Este protocolo cirúrgico é um guia passo a passo para inserir um cateter intratecal no espaço subdural espinhal de um roedor para fornecer tratamento direcionado.
Artigo de método
Acessando o espaço subdural da medula espinhal de roedores para administração de tratamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tratamento de doenças ou lesões da medula espinhal é desafiador, em parte, devido às dificuldades no desenvolvimento de tratamentos eficazes que possam ser aplicados diretamente na medula. Os tratamentos atuais para lesão medular (LM), por exemplo, são principalmente epidurais. No entanto, as terapias peridurais não permitem interação direta com a medula espinhal, reduzindo o potencial efeito do tratamento. Aqui, é proposto um método para acessar o espaço subdural em um modelo de roedor para um efeito mais direto de um determinado tratamento. Usando o protocolo descrito, foi realizado um implante subdural bem-sucedido de um dispositivo bioeletrônico para registro/estimulação da medula espinhal, bem como a inserção segura de um hidrogel carregado com neurotrofina-3. Os animais expostos a este protocolo em ambas as aplicações não apresentaram alteração na função dos membros posteriores ou anteriores após o procedimento, e nenhuma disfunção se desenvolveu por até 12 semanas após o procedimento. Embora os exemplos apresentados aqui sejam altamente específicos, o protocolo proposto pode ser usado em uma variedade de aplicações para permitir um tratamento localizado mais eficaz de distúrbios neurológicos da medula espinhal.
Introdução
Doenças e lesões da medula espinhal podem ter efeitos devastadores em milhões de pessoas em todo o mundo, resultando em encargos sociais, econômicos e de saúde significativos 1,2. Lesões na medula espinhal e doenças neurodegenerativas podem levar a disfunções motoras, sensoriais e autonômicas crônicas que reduzem a qualidade de vida e a independência dos indivíduos afetados. Os tratamentos atuais, como intervenção cirúrgica e farmacoterapia, concentram-se na mitigação do trauma inicial e no manejo das complicações secundárias3. No entanto, essas abordagens raramente alcançam regeneração neural substancial ou recuperação funcional, deixando uma necessidade urgente de intervenções mais eficazes que visem os mecanismos subjacentes.
Uma das principais preocupações das estratégias de tratamento atuais é a localização e a entrega de um tratamento desejado. Tratamentos como neuromodulação ou intervenção farmacêutica têm a capacidade de influenciar a atividade neuronal, facilitar a recuperação funcional e potencialmente restabelecer conexões em circuitos espinhais danificados4. A estimulação da medula espinhal pode levar a melhorias no controle motor e redução da dor5. No entanto, essas estratégias atualmente se limitam à entrega indireta ao tecido lesado, com foco no espaço peridural, não considerando a barreira da dura-máter da medula espinhal 6,7,8. Embora os tratamentos epidurais tenham mostrado benefícios clínicos, eles são limitados devido ao acesso indireto às populações neuronais alvo, levando a efeitos potencialmente reduzidos dos agentes terapêuticos.
Nosso grupo trabalhou para superar essas limitações associadas às estratégias focadas na epidural e explorar o potencial de administração direta do tratamento subdural em modelos de lesão medular (SCI). A inserção de cateteres no espaço subdural permite que o tratamento seja aplicado diretamente na medula espinhal, proporcionando maior interação com o tecido neural afetado 9,10. A administração subdural também reduz os efeitos de barreira da dura-máter, melhorando a eficácia da estimulação elétrica e dos sistemas de liberação de medicamentos direcionados11,12. Este método pode melhorar a precisão e a eficácia do tratamento, potencialmente levando a melhores resultados na recuperação funcional.
Este artigo descreve um protocolo passo a passo para acesso seguro ao espaço subdural da medula espinhal de roedores. Este procedimento é focado na região torácica da coluna vertebral (T10-T12), no entanto, pode ser implementado em diferentes locais da medula, conforme necessário. Os pontos anatômicos são especificados, permitindo a identificação da região, e são apresentadas instruções detalhadas sobre a laminectomia, durotomia e penetração da dura-máter. Duas aplicações deste protocolo também são apresentadas, incluindo a implantação de um dispositivo de estimulação elétrica, bem como a administração de um sistema de liberação de medicamentos em hidrogel (Figura 1). As etapas descritas são facilmente reproduzíveis por pesquisadores com experiência em cirurgia de roedores. Este protocolo é escrito no contexto de um modelo de contusão de LME; no entanto, o modelo específico de lesão pode ser modificado dependendo dos resultados experimentais desejados. A técnica descrita aqui não apenas é promissora para o avanço do tratamento da LME, mas também pode fornecer uma plataforma para pesquisas futuras sobre reparo e regeneração da medula espinhal por meio de intervenções precisas e localizadas.
Protocolo
Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas da Universidade de Auckland e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal (AEC) da instituição e pelos Oficiais de Bem-Estar Animal (AWO) da universidade. Ratos Sprague-Dawley fêmeas pesando 240-260 g foram usados e alojados em grupo (21 °C; 12 h:12 h, ciclo claro: escuro) e receberam acesso ad libitum à dieta padrão de roedores antes e após a cirurgia. Recomenda-se tentar primeiro este protocolo na ausência de um modelo de lesão, pois a intenção é fornecer acesso seguro ao espaço subdural da medula espinhal de roedores. Este é um primeiro passo importante para demonstrar que o protocolo pode ser aplicado sem causar lesão, permitindo um exame mais preciso de um modelo de lesão desejado. O protocolo é adequado para ser combinado com os diversos modelos de lesões utilizados pelos grupos de pesquisa. Portanto, o protocolo não descreve etapas específicas de entrega de lesões, pois elas variam de acordo com a aplicação. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparo pré-operatório
- Esterilize todos os instrumentos (Figura Suplementar 1) e os consumíveis relevantes.
- Pese o(s) rato(s) a ser submetido à cirurgia no dia seguinte.
- Calcular as doses adequadas de medicamentos a serem administrados; bupivacaína (analgésico) @ 2 mg/kg, dose - 0,08 mL/100 g; meloxicam (analgésico) @ 2 mg/kg, dose - 0,04 mL/100 g; buprenorfina (analgésico) @ 0,03 mg/kg, dose - 0,1 mL/100 g; enrofloxacina (antibiótico) @ 10 mg/kg, dose - 0,08 mL/100 g12,13.
NOTA: A bupivacaína foi administrada por via subcutânea em 3-4 locais ao longo do local cirúrgico antes da incisão inicial.
2. Preparo cirúrgico
- Certifique-se de que o sistema de anestesia esteja configurado corretamente (verifique se todos os tubos associados ao sistema de oxigênio e anestesia estão configurados corretamente).
- Prepare as injeções necessárias com base no peso dos ratos, bem como uma injeção de 3 mL de solução salina a ser administrada antes do início.
- Certifique-se de que a almofada térmica (temperatura de manutenção de 37 °C), lamp, microscópio e barbeador, estão todos configurados e funcionais.
NOTA: Nenhuma ampliação específica para o microscópio de dissecação é necessária, pois a ampliação varia de acordo com a preferência do usuário e a visibilidade durante o procedimento.
CUIDADO: Certifique-se de que a temperatura do animal não caia abaixo de 35°C ou exceda 40°C durante o procedimento
3. Preparação do animal
- Certifique-se de que todos os tubos associados ao sistema de anestesia e ao tanque de oxigênio estejam conectados. Se estiver usando o sistema de anestesia usado neste estudo (consulte a Tabela de Materiais), defina a indução de isoflurano para 3% e insira o peso do animal no sistema de anestesia para definir a taxa de fluxo de oxigênio para anestesia de manutenção (Figura Suplementar 1A).
NOTA: Mantenha a anestesia a um nível de manutenção adequado para cada animal. Isso pode variar entre 1,3% e 2%, dependendo do animal. - Coloque o rato na câmara de indução até que ele não consiga se endireitar, mude para o nível de manutenção de isoflurano desejado e mova o rato para o cone do nariz.
- Administre 3 mL de solução salina e injeções de medicamentos necessárias, por via subcutânea, antes do barbear.
NOTA: Após injeções de solução salina e barbear, injete a bupivacaína em vários pontos ao longo do local da incisão pretendido - Enquanto monitora o nível de anestesia do animal, prepare todos os instrumentos (microscópio, ferramentas, campos estéreis) na área cirúrgica. Coloque uma cortina estéril para as ferramentas na área desejada e organize as ferramentas na cortina, mantendo o campo estéril.
- Raspe o pelo ao longo das costas do animal, da base do pescoço até o topo dos quadris.
- Desinfete a área com esfoliante clorexi, seguido de tintura de clorexa, usando um movimento circular saindo do centro da área raspada (3x) e aplique lubrificante nos olhos para evitar o ressecamento.
- Transfira o rato para a almofada de aquecimento sob o microscópio, coloque uma prensa e sele a cortina sobre a área raspada e faça um orifício grande o suficiente para expor o campo cirúrgico, mas não tão grande a ponto de expor qualquer pelo não raspado.
- Coloque uma sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura do animal e mantenha ~ 37 ° C com a almofada de aquecimento. Administre verificações de bem-estar animal a cada 5-10 minutos.
- Administre o reflexo podal para confirmar o plano cirúrgico da anestesia e inicie o procedimento.
4. Dissecção de tecido da coluna vertebral
- Com lâmina de bisturi, fazer uma incisão linear (~6-8 cm) no sentido rostral para caudal (Figura 2A), começando abaixo da base do pescoço e estendendo-se sobre a giba torácica, expondo as vértebras T9-T13.
- Emparelhe suavemente o tecido conjuntivo sob o local da incisão com pinça Graefe ou tesoura de micro mola, para expor diretamente o tecido muscular na coluna.
- Identifique o processo T13 localizando os dois tendões brancos em forma de V perto da metade caudal da incisão. O processo espinhoso diretamente rostral ao V no lado da cauda do animal é T13 (Figura 2B).
- Começando em T13 e subindo até T9, faça pequenas incisões nos tecidos conjuntivos entre cada processo para separá-los antes de limpar o músculo, para ajudar a manter a localização à medida que o procedimento avança (Figura 2C). Em seguida, corte os canais no músculo que correm paralelos a ambos os lados dos processos espinhosos usando microscripers. Faça isso em ambos os lados da coluna para expor a lâmina de cada segmento da coluna vertebral (Figura 2D).
- Prenda grampos serrefine em ambos os lados das paredes musculares para manter um campo de visão aberto para a coluna. Anexe um par nas laterais de T13, outro na borda T11 / T12 e outro em T11 / T10 (Figura 2E).
- Uma vez formados os canais claros, corte o tecido conjuntivo entre cada processo usando microtesouras ou rongeurs (Figura 2F).
- Limpe os canais até que o tecido conjuntivo e o músculo sejam dissecados de forma limpa de cada lâmina, da parte rostral de T13 para a parte caudal de T9, expondo os segmentos T10-12 para o procedimento de laminectomia. A conclusão bem-sucedida é indicada por uma lâmina claramente visível em ambos os lados dos processos.
NOTA: Um microscópio não é necessário para a etapa 4, mas é altamente recomendado.
5. Laminectomia
- Localize a porção caudal da lâmina T12 que se sobrepõe à porção rostral de T13, posicione a ponta dos rongeurs por baixo e comece a remover suavemente os pedaços de lâmina, conforme recomendado nos protocolos JoVE padrão14,15 (Figura 2G).
NOTA: Use uma pinça para segurar o processo espinhoso de cada lâmina para manter a estabilidade e "levantar" suavemente as placas durante cada corte com os rongeurs (Figura 2G). Ao deslizar a ponta dos rongeurs por baixo da lâmina, mantenha a pressão externa longe da medula espinhal para minimizar possíveis danos.
CUIDADO: Tenha cuidado para não empurrar os rongeurs muito para baixo ao fazer cortes, pois isso pode danificar a dura-máter e/ou a própria medula espinhal. - Movendo-se de um lado para o outro, continue cortando pedaços de osso da lâmina T12 até que haja espaço suficiente para estender o corte até a linha média do processo, expondo a medula espinhal, com um orifício de aproximadamente 5 mm de diâmetro (Figura 2H).
NOTA: A remoção do osso da coluna vertebral pode resultar em sangramento que pode reduzir a visibilidade durante o procedimento. Use cotonetes ou lenços umedecidos enrolados (Figura Suplementar 1B) para gerenciar isso durante a realização da laminectomia. - Trabalhe os rongeurs sob a lâmina de ambos os lados e, em seguida, limpe um canal uniforme para a porção cranial de T12 ( Figura 2I ).
NOTA: A medula espinhal ficará visível à medida que pedaços da placa laminar forem removidos para cada segmento da coluna vertebral. - Repita as etapas 5.1 a 5.3 para remover T11 e T10.
- Continuar laminectomia, mantendo cortes uniformes em ambos os lados, movendo-se rostralmente até T9 (Figura 2J).
NOTA: Para procedimentos de contusão SCI (consulte a seção Resultados representativos), a lâmina acima do segmento / segmentos da medula espinhal desejados precisa ser limpa o suficiente para permitir o uso de um dispositivo de lesão por contusão (consulte a área alargada no meio da Figura 2K). Para a administração de medicamentos, a laminectomia pode ser ampla o suficiente para visualizar a aplicação do composto desejado. - Lave suavemente o saco tecal com solução salina e prepare a área desejada para a durotomia assim que a laminectomia estiver concluída e uma área suficiente de T10-T12 tiver sido removida (Figura 2K).
NOTA: Este procedimento é específico para acessar os segmentos da coluna vertebral (T10-T12), no entanto, esses métodos podem ser usados para realizar laminectomias em vários segmentos ao longo da coluna.
6. Durotomia para aplicação de tratamento
- Realizar a durotomia (incisão da dura-máter) utilizando o escopo de dissecção para acessar o espaço subdural da medula espinhal (Figura 3A).
NOTA: Ajuste a ampliação do endoscópio com base na preferência do cirurgião pela visibilidade da dura-máter. - Dobre uma agulha de 27 G em um ângulo de 90 graus com o chanfro voltado para cima (Figura 3B).
NOTA: Use um par de chaves de agulha ou hemostáticos para segurar a agulha ao dobrar. - Perfure suavemente a dura-máter com a ponta da agulha no ponto de entrada desejado na medula espinhal (Figura 3B).
CUIDADO: Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal subjacente ou seu vaso sanguíneo mediano. - Uma vez que a dura-máter é perfurada, levante suavemente a agulha dorsalmente para rasgar um orifício circular na dura-máter, não mais do que 2 mm, em ambos os lados do vaso sanguíneo da linha média. Uma durotomia bem-sucedida é indicada por uma pequena quantidade de vazamento de líquido cefalorraquidiano (LCR) de qualquer um dos orifícios.
NOTA: Mantenha uma distância de pelo menos alguns mm do final da laminectomia para facilitar o acesso ao espaço subdural. Se necessário, reinsira cuidadosamente a ponta da agulha no orifício inicial para aumentar seu tamanho. - Certifique-se de que a posição selecionada para a incisão da durotomia e que a posição imediatamente à frente esteja livre de vasos sanguíneos ramificados do vaso sanguíneo da linha média.
CUIDADO: NÃO danifique o vaso sanguíneo da linha média, pois isso causará sangramento excessivo, impedindo a conclusão do procedimento. - Usando os orifícios feitos na dura-máter, aplique o tratamento desejado ou implante um dispositivo no espaço subdural. Para este protocolo, cateteres intratecais são usados para a administração do tratamento para guiar o dispositivo de estimulação para a posição ou injetar o hidrogel (Figura 3C).
NOTA: Mantenha um campo de visão claro limpando continuamente qualquer sangue e/ou LCR após durotomias. - Certifique-se de que as pontas dos cateteres estejam visíveis sob a dura-máter antes de progredir para a medula espinhal. Uma aplicação bem-sucedida é indicada por cateteres que se movem suavemente pelos pequenos vasos sanguíneos espinhais enquanto estão sob a membrana dural.
- Após a administração do tratamento desejado (Figura 3D, E), coloque um pedaço de gelfoam cirúrgico estéril no espaço criado pela laminectomia para auxiliar na hemostasia, cicatrização de feridas e manutenção da estrutura da coluna.
- Após a colocação da espuma de gel, use a sutura absorvível de polidioxanona 4-0 para fechar a camada muscular e cutânea acima da coluna.
7. Cuidados pós-operatórios
- Verifique os animais diariamente e administre os medicamentos pós-operatórios necessários (buprenorfina por 2 dias; enrofloxacina e meloxicam por até 5 dias). Administre 1-3 mL de solução salina por via subcutânea conforme necessário (se <10% do peso corporal da água for consumido durante 24 h durante o período pós-operatório).
- Dependendo do procedimento, monitore a função da bexiga, a função motora, a escala da careta e quaisquer outros sinais de bem-estar animal.
- Remova as suturas da pele aproximadamente 10-14 dias após a cirurgia.
Resultados
O protocolo proposto foi aplicado em dois cenários experimentais diferentes. Os dados apresentados são representativos dos grupos não lesados, pois a intenção era demonstrar que as manipulações subdurais descritas no procedimento (na ausência de um modelo de lesão) não prejudicam a função. Um dispositivo bioeletrônico foi implantado (Figura 1A) ou um hidrogel foi administrado (Figura 1B) em ratos Sprague-Dawley de 6 a 8 semanas de idade. A função motora desses animais foi comparada à de animais controle submetidos à cirurgia simulada sem procedimento subdural usando a escala de função motora BBB. Vários grupos de animais estão aqui representados, mostrando a viabilidade de cada procedimento e sua segurança. Após cada procedimento, todos os animais mantiveram a função motora normal, sem diferença no escore BBB entre os grupos 7 dias após o procedimento, indicando a implementação segura do protocolo descrito. Além disso, um grupo de animais (Figura 4C) demonstrando comprometimento da função motora dos membros posteriores é representado para comparação com os grupos de procedimento subdural, para demonstrar ainda que nenhum efeito adverso foi observado nos grupos experimentais. Este grupo recebeu um procedimento de contusão SCI com um dispositivo de impacto de força de 175 kdyn, conforme descrito na literatura anterior12,13.
Implante bioeletrônico
Para implantação do dispositivo, o protocolo inclui a criação de dois locais de durotomia - um para entrada do cateter e outro para saída - para facilitar a movimentação dos cateteres-guia sob a dura-máter e a colocação controlada do dispositivo. O dispositivo bioeletrônico consistia em dois braços bifurcados conectados a uma interface PCB que é encapsulada por uma caixa biocompatível. Os braços são temporariamente conectados a pequenos cateteres intratecais por meio de sutura de seda 7-0 para auxiliar no posicionamento do implante. Os cateteres são puxados lentamente através dos orifícios de durotomia rostral, deslizados sob a dura-máter e através dos orifícios de saída da durotomia caudal ao local do tratamento. Os braços de implante anexados foram então puxados e posicionados em cada hemisseção da medula espinhal. A extremidade da cauda do implante é suturada ao músculo ligado ao processo T13. O invólucro é suturado ao músculo trapézio/grande dorsal rostral à laminectomia. A pele é então fechada ao redor da base da unidade habitacional para fornecer acesso externo.
Tratamento com hidrogel
Para a entrega de hidrogel, apenas um ponto de entrada é necessário. O hidrogel foi administrado por meio de cateteres intratecais semelhantes posicionados no mesmo local do dispositivo de estimulação. Os cateteres foram carregados com 10 μL de hidrogel de poloxâmero12 e inseridos no espaço subdural da mesma forma que as etapas de implantação do dispositivo. Uma vez no lugar, os cateteres foram lentamente retraídos enquanto o hidrogel era continuamente liberado sob a dura-máter (Figura1B) em cada hemi-cordão. Após cada procedimento, os animais foram monitorados por 7 dias para garantir uma recuperação adequada.
A escala de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) de 21 pontos foi utilizada para avaliação da funçãomotora 16. Os animais de ambos os grupos foram avaliados antes do procedimento (linha de base) e 1, 3 e 7 dias após a cirurgia. O comportamento em campo aberto foi avaliado diretamente e por meio de gravações de vídeo cegas. Os escores de função motora para os membros posteriores esquerdo e direito para cada grupo foram comparados com animais de controle não operados e um grupo SCI separado para determinar a extensão de quaisquer efeitos adversos da cirurgia. Os animais do grupo implante ou hidrogel não apresentaram déficit na função motora após qualquer procedimento, quando comparados aos controles não operados ou animais lesionados com LME. Para notar, a análise histológica confirmando a ausência de lesão medular já foi publicada em nosso trabalho anterior. Esse estudo demonstrou que o uso desse método para implantar um dispositivo não produz trauma medular adicional até 7 dias após o procedimento11. Alterações mínimas na atividade dos astrócitos (GFAP) e da micróglia/macrófago (Iba1) foram observadas após a implantação de um dispositivo em comparação com animais de controle. A área de superfície e a redondeza das seções coronais da medula espinhal diretamente sob o implante também foram examinadas, não mostrando nenhuma alteração na morfologia.
Figura 1: Estratégias de tratamento subdural. (A) Exemplo do dispositivo de implante e (B) cateter/seringa usado para injetar o hidrogel. (C) Modelos representativos da inserção do implante e do hidrogel na medula espinhal de um rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens da laminectomia, representando o campo cirúrgico. (A) Orientação do animal para imagens cirúrgicas na Figura 2 e Figura 3. (B) Pontos de referência do tendão muscular para a localização do processo T13 para orientar o início da dissecção muscular. (C) Cortes perpendiculares para identificar cada processo a ser removido via laminectomia. (D) Canais musculares cortados paralelamente aos processos espinhais para permitir o acesso às placas ósseas para remoção. (E) Clipes de serrefine de buldogue usados para reter o músculo / pele em ambos os lados da coluna para fornecer espaço cirúrgico adequado. (F) Remoção de tendões brancos interligando cada processo antes do início da laminectomia. (G) Campo cirúrgico no início da laminectomia, pois os rongeurs são deslizados por baixo da placa T12 para começar a cortar o osso. (H) A primeira metade do processo T12 removida para expor a medula espinhal e permitir espaço adequado para o cirurgião se mover rostralmente e começar a remover os processos restantes (T11 / T10). (I) Remoção da porção cranial de T12, com remoção completa do segmento. (J) Laminectomia completa em T11 usando cortes mais largos para aplicação de um exemplo de contusão SCI. (K) Laminectomia completa após a remoção dos segmentos T10-T12, expondo totalmente a superfície dorsal da medula espinhal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Etapas para realizar a durotomia e aplicar o tratamento direcionado. (A) Esquema da localização dos orifícios na dura-máter da medula espinhal. (B) Campo cirúrgico mostrando uma agulha de 27 G penetrando na dura-máter para criar a durotomia; isso é feito em ambos os lados do vaso sanguíneo central, como visto em (A). (C) Inserção inicial de um cateter usado para aplicação de tratamento. (D) Dispositivo de estimulação elétrica instalado na medula espinhal. (E) Cateteres carregados com hidrogel para injeção na superfície da medula espinhal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Condição pós-operatória e função motora. (A) Imagens representativas de animais após a implantação do dispositivo e entrega de hidrogel. (B) Pontuações BBB representativas de animais com lesão por contusão espinhal em comparação com animais submetidos a um procedimento subdural (implante ou hidrogel) ou animais de controle que não tiveram manipulação. Os tamanhos das amostras dos grupos controle (não operado), SCI e implante foram n = 5, e o tamanho da amostra do grupo Hidrogel foi n = 3. As barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Ferramentas cirúrgicas. Fotografia das ferramentas cirúrgicas utilizadas. (1) bisturi de lâmina #10. (2) Micro tesoura Vannas. (3) Pinça Graefe. (4) Grampos de buldogue Serrefine. (5) Rongeurs. (6) Agulha 27 G para durotomia. (7) Pinça fina. (8) Seringa de 1 mL para aplicação salina conforme necessário. (9) Tesoura de dissecação. (10) Hemostatos para sutura. (11) Cotonetes pontiagudos. (12) Bolas de algodão esterilizadas. (13) Toalhetes enrolados sem fiapos. Clique aqui para baixar esta figura.
Figura suplementar 2: Espaço subdural vs. peridural. Representação esquemática da coluna vertebral e da medula espinhal, demonstrando a epidural vs. espaço subdural. Clique aqui para baixar esta figura.
Discussão
A metodologia aqui apresentada fornece instruções passo a passo para o acesso ao espaço subdural espinhal e demonstra sua segurança e viabilidade por meio de dois exemplos de aplicação do tratamento na região torácica da medula espinhal 11,12. Numerosos grupos de pesquisa desenvolveram abordagens na tentativa de tratar a lesão medular (LM) por meio de intervenções elétricas ou químicas. As estratégias atuais, incluindo dispositivos implantáveis para optogenética17 ou estimulação elétrica18, bem como terapias farmacêuticas que utilizam hidrogéis19,20, demonstraram vários graus de sucesso na facilitação da recuperação e reabilitação. No entanto, o direcionamento preciso continua sendo um desafio crítico, pois a maioria dos tratamentos atuais é administrada fora do espaço subdural. A técnica descrita aqui oferece uma abordagem promissora para a realização de intervenções diretamente na medula espinhal, incluindo um meio de acesso de longo prazo ao espaço subdural (Figura 2 suplementar), apoiando a administração sustentada e direcionada de agentes terapêuticos para LME e condições neurodegenerativas. Isso tem implicações importantes para contornar a barreira sangue-medula espinhal, um grande desafio no desenvolvimento de tratamentos eficazes para distúrbios da medula espinhal.
Laminectomia
Embora os procedimentos de laminectomia em roedores sejam amplamente utilizados 17,21,22, existem vários aspectos críticos do protocolo que devem ser observados. Os pontos de referência anatômicos usados no protocolo acima (etapa 4.3; Figura 2A) permitem o acesso à região torácica inferior da medula espinhal e são específicos para o trabalho do nosso grupo. Se o procedimento for aplicado a uma região diferente da coluna vertebral, pode-se contar segmentos rostral ou caudal às vértebras iniciais para determinar a localização. Outra consideração crucial é a extensão da remoção da lâmina. Para minimizar o risco de lesões indesejadas na medula espinhal durante o procedimento, pelo menos dois níveis contíguos devem ser removidos. Isso fornece espaço suficiente para a durotomia e garante a visualização adequada. Essa precaução reduz o risco de lesão de pequenos vasos sanguíneos durante a inserção do cateter. A remoção excessiva do osso da parede lateral da coluna também deve ser evitada para evitar sangramento desnecessário ou instabilidade da coluna vertebral após a cirurgia. Ao manter um equilíbrio entre acesso adequado e interrupção mínima, o procedimento garante uma entrega de tratamento mais segura e precisa.
Durotomia e inserção de cateter
A realização da durotomia requer precisão para evitar a penetração na medula espinhal. A inserção inadequada pode resultar em hematomas ou lacerações na medula espinhal ou nos vasos sanguíneos subdurais. As aberturas criadas na dura-máter devem ser grandes o suficiente para acomodar a estratégia de tratamento desejada, neste caso, o diâmetro dos cateteres intratecais, sem comprometer a integridade da membrana. Ao realizar a durotomia, o líquido cefalorraquidiano pode vazar quando a dura-máter é perfurada; no entanto, a quantidade é mínima. Embora grandes rupturas na dura-máter possam resultar em complicações, a literatura anterior sugere que pequenas punções, como as usadas no protocolo descrito (etapa 6.4), são capazes de se autocurar por deposição /vascularização de colágeno23, resultando em nenhum efeito adverso mensurável após o procedimento. Ao colocar os cateteres, eles devem ser inseridos o mais paralelo possível à medula espinhal para minimizar o risco de lesões por força direta. O manuseio cuidadoso é necessário para evitar dobras ou crimpagens, garantindo uma inserção suave e um posicionamento adequado.
Cuidados pós-operatórios
Os cuidados pós-operatórios após o procedimento são uma consideração importante, uma vez que os roedores são normalmente alojados em grupo em condições padrão. Comportamento agressivo ou interações sociais após este procedimento podem afetar os resultados experimentais, dependendo do tipo de tratamento aplicado. Este protocolo resulta em uma linha de 6-8 cm de suturas de pele ao longo do dorso do animal. Recomenda-se manter animais de casa única por 7 a 10 dias após a cirurgia para permitir a cicatrização da ferida e evitar a possível remoção de suturas por um companheiro de gaiola. No caso de um pedido de administração de medicamentos, uma vez que a incisão cicatriza, eles podem ser realojados em grupos anteriores sem comportamento abertamente agressivo ou complicações relacionadas ao procedimento. No caso dos dispositivos implantáveis, os animais só devem ser alojados em grupos de 2. Descobrimos que alojar animais em grupos de 3 ou mais pode resultar em complicações relacionadas à agressão com os resultados do tratamento.
Aplicações de tratamento
Embora o procedimento descrito aqui se concentre na medula espinhal torácica e em duas estratégias de tratamento específicas, ele é adaptável para outras regiões da coluna vertebral e aplicações terapêuticas adicionais. Procedimentos semelhantes de laminectomia foram realizados com sucesso em vários níveis da coluna vertebral em modelos de roedores. No entanto, o pequeno espaço subdural em roedores apresenta um desafio, deixando espaço mínimo para erros durante a administração do tratamento. Embora as etapas de laminectomia e durotomia possam ser facilmente realizadas por pessoas experientes em cirurgias de roedores, a colocação precisa de um dispositivo ou medicamento sob a dura-máter sem causar lesões pode exigir tempo adicional de treinamento. Além do treinamento cirúrgico, existem vários fatores que podem auxiliar na aplicação do tratamento. Manter um campo de visão claro durante a aplicação do tratamento é crucial. Certifique-se, ao usar cateteres intratecais conforme descrito neste estudo, que não haja pontos irregulares ou ásperos nos cateteres antes de inseri-los sob a dura-máter. Como mencionado acima, a localização da durotomia é extremamente importante. Quanto mais longe o ponto de entrada do cateter estiver da lâmina rostral restante, mais fácil será para os cateteres serem alinhados e permanecerem paralelos à medula espinhal durante a inserção. O momento das estratégias de tratamento em relação a uma lesão também deve ser levado em consideração. Trabalhos futuros envolverão o estabelecimento desses procedimentos em animais em vários momentos após a lesão para permitir posteriormente a avaliação de tratamentos destinados a tratar lesões crônicas. Este protocolo representa um avanço significativo na aplicação do tratamento de doenças neurológicas da medula espinhal e fornece uma abordagem versátil e precisa para fornecer terapias diretamente ao tecido da medula espinhal.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é financiado pelo CatWalk Spinal Cord Injury Trust e uma HRC Sir Charles Hercus Research Fellowship (BH). Este trabalho também foi apoiado pelo Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde, endossado pelo Departamento de Defesa, no valor de US$ 534.258, por meio do Programa de Pesquisa de Lesões da Medula Espinhal sob o Prêmio No. HT9425-23-1-0492. Os esquemas na Figura 2A e na Figura 3A foram gerados usando Biorender.com.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringas de 1 mL e 3 mL | Amtech | ||
| Seringas de tuberculina de 1ml | BD | 302100 | |
| 2 x Pinças Graefe | FST | 11051-10 | |
| Agulhas 25G para administração de medicamentos | Nipro | SH811 | |
| Agulhas 27G para incisão dural | Nipro | SH816 | |
| 6 grampos bulldog de tecido | FST | 18051-28 | |
| 70 % de etanol | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Luvas de látex Biogel Surgeons | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaína 2 mg/kg | Aspen Nova Zelândia | 2023-02 | |
| Buprenorfina 0,05 mg/kg | Ceva (Vetergesic) | 9000320 | |
| Clorhex e tintura de ehtanol | Perrigo | K076A | |
| Esfoliação de clorhex | Schulke | LBL11258 | |
| Rongeurs curvos | FST | 16021-14 | |
| Pinças Dumont #4 | FST | 11294-00 | |
| Gelfoam, esponja de gelatina estéril e absorbente | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Seringa Hamilton | Hamilton | 80314 | |
| Bolsa térmica (37 oC) | Kent Scientific | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Impactador e software Infinite Horizon | Sistemas e instrumentação de precisão (PSI) | IH-0400 | |
| Isoflurano | Medsource | desconhecido | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Suturas não absorvíveis (Ethilon 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| O2 tanque | |||
| Microscópio cirúrgico Omax | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Prensar e selar filme plástico para drapear | Que bom | N/A | |
| Cabo de bisturi | Ferramentas Científicas Finas (FST) | 10004-13 | |
| Lâminas de bisturi tamanho 10 | Amtech Medical | SH070 | |
| Suíte de Indução Somnoflow | Kent Scientific | SF-01 | Sistema de anestesia de baixo fluxo |
| Almofadas absorventes estéreis e algodão | Swisspers | N/A | |
| Cotonetes estéreis (padrão + pontiagudo) | help@hand | N/A | |
| Soro fisiológico estéril 0,9% | Feito e autoclavado no laboratório | N/A | |
| Seções estéreis do Kim Wipe enrolado | Ciência Kimtech | 34155 | |
| Sonda de Temperatura | Kent Scientific | SF-01 | |
| Tesoura de Mola Vannas | FST | 15903-08 | |
| Lubrificante à base de água | |||
| Balanças | Qualquer | N/A |
Referências
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- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
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Reimpressões e permissões
