo-seq usa sondas de nucleotídeos aleatórios para selecionar diversos RNAs, independentemente da espécie, incluindo RNAs microbianos, RNAs fúngicos, RNAs virais e RNAs não poliadenilados, como RNAs intensificadores, RNAs circulares e RNAs longos não codificantes (lncRNAs) ¹⁶ . Teoricamente, é possível capturar RNAs menores ou elementos reparadores, como pequenos RNAs interferentes (siRNAs), microRNAs (miRNAs) e transposons¹⁷. No entanto, atualmente a bioinformática e o mapeamento desses RNAs permanecem desafiadores e muitas vezes são filtrados durante o alinhamento inicial, que normalmente usa um corte de 30 pb.

Aqui está um protocolo detalhado, com nossas modificações para a captura aleatória de nucleotídeos de um fabricante em chips de nanobolas de DNA (DNB) para garantir uma melhor compreensão e manuseio de um protocolo Stereo-seq ilustrado na Figura 1. Este protocolo inclui estratégias para biólogos moleculares para testar novos tecidos FFPE em Stereo-seq com captura aleatória de nucleotídeos para produzir rendimentos mais consistentes e mais altos a partir de amostras arquivadas e tecidos adiposos de qualidade inferior. O protocolo descrito é otimizado para amostras FFPE da maioria dos órgãos, independentemente da espécie de origem. No entanto, este protocolo não inclui modificações atuais necessárias para lidar com tecidos difíceis, como a medula óssea, que requerem descalcificação.

Protocol

Nenhum dado clínico é fornecido neste artigo de métodos para a amostra de paciente com carcinoma ovariano seroso de alto grau e virgens de tratamento. No entanto, os dados clínicos associados foram coletados seguindo protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do MD Anderson Cancer Center da Universidade do Texas, Departamento de Oncologia Ginecológica e Medicina Reprodutiva, de participantes que forneceram consentimento informado por escrito.

NOTA: Recomenda-se o uso de máscara cirúrgica e luvas durante todo o protocolo para evitar a contaminação por RNase. Recomenda-se que os pesquisadores com cabelos compridos o puxem para trás ou até mesmo usem uma rede de cabelo. Sempre use água estéril sem nuclease (NFW) e tubos de DNA/RNA de baixa ligação sem nuclease para maximizar o rendimento. Tecidos não mamíferos, como tecidos vegetais, podem exigir otimização da aderência, envolvendo poli-L-lisina (PLL) e tempos de permeabilização prolongados devido às paredes celulares. Embora a captura molecular permaneça teoricamente viável, a validação experimental é necessária, pois os tecidos vegetais permanecem não testados em nosso fluxo de trabalho atual.

1. Avalie a qualidade do RNA e o valor da distribuição do fragmento de RNA 200 pontuações

1. Avalie a qualidade do RNA usando o Valor de Distribuição de Fragmentos de RNA 200 (DV200), que mede a porcentagem de RNA superior a 200 pb.
2. Utilize duas seções de 10 μm do mesmo bloco de tecido destinado ao processamento Stereo-seq.
   NOTA: O processamento imediato é ideal, mas as amostras podem ser armazenadas a 4 °C por até 1 semana, -20 °C por 4 semanas ou -80 °C por 6 meses.
3. Extraia o RNA usando um protocolo de extração de RNA seletivo sem tamanho, conforme descrito por Patel et ^al.18 , para permitir uma avaliação precisa da distribuição dos tamanhos dos fragmentos de RNA.
4. Avalie a qualidade do RNA com um dos seguintes usando um analisador de fragmentos para determinar a pontuação DV200 ou a porcentagem de área sob a curva que representa fragmentos de RNA com mais de 200 pb. Idealmente, o tecido deve ter uma pontuação DV200 (> 50%) e concentração (> 10 ng/μL).

2. Limpeza do espaço de trabalho

1. Limpe todas as superfícies com 30% de alvejante. Deixe as superfícies secarem por pelo menos 30 minutos para evitar a formação de clorofórmio a partir da combinação de alvejante e etanol.
2. Limpe as superfícies com lenços de descontaminação de DNA (DDW). Pulverize todas as superfícies com solução de descontaminação RNase (RDS) e, em seguida, etanol 70% preparado com NFW.
   NOTA: Nunca misture água sanitária ou qualquer outro álcool. Essa combinação produziu clorofórmio, que é altamente tóxico e pode causar inconsciência, danos aos órgãos ou morte, mesmo em baixas exposições.

3. Preparação do chip de captura de oligonucleotídeos aleatórios Stereo-seq (N-chip)

1. Limpe o espaço de trabalho conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2, incluindo todos os sistemas usados nesta etapa.
2. Remova o chip Stereo-seq N de sua embalagem, registre o ID do chip e limpe as bordas do chip Stereo-seq N e da lâmina de vidro com 100% de etanol sem tocar no chip. Deixe secar completamente ao ar.
3. Aplicação de resina para prender o chip à lâmina (Opcional para usuários que usam xilenos).
   NOTA: Embora os agentes de limpeza sem xileno sejam frequentemente recomendados por fornecedores comerciais, observou-se que os agentes de limpeza sem xileno podem ser menos eficazes dependendo da mistura de parafina. Muitas vezes, eles não são compatíveis com certos plásticos, resinas sintéticas ou tecidos embebidos em cera de abelha e não limpam parafinas fortemente reticuladas ou de alto ponto de fusão com eficiência. Se não tiver certeza da composição de parafina usada para incorporar a amostra, recomenda-se o uso de xilenos para uma limpeza ideal. Além disso, os xilenos são mais capazes de limpar os tecidos adiposos, como mama, ovário, óvulo ou tecido cerebral.
   1. Agite ou misture bem a resina para se certificar de que está homogeneamente branca. Usando uma micropipeta, aplique cuidadosamente 10 μL de resina cerâmica curável por UV ao redor da borda do chip Stereo-seq N (Figura 2A).
      NOTA: A resina pode causar irritação na pele e nos olhos e pode levar a reações alérgicas na pele com exposição repetida. Ao pipetar ou manusear esta resina, sempre use luvas de nitrilo, óculos de segurança e jaleco. Trabalhe em uma área bem ventilada e use uma máscara ao usar grandes volumes ou se aquecer a solução e evite o contato direto com a pele ou os olhos.
   2. Use um cotonete de espuma selado, remova o excesso de resina, deixando apenas uma linha fina ao redor da borda do cavaco. Coloque a corrediça no dispositivo de cura UV, certificando-se de não tocar na superfície do chip.
   3. Coloque o chip aplicado com resina em cima de uma máscara opaca na fonte de luz UV de 405 nm para iluminar a parte de trás da lâmina e catalise por 5 min. Isso é ilustrado na Figura 2B.
      NOTA: Não exponha demais o chip Stereo-seq N à luz ultravioleta e não toque na resina na superfície do chip, pois isso pode causar efeitos prejudiciais às nanobolas.
   4. Após a cura, use cotonetes de espuma selados embebidos em cada um dos seguintes: etanol 100% de grau molecular; etanol 70%; e, finalmente, NFW para limpar ao redor da borda onde a resina foi colocada. Se manchas brancas saírem, limpe a borda novamente. Nunca toque na superfície do cavaco (Figura 2C).
   5. Deixe o slide secar completamente ao ar. Após a inspeção, armazene os cavacos durante a noite a 4 °C com um dessecante, se necessário. No entanto, é recomendável continuar com a preparação e seccionamento do cavaco imediatamente quando possível.
      NOTA: Sempre use equipamento de proteção individual adequado, incluindo óculos de proteção UV, ao trabalhar com luz UV. Manuseie etanol e resina em uma área bem ventilada, de preferência uma capela de exaustão. Descarte os resíduos de acordo com as diretrizes institucionais.
4. Preparação de cavacos com poli-L-lisina (opcional para tecidos adiposos ou tecidos com problemas de aderência.)
   1. Limpe o espaço de trabalho conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2, incluindo todos os sistemas usados nesta etapa.
      NOTA: Não pulverize produtos químicos diretamente na máquina de PCR. Para todas as etapas de pré-PCR, trabalhe em uma coifa de PCR, se possível, para evitar contaminação, incluindo amplificação prévia de cDNA.
   2. Mergulhe o chip três vezes em NFW novo usando um tubo cônico de 50 mL.
   3. Seque o cavaco usando ar comprimido, usando toda a força do ar comprimido em um ângulo de aproximadamente 60° a 80° na diagonal (45°) através da superfície do cavaco a cerca de 5 cm de distância da superfície do cavaco (Figura 2E). Se a superfície parecer turva, repita a lavagem com NFW fresco e seque novamente (a superfície da nuvem geralmente significa que a cerâmica não foi suficientemente lavada ou curada nas etapas anteriores).
   4. Aplique 150 μL de solução PLL para cobrir toda a superfície do cavaco. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente (22 °C a 25 °C). Isso é ilustrado na Figura 2D.
   5. Remova a solução PLL e lave o chip duas vezes com água livre de nuclease por 10-15 s.
   6. Seque as bordas da lâmina cuidadosamente após a segunda lavagem (sem tocar no chip).
   7. Seque firmemente o cavaco usando ar comprimido, usando toda a força do ar comprimido em um ângulo de aproximadamente 60° a 45° indo diagonalmente pela superfície do cavaco a cerca de 5 cm de distância da superfície do cavaco (Figura 2E).
      NOTA: O chip precisa estar completamente seco em 30 s ou menos. Se demorar mais do que isso, o DNB será perturbado, o que causará artefatos na captura.
   8. Prossiga para a montagem dentro de 1 h e mantenha o cavaco seco.
      NOTA: Se a superfície do cavaco parecer turva após a secagem, lave com NFW novo e repita o processo de secagem. Se houver artefatos na superfície do chip após a secagem, isso pode causar problemas de captura nessas áreas. Evite usar PLL para aderir se o tecido não exigir. Tocar no chip pode causar arranhões e perda de áreas de captura antes da liberação do cDNA ou captura irregular após a liberação. A resina na superfície do chip leva à perda salpicada de áreas de captura. Colocar o cavaco muito perto do bico de ar comprimido pode criar cristais e um spray de marcas DBN danificadas na superfície do cavaco; No entanto, isso é raro e geralmente ocorre apenas se o bico estiver quase tocando o cavaco e a garrafa de ar comprimido estiver muito fria. Recomenda-se praticar este procedimento várias vezes com chips de avaliação, pois esta etapa é tecnicamente desafiadora.

4. Seccionamento e montagem de tecidos

1. Certifique-se de que o espaço de trabalho esteja limpo, conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2. Certifique-se de que novas lâminas e NFW sejam utilizados para todos os banhos-maria e gelo durante o corte e montagem do tecido. Não toque diretamente no chip e cubra apenas 80% do chip com tecido.
   NOTA: Recomenda-se usar uma espessura de 5 μm para tecido padrão ou 4 μm para tecido com alto teor de gordura. Use uma faixa de opções de seções seriais para corresponder as modalidades entre amostras, se aplicável.
2. Secar as lâminas a 42 °C durante 3 h numa estufa ou numa máquina de PCR com a tampa aberta. Em seguida, transfira as lâminas ou altere a temperatura no forno ou na máquina de PCR para 37 °C e leve ao forno durante a noite durante 12-48 h. Recomenda-se usar por volta das 18 h.
3. Ponto de parada opcional: Após a secagem, sele as lâminas em sacos de alumínio com dessecante a 4 °C por até 1 semana antes de prosseguir.
   NOTA: Tempos de secagem mais longos podem reduzir a integridade do RNA. A secagem muito curta resultará em menor adesão do tecido à lâmina. Assar em uma temperatura mais alta pode reduzir a integridade do RNA. Os slides podem ser enviados para processamento externo (por exemplo, análise de host). No entanto, o envio não é recomendado para análise de microbioma devido ao aumento da contaminação potencial durante o transporte.

5. Desparafinizar slides

1. Certifique-se de que o espaço de trabalho esteja limpo, conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2.
2. Prepare reagentes para desparafinização e protocolo Stereo-seq.
   1. Alíquota dos reagentes necessários: Dois 30 mL de xilenos em tubos cônicos de 50 mL, dois 30 mL de etanol 100% em tubos cônicos de 50 mL.
   2. Prepare os seguintes reagentes diluídos com NFW: 96% de etanol por chip (2 cônicos ou 1mL necessários), 90% de etanol por chip, 80% de etanol por chip, 70% de etanol por chip, 50% de etanol por chip, 30% de etanol por chip, 2,5 mL de 5x citrato de sódio salino (SSC) de uma solução 20x, 5 mL de HCl 0,01N (diluir HCl 0,1N com NFW a pH 2). Para diluições de etanol, prepare uma solução de 30 mL em tubos cônicos de 50 mL ou uma solução de 500 μL em um tubo de 1,5 mL se estiver usando juntas de silicone.
   3. Prepare as seguintes soluções e mantenha-as em gelo: i) 32,5 mL de 0,1x SSC de uma solução 5x (mantenha 30 mL de solução em um tubo cônico e coloque os outros 2,5 mL em um tubo de 5mL para uso futuro), ii) 400 μL de 0,1x SSC com 5% de IR, mantenha em gelo.
   4. Preparar os seguintes reagentes diluídos com HCl 0,1 N.
      1. Prepare a solução de reagente de permeabilização (PR) 10x adicionando 1 mL de HCl 0,1 N ao reagente liofilizado fornecido comercialmente.
         NOTA: Mantenha no gelo apenas por 1 h, certifique-se de alíquota para uso futuro e congele a -20 °C.
      2. Prepare 500 μL de solução 1x PR (diluir uma alíquota de solução 10x PR com HCl 0,01 N, manter no gelo por até 6 h).
         NOTA: É fundamental que o pH do HCl 0,01 N esteja dentro de 10% do pH 2,0, pois as enzimas à base de pepsina funcionam de maneira ideal em pH 2.
3. Desparafinize as lâminas embebendo as lâminas em xilenos (recomendado) por 2 rodadas a 20 minutos cada.
4. Imediatamente, reidratar a amostra com etanol (100%, 96%, por 2 rodadas, 5 min cada, seguidas de 90%, 70%, 50% e 30% por 1 rodada, 2 min). Por fim, reidratar com NFW por 1 min. Para diluições de etanol, use 30 mL de solução em um tubo cônico de 50 mL para cada lâmina se preparar amostras para estudos de microbioma, ou use 30 mL para cada duas lâminas se preparar amostras não microbioma. Para todas as diluições subsequentes, prepare 30 mL de solução em um tubo cônico de 50 mL ou, se estiver usando juntas de silicone, use 500 μL de solução por chip de 1 cm² para cobrir totalmente a área do chip.
   OPCIONAL: Sugere-se colocar uma câmara de silicone de uma lâmina de remoção de 3 câmaras ao redor do chip para criar uma vedação após a etapa de 100% de etanol, conforme ilustrado na Figura 2F-H. Isso permite o uso de volumes menores de reagentes e reduz o risco de danificar o chip. Alternativamente, tubos cônicos de 50 mL podem ser usados para submergir totalmente o Stereo-seq Slide durante todo o procedimento.

6. (Opcional) Imagem nuclear e coloração de ssDNA

NOTA: Permita que o reagente de desreticulação FFPE atinja a temperatura ambiente (~25 °C) antes de usar em 6.1. Outras soluções de coloração são possíveis, mas a coloração nuclear de fluorescência é atualmente necessária para segmentação de célula única e agrupamento de células de dados transcriptômicos.

1. Coloração de fluorescência usando corante de DNA de fita simples (ssDNA)
   1. Prepare 2 μL de solução de coloração de ssDNA em tampão SSC diluindo o reagente Qubit ssDNA com tampão SSC 5x em uma diluição de 1:1 por 1 a 2 chips.
      NOTA: A diluição do ssDNA pode mudar com base no microscópio usado durante a geração de imagens.  Portanto, novos microscópios devem ser testados com um conjunto de diluições de corante ssDNA usando chip de avaliação e tecido de teste para determinar a melhor faixa dinâmica.
   2. Crie uma mistura principal da solução de coloração (200 μL por chip) usando uma diluição de 1:20 de inibidor de RNase (RI), diluição de 1:200 da diluição de ssDNA e o SSC 5x restante.
   3. Adicione a solução de coloração (150 μL por chip) e incube no escuro por 5 min em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a solução de coloração do canto do chip usando uma pipeta.
      NOTA: Se estiver usando a câmara de silicone removível, remova-a antes de manchar o chip com a mistura de corante ssDNA.
   4. Lave o cavaco duas vezes com 0,1x SSC (150 μL por chip de cada vez) por 10-15 s. Seque as bordas da lâmina cuidadosamente com papel para lentes após a segunda lavagem (sem tocar no chip).
   5. Adicione ~ 3-5 μL de glicerol (use menos para um microscópio invertido) para montar o trevo (cuidado com as bolhas).
      NOTA: Certifique-se de que o volume correto de glicerol seja aplicado na área da lâmina, normalmente cerca de 4 μL para um chip de 1 cm². Usar muito glicerol pode fazer com que a lamínula se desloque quando o slide é segurado verticalmente. O uso de muito pouco glicerol aumenta o risco de danos aos tecidos quando a lamínula é removida e pode introduzir bolhas, o que pode afetar negativamente os resultados de imagem e segmentação de célula única.
   6. Solte a lamínula de cerca de 1 cm de altura sobre o chip. Se estiver usando um microscópio intervencionado, certifique-se de que a lamínula não deslize quando segurada verticalmente. Se isso acontecer, remonte sem adicionar mais glicerol.
   7. Capture imagens fluorescentes de tecido corado com ssDNA com um microscópio de campo amplo com 10% de sobreposição entre os blocos de imagem.
      NOTA: Recomenda-se fazer um mapa de foco manual de 9 a 13 pontos com um microscópio de campo amplo usando uma objetiva de 10x. Um microscópio confocal pode ser usado, mas é muito mais sensível a mudanças focais no tecido e no chip.
   8. Junte um software de processamento de imagem, como o ImageJ, utilizando sobreposição teórica para gerar o posicionamento aproximado de cada bloco e, posteriormente, execute a sobreposição computacional de correspondência de pixels para ajustar o lado a lado da imagem
   9. Processe imagens no software StereoMap e certifique-se de que o controle de qualidade da imagem seja aprovado antes de prosseguir.
   10. Mergulhe a lâmina Stereo-seq em 30 mL de SSC 0.1x até que a lamínula se solte.

7. Processo de descrosslinking

NOTA: Evite tocar ou inclinar o chip durante esta etapa e pipete suavemente.

1. Certifique-se de que o reagente de desreticulação FFPE esteja em temperatura ambiente quente (~ 25 ° C) e inspecione para certificar-se de que não haja partículas que tornem a solução turva. Se as partículas forem visíveis, aqueça a 55 °C e arrefeça a 30 °C antes de utilizar.
2. Ligue o termociclador com as seguintes configurações: 30 °C para equilíbrio (tampa aquecida a 85 °C); 95 °C para uma incubação de 30 minutos; Tempo de espera infinito de 4 °C.
3. Monte a junta do e coloque a corrediça do chip Stereo-seq no.
4. Adicione o reagente de reticulação FFPE (400 μL por chip) no poço do que contém o chip. Aplique fita adesiva no e confirme se está bem fechado.
5. Inicie a incubação de 30 minutos a 95 °C a partir do passo 7.2. Depois de decorridos 10 minutos, coloque 10 mL de metanol em um recipiente de 15 mL (será necessário cerca de 1 mL por lâmina) em um freezer a -20 °C.
6. Remova cuidadosamente o cavaco do termociclador, transfira o para a bancada e retire a fita de vedação.
7. Remova e descarte o reagente de reticulação FFPE usando uma pipeta. Depois que todos os reagentes de reticulação forem removidos, retire e descarte o e a junta.
8. Equilibre o slide Stereo-seq à temperatura ambiente ~23 °C. Sob uma hotte estéril, seque a borda da lâmina e aplique uma nova câmara de silicone (se aplicável). Adicione 500 μL de metanol resfriado do freezer a -20 °C, certificando-se de que toda a seção esteja completamente submersa por 20 min.
   NOTA: Alternativamente, toda a lâmina Stereo-seq pode ser submersa em um tubo cônico de 50 mL cheio de 30 mL de metanol resfriado.
9. Pré-aqueça a solução 1x PR em um bloco seco a 37 °C por 10 min antes de usar cerca de 5 min antes do final da fixação do metanol (etapa 7.8).
10. Após a conclusão da fixação, mova a corrediça para uma hotte estéril. Limpe qualquer excesso de metanol na lâmina e aguarde a evaporação do metanol restante no chip (~ 5 min). Monte um novo e uma nova junta. Assim que o metanol tiver evaporado completamente, coloque a lâmina do chip Stereo-seq no.

8. Permeabilização e transcrição reversa

NOTA: Para as etapas 8.1-8.11, pipete lentamente e não toque no chip. O excesso de pressão causará difusão ou marcas nos DNBs.

1. Adicione 200 μL de reagente de permeabilização ao chip. Aplique fita de vedação no deslizante Stereo-seq e certifique-se de que esteja bem fechado.
2. Incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Prepare o tampão de lavagem adicionando 380 μL de 0,1x SSC e 20 μL de RI (inibidor de RNA) para cada lâmina. Faça 400 μL por lâmina e mantenha no gelo até o uso.
4. Retire os reagentes para transcrição reversa FFPE (FFPE RT), depois gire todos os itens a seguir e mantenha a mistura enzimática, oligos e dímeros no gelo. Aqueça o buffer FFPE RT à temperatura ambiente (~23 °C).
5. 5 min antes do min antes do final da permeabilização, prepare 200 μL por chip de mistura FFPE RT. Adicione tampão FFPE RT (158 μL), mistura enzimática FFPE RT (30 μL), oligo FFPE RT (10 μL) e dímero FFPE (2 μL). Misture delicadamente e mantenha no gelo.
6. Mantendo o chip no termociclador, altere a temperatura de incubação para a temperatura ambiente (~ 23 °C). Remova o selo e descarte cuidadosamente a solução 1x PR.
7. Lave o cavaco muito suavemente com 200 μL de SSC 0,1x (com 5% RI) por chip de 1 cm² .
8. Remova a lavagem SSC 0.1x (com 5% RI) do canto do chip.
9. Adicione 200 μL de solução FFPE RT no canto do chip.
10. Aplique fita adesiva no deslizante Stereo-seq e certifique-se de que esteja bem fechado; caso contrário, a evaporação reduz o rendimento.
11. Inicie o protocolo FFPE RT reação isotérmica de incubação a 42 °C com tampa aquecida a 45 °C por (5 a 24 h).
    NOTA: Recomenda-se incubar por 12 a 16 h e ser consistente entre os experimentos.

9. Liberação e purificação do cDNA

NOTA: Para as etapas 9.6-9.7, pipete lentamente e não toque no chip. O excesso de pressão causará difusão ou marcas nos DNBs.

1. Preparar 400 μl de tampão de libertação de cDNA aquecendo o tampão de libertação de cDNA a 55 °C para dissolver qualquer precipitado que se possa ter formado.
2. Equilibre o tampão de liberação de cDNA a uma temperatura ambiente quente (25 ° C). Não coloque gelo.
3. Girar o tampão de libertação de cDNA e a enzima de libertação de cDNA a 100 x g numa centrifugadora de mesa antes de utilizar.
4. Prepare o tampão de cDNA adicionando 20 μL de enzima de liberação a 380 μL de tampão de liberação de cDNA.
5. Mantendo o chip no termociclador, altere a temperatura de incubação para a temperatura ambiente (~ 23 °C). Remova o selo e remova e descarte cuidadosamente a solução FFPE RT.
6. Lave o cavaco uma vez, incrivelmente suavemente, com 0,1x SSC por cavaco (200 μL).
7. Remova 0,1x SSC do canto do chip, pipetando com muito cuidado.
8. Adicione 400 μL da solução de liberação de cDNA preparada a cada chip.
9. Sele o deslizante Stereo-seqs aplicando fita adesiva (ou tampa PCR) no. Certifique-se de que o esteja bem vedado para evitar qualquer evaporação, vazamento ou contaminação.
10. Incubar a 55 °C durante ≥ 5 h (mínimo de 5 h até 24 h) com a tampa aquecida a 60 °C.
    NOTA: Recomenda-se incubar por 5 a 7 h ou ser consistente em experimentos com 2 h.

10. Colete a mistura de liberação de cDNA

1. Pré-aqueça o NFW a 37 °C (pelo menos 500 μL por chip de 1 cm²).
2. Remova o selo e pipete vigorosamente em cada canto e centro do chip sobre o tecido, mas não raspe ou toque no tecido. Reúna toda a mistura de liberação de cDNA do chip e transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 ou 2,0 mL. Registre os números de identificação do chip (ID do chip) em cada tubo.
3. Adicione 350 μL de NFW pré-aquecido diretamente na superfície do cavaco. E mais uma vez pipete vigorosamente com uma pipeta menor (P100 ou P200), inclinando a ponta para aplicar mais força de cisalhamento, mas não toque no tecido ou descarte o cavaco.
4. Combine a lavagem da etapa 10.3 (350 μL) com a mistura de liberação de cDNA da etapa 10.2 (400 μL). Certifique-se de combinar apenas as amostras de um único chip.
5. Coloque 100 μL de NFW no chip, sele a lâmina do chip Stereo-seq no e guarde-o na geladeira até o final do protocolo.
   NOTA: Em casos de baixo rendimento, considere liberar novamente o cDNA. A presença de DNA no chip pode ser avaliada usando um corante ssDNA e reimagem com ou sem lamínula.

11. Colete a limpeza do grânulo do cDNA

1. Ressuspenda o cDNA da etapa 10.4 com um volume igual de grânulos de imobilização reversível em fase sólida (SPRI). Misture até que as esferas estejam uniformemente distribuídas por toda a solução para selecionar fragmentos de DNA acima de ~ 100 pb.
2. Incubar durante 10 min a uma temperatura de 27 °C a 37 °C (recomenda-se 30 °C).
   1. Durante a incubação. Prepare 5 mL de etanol fresco a 80% em NFW para cada 2 chips processados.
3. Pegue os tubos com a mistura de esferas incubada e gire brevemente a 100 x g em uma centrífuga de mesa.
4. Coloque os tubos em um rack de separação magnética e incube por pelo menos 5 min (até que o líquido fique claro).
5. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas e guarde-o em um tubo limpo e rotulado. Rotule a liberação do cDNA com ID do chip e data.
6. Adicione 1,5 mL de etanol a 80% aos tubos sem perturbar os grânulos e incube por 30 s antes de remover o etanol.
7. Repita a etapa 11.6 mais uma vez, desta vez removendo o máximo de etanol possível usando uma pequena ponta de pipeta sem perturbar as contas.
8. Seque as contas ao ar nos tubos até que não sejam mais reflexivas. O tempo pode variar, portanto, verifique regularmente para evitar o ressecamento excessivo (rachaduras), o que resultará em baixo rendimento.
   NOTA: Meça a umidade e a temperatura da sala. Em altas temperaturas (27 °C) e baixa umidade (menos de 20%), as esferas secarão muito rapidamente (3 a 5 min). Em baixas temperaturas (23 °C) e alta umidade (mais de 40%), as esferas secarão muito mais lentamente (7 a 15 min).
9. Remova os tubos de esferas do suporte magnético, adicione 22 μL de NFW e misture por vórtice.
10. Incubar em banho seco ou máquina de PCR a 27 °C durante 5 a 15 min.
11. Centrifugue brevemente e coloque o tubo de volta no rack de separação magnética até que o líquido fique claro (2 a 5 min).
12. Transfira 21 μL de sobrenadante contendo cDNA para o tubo de PCR de 0,2 mL marcado com amostra sem perturbar os grânulos.
13. Repita as etapas 11.9 a 11.12 para cada tubo, coletando um total de 42 μL de cDNA. Continue diretamente com a amplificação do cDNA (etapas 12.1 a 12.8).
    NOTA: O atraso no início da amplificação resultará em diminuição do rendimento, aumento de leituras curtas e degradação do molde de DNA de fita simples.

12. Amplificação do cDNA

1. Remova a mistura de amplificação de cDNA e os primers de cDNA FFPE do freezer e coloque-os em gelo úmido para descongelar.
2. Gire a mistura de amplificação de cDNA e os primers de cDNA FFPE em uma centrífuga de mesa a ~ 100 x g.
3. Adicione 50 μL de solução de amplificação de cDNA e 8 μL de primers de cDNA FFPE a cada tubo de cDNA a partir de 42 μL de (etapa 11.13) e coloque em um termociclador com o adaptador de tampa plana para evitar a deformação do tubo.
4. Execute o programa termociclador para a amplificação do cDNA: desnaturação inicial: 95 °C por 5 min; ciclismo: [98 °C durante 20 s, 58 °C durante 20 s, 72 °C durante 3 min] × 15 ciclos; extensão final: 72 °C por 5 min; temperatura de retenção: 12 °C (se processar imediatamente) / 4 °C (se mantido durante a noite).
5. Meça a concentração de DNA de 1 μL de cDNA antes e depois da limpeza do grânulo.
   NOTA: A quantidade de produto de cDNA antes da limpeza deve ser calculada para exceder 1 μg para cada chip de 1 cm². A concentração pós-limpeza deve ser de pelo menos 10 ng/μL. Rendimentos mais baixos são normalmente associados à redução da diversidade de bibliotecas. A perda significativa de amostra nesta fase está correlacionada com as pontuações do DV200; no entanto, o DV200 não é um preditor perfeito de resultados.
6. Repita a limpeza do grânulo de cDNA das etapas 11 (limpeza do grânulo) utilizando o produto de PCR da etapa 12.4, com três modificações: use um rack magnético de PCR menor, adicione apenas 200 μL de etanol a 80% na etapa 11.6 e ressuspenda em 22 μL de tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8) na etapa 11.9.
7. Armazene as contas em um tubo com 20 μL de NFW, rotulado com nomes de amostra, código de barras, data e ID do chip.
8. Meça a distribuição de fragmentos de cDNA usando um analisador de fragmentos. A faixa de tamanho do fragmento deve estar entre 250-400 pb. Se os fragmentos forem muito pequenos, repita a limpeza do grânulo, mas use temperatura ambiente (~ 25 ° C) em vez de 27 ° C.
   PONTO DE PARADA OPCIONAL: Após a medição do cDNA, ele pode ser armazenado em -20 °C por até 1 mês e -80 °C por até 1 ano. As contas podem ser armazenadas em NFW por 1 semana a 4 °C. Não congele as contas.

13. Preparação da biblioteca (Dia 4)

1. Preparação da mistura de reação de amplificação
   1. Remova a solução de amplificação de PCR da biblioteca, os conjuntos de código de barras da biblioteca, o produto cDNA e o NFW. Descongele o cDNA e os reagentes em gelo e água à temperatura ambiente e gire a 100 x g por 10 s.
2. Determine a estratégia de código de barras da biblioteca para cada 25 μL de mistura de primer de código de barras PCR.
   NOTA: Para este sequenciador, todas as bases devem ser representadas igualmente em cada posição em um conjunto de código de barras. A maioria dos kits comerciais compatíveis com isso são, portanto, projetados com tétrades de código de barras predefinidos (conjuntos de quatro). Essas tétrades podem ser aplicadas a amostras individuais ao se dividir em uma pista de sequenciamento, ou podem ser agrupadas para uma única amostra ao sequenciar uma amostra por raia. Manter códigos de barras balanceados é imperativo, pois códigos de barras desbalanceados reduzirão a quantidade de dados utilizáveis gerados pelo sequenciador.
3. Determine o volume de cDNA para 20 ng (por exemplo, 10 ng/μL precisaria de 2 μL). Usando isso, faça uma solução NFW (25 μL) de cDNA diluído (diluir para ~ 1 ng / μL).
4. Combine a mistura de amplificação de biblioteca (50 μL) com cDNA diluído em NFW (25 μL) e a mistura de primer de código de barras PCR (25 μL) para o tubo de PCR de 0,2 mL.
5. Misture o poço pipetando e gire a 100 x g por 10 s. (Não vórtice)
6. Coloque os tubos de PCR de 0,2 mL no termociclador e certifique-se de ter uma inserção para evitar que os tubos sejam esmagados.
7. Execute o programa termociclador para a amplificação do cDNA: desnaturação inicial: 95 °C por 5 min; ciclismo: [98 °C por 20 s, 58 °C por 20 s, 72 °C por 3 min] × 8 ciclos; extensão final: 72 °C por 5 min; temperatura de retenção: 12 °C (se processar imediatamente) / 4 °C se mantido durante a noite.
   NOTA: É possível usar quantidades variadas de cDNA de entrada para preparar a biblioteca. No entanto, a quantidade usada afetará o número de ciclos de PCR necessários para amplificação. Por exemplo, o fornecedor recomenda 20 ng de DNA de entrada e o uso de 8 ciclos. Também é possível usar 40 ng com 7 ciclos ou 80 ng com 6 ciclos. Não é recomendado o uso de menos de 20 ng ou mais de 80 ng de cDNA de entrada.

14. Limpeza do grânulo de amplificação da biblioteca

1. Quantifique o produto de biblioteca bruta conforme feito na etapa 12.5.
2. Repita a limpeza do grânulo da etapa 11 (limpeza do grânulo) utilizando o produto bruto da biblioteca da etapa 13.7 com três modificações: use o grânulo de proporção de 0,8:1 para o produto, use um rack magnético de PCR menor, use apenas 200 μL de etanol a 80% em comparação com a etapa 11.7 e ressuspenda em 22 μL de tampão TE (pH 8) na etapa 11.9. Prepare cerca de 1mL de etanol fresco a 80% por dois chips de 1cm² .
3. PONTO DE PARADA OPCIONAL: Após a medição da biblioteca, ela pode ser armazenada a -20 °C por até 1 mês e -80 °C por até 1 ano. As contas podem ser armazenadas na NFW por 1 semana a 4 °C. Não congele as contas.

15. Sistema DNBSEQ-T7RS para sequenciamento de DNBs com Oligonucleotídeos Aleatórios Stereo-Seq

1. Usando um kit PE75 no sistema DNBSEQ-T7RS, aloque os ciclos como 25 para a leitura 1 e 62 para a leitura 2 (PE25+62), seguidos por um índice de 10 pb:
   1. A primeira leitura (leia 1 de 25 ciclos) captura o ID do chip espacial (CID) ou informações específicas do local dos códigos de barras baseados em chip.
   2. A segunda leitura (leia 2 de 62 ciclos) captura o Identificador Molecular (MID), uma sequência aleatória de 6 pb, diretamente anexada às inserções do gene com 3 ciclos escuros adicionais usados para correção de fase e calibração de deslocamento de código de barras. Isso é seguido por uma inserção gênica de 30-59 pb da leitura 2, que é identificada pelo mapeamento para genomas ou transcriptomas conhecidos.
      NOTA: Inserções de genes mais longas são possíveis, mas exigiriam diferentes kits de extremidade emparelhados e modificação no fluxo de trabalho de mapeamento.
   3. O ciclo de índice para demultiplexação cobre 10 bps com base nos códigos de barras de sequenciamento agrupados na etapa 13.2.
      NOTA: Tempo de sequenciamento típico de aproximadamente 10-12 h para uma célula de fluxo de 75 PE. O sequenciamento é mais frequentemente feito em um núcleo de sequenciamento ou instalação comercial, e não em um processo interno para a maioria dos laboratórios, pois requer um DNBSEQ-T7RS ou instrumento de sequenciamento semelhante.

Results

Os dados abaixo demonstram a capacidade de realizar segmentação de célula única usando o pipeline SAW e mapeando para RNAs não poli adenilados, como tRNA (TRDMT1) de uma seção FFPE. Os dados imparciais do Stereo-seq permitem examinar a importância não apenas dos mRNAs, mas também dos tRNAs, rRNAs e RNAs não hospedeiros (se pertinente). Usando a saída direta do pipeline SAW¹⁶ e o stereopy para avaliação da qualidade da saída Stereo-...

Discussion

O protocolo Stereo-seq é altamente detalhado e envolve várias etapas críticas que exigem precisão, tempo e um ambiente limpo para garantir o sucesso, especialmente com perfis de microbioma ou não hospedeiros que podem exigir precauções específicas.

É necessário o uso de água livre de nuclease durante todas as etapas, e o chip de captura não deve ser tocado com nada além da amostra e dos reagentes. Tenha muito cuidado ao usar o conjunto do, reservando um tempo ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos centrífugos de 1,5 mL DNAse/RNAse regular	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	3456	Para misturar reagentes (outras bandas são boas) e nbsp;
100% etanol	Sigma-Aldrich	E7023	Grau molecular
Tubos centrífugos cônicos estéreis de polipropileno de 15mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339650	Usado para aliquotas
20x Concentrado  Tamponador de Citrato de Sódio Salino (SSC)	Sigma-Aldrich	S6639-1L	Usava para fazer 5X SSC para manchar e 1X SSC para etapas de lavagem e remoção do slip.
Instrumento bioanalisador 2100	Agilent	Descontado	Instrumento: Bioanalisador
Câmara de 3 Poços, removível	Ibidi	80381	Câmara de silicone para reduzir volumes durante a reidratação e fixação de metanol.
Fonte de Luz UV de 405nm	Vários	N/A	Para curar resina UV
Tubos centrífugos cônicos estéreis de polipropileno de 50mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339652	Usado para alíquotas e para deparafinização
Álcool Isopropanol Estéril 70%	Texwipe	TX3270	Para descontaminação superficial & nbsp;
Kit de DNA de Alta Sensibilidade Agilent	Agilent	5067-4626	Para caracterização de cDNA e bibliotecas por bioanalisadores
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513	Para caracterização de RNA por bioanalisadores
Folha de alumínio	Vários	N/A	Para cobrir a lâmina durante a coloração de ssDNA.
Beckman Coulter SPRIselect	Beckman Coulter Ciências da Vida	B23317/B23318/B23319	Limpeza de CDs e Biblioteca das Contas SPRI
Água sanitária	Vários	N/A	Limpeza da estação de trabalho removendo contaminação por microbioma
Swabs de Espuma Selados CONSTIX	Contec	19161023	Para limpeza precisa com resina
Cobertura	Sigma-Aldrich	BR470045-2000EA
Pacotes Dessecantes	Vários	N/A	Compressas dessecantes sem RNase e sem poeira.
Máscara Facial Descartável	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	12-888-001	Proteção, contaminação por RNAse e & esterilidade
Lenços para Apagar DNA	Sigma-Aldrich	L9060-250EA	Descontaminação por meio da limpeza das superfícies (lenços umedecidos)
Tubos de Ligação de DNA 1,5mL	Eppendorf	22431021	Usado para coleta de cDNA e amplificações pós-bibliotecas.
Tubos de Ligação LoBid de DNA 2mL	Eppendorf	22431048	Usado para coleta de cDNA antes da amplificação.
DNBSEQ OneStep Kit de Fabricar Reagentes DNB	Genômica Completa	940-001891-00	Reagentes para preparação e amplificação de nanobolas de DNA (DNB)
Kit de Reagentes de Limpeza DNBSEQ-T7RS	Genômica Completa	940-001903-00	Cartucho para lavagem após a conclusão do sequenciamento
Kit de Reagentes de Carga DNBSEQ-T7RS DNB	Genômica Completa	940-001894-00	Reagentes e placas para carregar DNBs na célula de fluxo
Célula de Fluxo de Sequenciamento DNBSEQ-T7RS	Genômica Completa	940-001902-00	1 faixa/célula de fluxo
Kit de Reagentes de Visualização Stereo-seq DNBSEQ-T7RS	Genômica Completa	940-001893-00	O cartucho e os reagentes para sequenciamento.
Sistema DNBSEQ-T7RS	Genômica Completa		Este conjunto de visualização stereo-seq utiliza a tecnologia DNBSEQ. Uma execução de sequenciamento começa com a hibridização de uma âncora de DNA, então uma sonda fluorescente é acoplada ao DNA Nanoball (DNB) usando a química do sequenciamento combinatório de âncoras de sonda (cPAS). Por fim, o sistema de imagem de alta resolução captura o sinal fluorescente. Após o processamento digital do sinal óptico, o sequenciador gera informações de sequenciamento de alta qualidade e precisas.
Ar comprimido com poeira	Matin	M-6318	É importante usar essa marca ou uma com propelente semelhante & nbsp;
Lâminas de micrótomo com rito de borda	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	4280L	Histologia - Usada na secção de amostras
Freezer à prova de explosão	Vários	N/A	Para resfriar o metanol antes e durante a fase de fixação do metanol.
Pincéis de Histologia	Vários	N/A	Histologia - Usada na secção de amostras
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	2104-50ML	Para diluir a enzima pré-muliablização em 0,01 N HCl (pH 2). A concentração padrão de estoque para solução de HCl é 0,1 N.
Sistema de Imagem	Vários	N/A	GC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Solução de Descontaminação RNaseZap RNase Invitrogen	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9780	Limpeza da estação de trabalho removendo contaminação por RNAse
Limpadores de Tarefas Delicados Kimtech	Kimtech	34155	Para secar bancadas, equipamentos, pipetas, etc.
Jaleco	Vários	N/A	Equipamentos de Proteção Individual (EP)
Papel de lente	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	11-997	Vários trabalhos para secar slides sem sheading
Lenços de Apagamento de DNA Lookout	Sigma-Aldrich	L9060	Limpeza da estação de trabalho removendo contaminação por PCR
Rack de Separação Magentic 5uL - 0,2	Permagen Labware	MSRLV08	Para separação de esferas em tubos de PCR
Rack Magjet 12x1,5 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	MR02	Para separação de esferas em tubos de 1,5 mL
Microtomo Rotativo Manual	Leica	RM2235	Histologia - Usada na secção de amostras
Methonal ≥ 99,9%, adequado para imunofluorescência, HPLC	Sigma-Aldrich	34860	Para fixação (precisa ser grau HPLC)
Pinças Microdissecantes	Sigma-Aldrich	F4142-1EA	Histologia - Usada na secção de amostras
Micropipeta	Vários	N/A
Água Livre de Nuclease de Grau Molecular Não Tratada com DPEC	Vários	N/A	Diluições e elusão das contas
Luvas de Nitrilo	Vários	N/A	EPI
Forno	Vários	N/A	Para assar o chip
Válvulas PCR 0,2 mL com tampas acopladas	Vários	N/A	Para aplicações de PCR
Capas de PCR	Vários	N/A	Substituição se o adesivo na cobertura fornecida for fraco
Cápsula e Cabeça de PCR Estação de trabalho	Mystaire	MY-PCR24-010	Para etapas pré-PCR (RNA para cDNA)
Medidor de pH	Vários	N/A	Medidor de pH para confirmar o pH do HCl.
Solução de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	A005-C	Opcional para aumentar a adesão do tecido ao lascamento
Fluorômetro Qubit 4	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q33226	Uterinamento; Medição de quantias de DNA
Kits de Quantificação de Quantificação de DNA dsDNA de Qubit	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q32851	Para medir cDNA e quantificações de bibliotecas
Kit de Ensaio de DNA para Qubit	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	P10212	Coloração por ssDNA (Apenas corante utilizado)
Bloco de Gelo sem RNAse	Vários	N/A	Histologia - Usada ao seccionar amostras para hidratar blocos antes da secção
Solução de Descontaminação RNase RNaseZap	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9782	Uma solução de descontaminação superficial que destrói RNAs
RNeasy FFPE Kit	Qiagen	73504 & 19093	Para extração de RNA e Extração de RNA Medição DV200
Sculpt Ultra White Resina	Siraya Tech	N/A	Resina curável por UV resistente a altas temperaturas
Kit de Preparação da Biblioteca de Código de Barras Stereo-seq 16	STOmics / Genômica Completa	111KL160	Para construir a biblioteca FFPE Stereo-seq OMNI
Kit de Acessórios FFPE Stereo-seq	STOmics / Genômica Completa	310AK002	Peças acessórias espaciais OMNI do kit 211SN114
Deslizamento estéreo com chip N (1cm x 1cm)	STOmics / Genômica Completa	210CN114	Chip espacial OMNI parte do kit 211SN114
Adaptador de PCR estéreo seq	STOmics / Genômica Completa	301AUX001	Para etapas de hibridização PCR modificadas para encaixar três, semelhante ao Adaptador de Hibridização Situ PCRmax
Kit de Transcriptômica N estéreo-seq	STOmics / Genômica Completa	211KN114	Parte do kit 211SN114 do OMNI Espacial
Lâmina de barbear industrial de uso geral para design cirúrgico	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-812-236	Histologia - Usada na secção de amostras
Solução tampão TE pH 8,0	Sigma-Aldrich	8890	Para elução de cDNA e bibliotecas
Ciclistas Térmicos	BioRad / vários	1861096 /12015392 / vários	Máquina de PCR com tampa manual ou opções de poço profundo (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler, etc.)
Kits de tampão de pH All-in-One Thermo Scientific Orion	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-624-500
Banho de Flutuação de Tecido - Digital XH-1003	Estreia	NC0779538	Histologia - Usada na secção de amostras
Óculos com proteção UV	Vários	N/A	Para segurança durante a cura UV
Xilenos	Sigma-Aldrich	247642	Para a desparafinização