Determinação estrutural de hemaglutinina de resolução subnanométrica a partir de tomografia crioeletrônica de vírus influenza

A tomografia crioeletrônica (cryoET) tem sido aplicada nas últimas décadas para capturar instantâneos de complexos de proteínas, vírus, células e organismos. Uma modalidade de microscopia crioeletrônica (cryoEM), cryoET é um método de biologia estrutural em que uma amostra biológica é congelada rapidamente e, em seguida, fotografada através de uma variedade de orientações por meio de inclinação ^1,2,3. As imagens tiradas em cada orientação são então alinhadas computacionalmente ao seu eixo de inclinação comum e reconstruídas em um tomograma para fornecer uma visão tridimensional⁴.

Enquanto a cristalografia de raios-X e o cryoEM de partícula única exigem moléculas purificadas e estruturalmente homogêneas, o cryoET pode obter imagens de uma molécula diretamente em seu contexto nativo⁴. Portanto, uma das principais vantagens do TEcriocrio é sua capacidade de visualizar amostras pleomórficas, como vírus membranosos, incluindo influenza ^5,6,7. Outra promessa do cryoET é sua capacidade de obter imagens em escalas. Embora os tomogramas não sejam normalmente resolvidos após 5-10 nm⁸, a integração da média do subtomograma, onde cópias da mesma partícula são identificadas, alinhadas e calculadas a média, pode resultar em resolução quase atômica em algumas moléculas biológicas, como os ribossomos ^9,10. No entanto, apenas tipos limitados de moléculas podem atingir essa resolução; as médias dos subtomogramas normalmente não ultrapassam a resolução de 10-15 Å. Em contraste, o cryoEM de partícula única atinge rotineiramente resoluções de 3-4 Å após a revolução da resolução¹¹. Avanços recentes no maior rendimento do software de aquisição e análise de dados crioET permitiram a determinação da estrutura de resolução subnanométrica de moléculas biológicas adicionais dentro de seu contexto nativo 12,13,14,15,16,17,18.

Um uso comum para cryoET é visualizar a morfologia, organização e estrutura do vírus. Apesar da resolução mais baixa proporcionada por esta técnica em comparação com o cryoEM de partícula única ou cristalografia de raios-X, o cryoET combinado com a média do subtomograma pode fornecer informações sobre como as proteínas virais se comportam em seu ambiente nativo e fornecer detalhes cruciais sobre sua organização no contexto do vírion. Um alvo comum para a crioET de vírus são as glicoproteínas de superfície que são comumente usadas para fixação e fusão de células hospedeiras, pois geralmente são os principais antígenos e alvos para terapias ou vacinas. Com os recentes avanços nos pacotes de processamento de crioET, tornou-se cada vez mais viável atingir médias de resolução subnanométrica dessas glicoproteínas 19,20,21,22. Um exemplo é a hemaglutinina (HA), a principal proteína na superfície dos vírions da gripe. Essa proteína não apenas conduz a ligação ao receptor e a fusão da membrana, mas também cobre o vírion de maneira incrivelmente densa, com centenas a milhares de HAs em um único vírion⁵. O protocolo apresentado aqui (Figura 1) integra vários pacotes comumente usados com scripts internos para delinear os estágios do pré-processamento ao refinamento do modelo para uma média de subtomograma de influenza HA.

NOTA: Os conjuntos de dados de amostra usados para este protocolo podem ser acessados em EMPIAR-12864, que inclui os dois conjuntos de séries de inclinação usados para este protocolo. As séries de inclinação são coletadas de grades mergulhadas manualmente do vírus influenza A purificado em um tamanho físico de pixel de 2,09 Å / pixel para garantir um campo de visão grande o suficiente para que cada série de inclinação contenha vários vírions e também para renderizar as reconstruções de maior resolução possível. Para os próprios conjuntos de dados dos usuários, é recomendável iniciar o fluxo de trabalho com filmes de inclinação brutos. Esses conjuntos de dados foram processados e visualizados usando estações de trabalho de alto desempenho. A Tabela de Materiais lista o hardware e o software usados para este protocolo. Todos os pacotes de software usados neste protocolo são de código aberto e estão disponíveis para download; os links e instruções de instalação estão listados na Tabela de Materiais. A estação de trabalho recomendada para o processamento de conjuntos de dados crioET deve estar equipada com pelo menos um processador de 8 núcleos, uma placa GPU dedicada com 6 GB de VRAM, 64 GB de RAM e 2 TB de armazenamento local.

1. Pré-processamento de dados de filmes tilt e reconstrução de tomogramas crioeletrônicos em Warp ²³ e IMOD ²⁴

1. Em um terminal, ative um ambiente conda que tenha o Warp instalado usando o seguinte comando:
   conda activate warp_environment
2. Crie um arquivo de configurações de série de quadros para processar séries de quadros. Este é um arquivo de configuração que contém metadados sobre o microscópio, o local dos dados a serem processados e onde armazenar os arquivos de saída.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   NOTA: Esses dados foram coletados no modo de super-resolução.
3. Conduza a estimativa da função de transferência de contraste (CTF) e a correção de movimento.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   NOTA: m_grid parâmetro deve corresponder ao número de subquadros em um filme de inclinação - nossos conjuntos de dados consistiam em 5 subquadros por filme de inclinação.
4. Importe metadados da série de inclinação para que o WarpTools possa identificar quais filmes pertencem a quais séries de inclinação.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Depois que a pasta tomostar for preenchida, crie um arquivo de configurações da série tilt para o processamento da série tilt
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Escreva pilhas de tilt e conduza o alinhamento automatizado da série tilt baseado em fiducial usando o programa batchruntomo do IMOD usando o Etomo GUI²⁴.
   1. Execute o seguinte comando no terminal:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      NOTA: As séries tilt foram exportadas com 4x o tamanho físico do pixel para diminuir o tempo de alinhamento e os recursos computacionais.
   2. Escolha um conjunto de dados de amostra para primeiro definir os parâmetros de alinhamento antes de aplicá-los como um modelo para batchruntomo.
   3. Importe os parâmetros de alinhamento do IMOD se estiver usando batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      NOTA: Para este conjunto de dados, o uso da GUI do Etomo produziu melhores resultados do que os wrappers no WarpTools.
   4. Como alternativa, conduza o alinhamento automatizado de tiltseries sem fiducição usando o wrapper AreTomo²⁵ dentro do WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      NOTA: O invólucro AreTomo foi testado com AreTomo1.3.4.
7. Execute o seguinte comando no terminal para estimar os parâmetros CTF para séries de inclinação:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Reconstrua tomogramas usando WarpTools.
   1. Definir variável de ambiente:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      NOTA: Esta etapa garante que os tomogramas sejam compatíveis com os estágios subsequentes de processamento e visualização de imagens em outros softwares usados neste protocolo.
   2. Para reconstruir tomogramas, execute em um terminal: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Repita as etapas 1.2 a 1.8.2 para todos os conjuntos de dados.

2. Pré-processamento de tomograma e coleta de partículas

1. Em um terminal, ative um ambiente conda com o IsoNet²⁶ instalado.
   conda activate isonet_env
2. Prepare-se para o processamento de tomogramas criando primeiro uma subpasta e movendo todos os tomogramas para essa pasta.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Gere um arquivo em estrela na pasta do projeto.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. Usando um editor de texto, abra o arquivo de estrela gerado e insira o valor aproximado de desfocagem para as imagens de inclinação de 0 grau na quarta coluna (_rlnDefocus) de cada tomograma, que pode ser localizado no arquivo processed_items.json na pasta warp_tiltseries.
   NOTA: O valor de desfocagem deve estar em angstroms para IsoNet. A distorção grava valores de desfocagem em μm, o que requer um fator de multiplicação de 10.000.
5. Execute o comando CTF deconvolve no terminal.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Após a desconvolução, inicie a GUI²⁷ do EMAN2 para iniciar o pré-processamento de tomogramas para coleta de partículas.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. Em Tomografia, clique com o botão esquerdo do mouse na seta ao lado de Dados brutos e selecione Importar tomografias no menu suspenso.
8. Clique com o botão esquerdo do mouse na seta adjacente a Segmentação e selecione Pré-processar tomogramas.
   NOTA: Os parâmetros padrão provavelmente são adequados para muitos conjuntos de dados. Para esses tomogramas, um filtro passa-baixa a 4 Å foi aplicado e as imagens de inclinação foram normalizadas. Após o pré-processamento, um diretório info será gerado automaticamente pelo EMAN2 com arquivos .json em branco (com nomes base semelhantes aos arquivos pré-processados). O angpix precisa ser adicionado aos arquivos json antes da coleta de partículas.
9. Treine a rede neural convolucional (CNN) para reconhecer a glicoproteína HA.
   1. Altere o diretório de trabalho para o local dos tomogramas a serem usados para treinamento de CNN e coleta de partículas:
      cd path/to/tomograms
   2. Use o terminal para abrir a janela de treinamento da CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Confirme se quatro janelas estão abertas: uma contendo as informações sobre os parâmetros e tomogramas da CNN no diretório e as outras três janelas contendo imagens de referências boas (positivas), referências ruins (negativas) e partículas selecionadas pela CNN (partículas).
   4. Clique com o botão esquerdo do mouse no botão Novo na GUI da CNN para inicializar uma nova CNN. Defina a taxa de aprendizado padrão como 0,0001 e o tamanho da caixa como 8.
   5. Na coluna Nome do arquivo , clique com o botão esquerdo do mouse em um tomograma representativo para abri-lo em uma nova janela.
      NOTA: Apenas um tomograma pode ser aberto por vez.
      1. Para percorrer o eixo z de um tomograma, coloque o cursor sobre o tomograma aberto e pressione a roda de rolagem do mouse do computador para abrir uma nova janela. O controle deslizante rotulado como N# mudará o eixo z.
   6. No tomograma aberto, selecione de 10 a 20 recursos correspondentes ao HA usando o botão esquerdo do mouse no painel Positivo.
      NOTA: Selecione as vistas superior e lateral do HA, que aparecem como cilindros ou triângulos acima da membrana, como boas referências para uma rede mais robusta.
      1. Imagens de referências positivas aparecerão na janela Positivo . Para remover uma referência, mantenha pressionada a tecla Shift e clique com o botão esquerdo do mouse em uma imagem de referência.
   7. Alterne para o painel Negativo e selecione de 10 a 20 referências correspondentes a recursos como manchas de membrana vazias, densidade de vRNP, marcadores fiduciais e detritos.
      NOTA: As referências aparecerão na janela Negativo .
   8. Inicie o treinamento da CNN clicando com o botão esquerdo do mouse no botão Treinar na janela principal.
      NOTA: O número de iterações (Niter) na janela principal altera quantas iterações de treinamento a CNN sofre. Recomende definir o parâmetro como 50.
   9. Depois que a CNN tiver sido treinada nas referências selecionadas, clique com o botão esquerdo do mouse em Aplicar para usar a CNN para selecionar partículas no tomograma aberto.
      NOTA: Imagens de partículas selecionadas podem ser vistas na janela Partículas. As partículas selecionadas também serão exibidas no tomograma em círculos azuis.
   10. Continue selecionando referências positivas e negativas com base na rede aplicada, salvando periodicamente o progresso por meio do botão Salvar .
   11. Quando estiver satisfatório, selecione Aplicar tudo para que a CNN selecione partículas em todos os tomogramas no diretório e avalie os resultados em vários tomogramas; Realize treinamento adicional conforme necessário.
10. Salve as coordenadas em um arquivo de texto para cada tomograma.
    1. Abra a GUI do EMAN2 usando o e2projectmanager.py comando.
    2. Clique na seta ao lado de Média do Subtomograma e clique em Boxe Manual.
    3. Insira o nome de um tomograma e clique em Iniciar.
    4. Salve as coordenadas no arquivo de texto selecionando Arquivo > Salvar Coord da Caixa > tomogram_ha.txt.
    5. Navegue até a subpasta neuralnets e a subpasta info para fazer backup de nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf e boxes3dref.hdf.
11. Para garantir que a análise seja realizada apenas em vírions totalmente montados, onde a presença da camada de proteína da matriz (M1) e do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP) é aparente, treine uma segunda rede neural convolucional para reconhecer a proteína M1.
    1. Siga o mesmo protocolo descrito na etapa 2.9, alterando o tamanho da caixa de treinamento de 8 para 14.

3. Curadoria de partículas

1. Baixe notebooks do https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
2. Abra o notebook CNN_Particle_Cleaning.ipynb e carregue os módulos necessários.
   NOTA: O script usa o Open3D²⁸ como um pacote para visualizar coordenadas de partículas como nuvens de pontos 3D.
3. Carregue arquivos de texto correspondentes às coordenadas HA e M1 e visualize como nuvens de pontos 3D usando o pacote Open3D.
4. Filtre os outliers de coordenadas HA usando a remoção de outliers estatísticos, conforme implementado no Open3D.
   NOTA: Os valores iniciais sugeridos para HA são nb_neighbors = 50 (número de coordenadas vizinhas em torno de uma coordenada) e std_ratio = 0,5.
5. Calcule a distância entre as nuvens de pontos HA e M1. Todas as coordenadas HA a mais de 20 pixels de distância da nuvem de pontos M1 serão identificadas como um outlier. Todas as coordenadas de partículas não identificadas como um outlier serão salvas em um arquivo .txt saída.
   NOTA: 20 pixels correspondem a uma distância aproximada de 16 nm com um tamanho de pixel de 8.35 Å/pixel. O centro de um trímero de HA para a camada M1 é de aproximadamente 15 nm em nossos tomogramas.
6. Concatene todas as partículas e salve como starfiles usando pts2starfile.ipynb.

4. Média e classificação iterativa do subtomograma

1. Usando o WarpTools, extraia partículas com um fator de binning de 4 e conduza rodadas iniciais de média de subtomograma em RELION4²⁹.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   NOTA: O tamanho sugerido da caixa de 48 x 48 x 48 pixels, correspondendo a uma caixa de ~360 ųque seria grande o suficiente para conter uma matriz de 7-8 HA.
   1. Converta o arquivo de distorção em arquivo compatível com RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Gere uma referência inicial usando relion_refine_mpi em um subconjunto de partículas.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Use relion_refine_mpi para realizar o autorefinamento 3D nos subtomogramas.
      1. Comando de exemplo: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         NOTA: A amostragem global e local inicial foi definida como 7,5 e 1,8 graus, correspondendo a uma ordem healpix de 4 e healpix local de 2. Os refinamentos iniciais aproveitam principalmente a forte densidade da membrana, da proteína M1 e da matriz de HA. O intervalo de deslocamento de translação pode ser maior para abranger quaisquer mudanças que possam ocorrer ao alinhar a matriz.
   4. Repita o refinamento após a primeira execução de refinamento convergir, alterando a conversão para 8 e a etapa para 2.
2. Aproveite a classificação 2D para descartar partículas inúteis usando relion_refine.
   1. Exemplo de comando: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      NOTA: A classificação 2D foi usada em vez da classificação 3D, pois é mais eficiente computacionalmente. Os subtomogramas podem ser usados diretamente como entrada para o trabalho de classificação 2D sem processamento de imagem adicional.
   2. Combine classes contendo uma matriz de HA identificável contendo HA cilíndrica, membrana e densidade M1 usando relion_star_handler.
   3. Primeiro, crie arquivos em estrela contendo boas classes.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Em seguida, use o seguinte comando relion_star_handler para combinar os arquivos de estrela individuais.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Extraia novamente em bin2 e partículas não compartimentadas para refinamento local iterativo.
   1. Para refinamento de bin2, extraia partículas usando um tamanho de caixa menor de 80 e conduza a pesquisa local com healpix e healpix local definidos como 4 (amostragem angular local de 1,8 graus).
   2. Nesta fase, combine conjuntos de partículas de diferentes conjuntos de dados usando relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. Após a primeira rodada de refinamento, crie uma máscara cilíndrica usando e2filtertool.py dentro do ambiente EMAN2 que englobe o HA central mais a membrana e a densidade M1.
      NOTA: Parâmetros usados para a máscara cilíndrica: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; todos os outros parâmetros estão desmarcados.
   4. Realize uma rodada adicional de refinamento com a máscara aplicada.
   5. Realize outra rodada de classificação 2D para eliminar valores discrepantes que não se alinham com o HA central e detritos adicionais.
   6. Repita o processo com partículas não compartimentadas com um tamanho de caixa de 120 e crie uma máscara macia que cubra o HA central, alinhe a referência à simetria C3 e aplique simetria neste estágio de refinamento.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      NOTA: A resolução final alcançada usando RELION foi de 6.1 Å.
4. Refinamento final no MTools⁹
   1. Crie uma população de refinamento (após a ativação do ambiente Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Adicione fontes de dados para cada conjunto de dados.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Repita a etapa anterior com conjuntos de dados adicionais.
   3. Crie as espécies de refinamento.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Refinamento de várias partículas.
      1. Primeiro, refine as poses de partículas com o comando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Em seguida, refine as poses de partículas e a aberração esférica com o comando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         NOTA: O refinamento foi interrompido aqui, pois outras iterações não melhoraram a resolução. Diferentes combinações de parâmetros que não foram exaustivamente testadas, no entanto, podem continuar a impulsionar os resultados.

5. Refinamento do modelo

1. Usando o ChimeraX³⁰, carregue o mapa final e um modelo atômico de HA.
2. Mapeie e combine todos os segmentos que correspondem ao ectodomínio de HA e use a ferramenta Ajustar a segmentos para encaixar no modelo de HA.
   1. Salve as coordenadas transformadas do modelo.
3. Abra a GUI do Phenix³¹ e use a ferramenta Real Space Refinement .
   1. Quando solicitado a adicionar arquivos, adicione o modelo HA transformado e o mapa e preencha a resolução da reconstrução final.
   2. Realize cinco rodadas de minimização global, ajuste do rotâmero local, refinamento da ocupação e refinamento do ADP do grupo.
4. Visualize a reconstrução final e modele usando o ChimeraX.

Para demonstrar a utilização deste protocolo de processamento (Figura 1), o fluxo de trabalho descrito anteriormente foi aplicado a dois conjuntos de dados de 25 tomogramas combinados, obtidos de uma cepa do vírus influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934). Os parâmetros de coleta de dados estão descritos na Tabela 1. A Figura 2 ilustra um tomograma representativo e vistas ampliadas de vírions pleomórficos da gripe. Morfologias variadas são capturadas neste tomograma, pois os vírions variam de esférico a oval / alongado. Embora a maioria das partículas de influenza contenha conjuntos M1 e vRNP bem organizados, alguns vírions parecem ser mais desorganizados e carecem de componentes estruturais cruciais.

A partir desse conjunto de dados, um conjunto inicial de 40.995 subtomogramas foi usado para reconstrução de bin4 (8,35 Å/pix) após coleta e curadoria de partículas. Os dois conjuntos de dados foram inicialmente processados independentemente em RELION4 com simetria C1 e uma máscara esférica ampla que abrangia a matriz geral de HA. Foram realizados três ciclos de refinamento para esses subtomogramas, seguidos de classificação 2D. Após a classificação, subtomogramas mal resolvidos e partículas de lixo foram descartados; os subtomogramas restantes foram extraídos em bin2 (4,17 Å/pix) e os dois conjuntos de dados foram combinados. Os subtomogramas Bin2 foram primeiro alinhados em uma rodada de média de subtomograma, depois uma máscara cilíndrica ao redor do AH central foi aplicada para o alinhamento do foco. Nesta fase, a simetria trimérica pode ser claramente visualizada para a reconstrução do AH. Rodadas adicionais de refinamento foram realizadas no bin2 e a 2,8 Å/pix. Uma última rodada de classificação 2D foi realizada com uma pequena máscara cobrindo apenas o trímero central de AH com subtomogramas alinhados. A classe principal, consistindo em ~ 94% dos subtomogramas restantes, foi extraída para partículas não compartimentadas e submetida a refinamento 3D com simetria C3 aplicada. Por fim, esses subtomogramas foram exportados para M, onde foram realizadas poses de partículas e ciclos de refinamento de aberração esférica (Figura Suplementar 1).

A média final do subtomograma (Figura 3A), composta por 15.970 partículas de HA, atingiu uma resolução global de 6,0 Å e uma faixa de resolução local de 5-7 Å (Figura 4). Um modelo de PR8 HA foi refinado de forma flexível na densidade; no FSC=0,5 e FSC=0,143, a resolução do mapa para o modelo foi de 8,1 Å e 6,6 Å, respectivamente. A arquitetura da reconstrução HA se assemelhava muito aos mapas cryoEM e cryoET anteriores. Nesta resolução, as folhas alfa-hélices e beta podem ser distinguidas (Figura 3B); além disso, os glicanos podem começar a ser identificados em quatro locais de glicosilação na cabeça e no caule do AH ( Figura 3C ).

Nossos resultados mostram a adequação do TEcrioC na reconstrução de AH de vírions nativos da influenza. Através do protocolo, a densidade clara para a glicoproteína cilíndrica foi observada perpendicularmente à membrana viral, e a resolução melhorou a cada passo. Para os próprios dados, sugere-se que a média do subtomograma comece a partir de uma pilha de partículas agrupadas e os resultados sejam monitorados de perto em cada ciclo de refinamento. Se a densidade da glicoproteína não for aparente desde os estágios iniciais, recomenda-se mapear os locais do subtomograma de volta no tomograma para verificar o posicionamento preciso. Caso contrário, pode-se ajustar os parâmetros de alinhamento ou implementar estágios de classificação adicionais para obter os melhores resultados.

Figura 1: Pipeline geral para média de subtomograma de HA de crioET do vírus influenza. O painel superior representa um fluxo de trabalho resumido para os dois conjuntos de dados usados para demonstrar o protocolo. O segundo painel corresponde à Seção 1 do protocolo, o terceiro painel corresponde às Seções 2-3 e o quarto painel corresponde às Seções 4-5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Tomografia representativa do vírus influenza PR8. (A) Corte a tomografia reconstruída. A barra de escala é de 100 nm. (BD) Ampliado em vista de (B) esférico, (C) cilíndrico, (D) vírion PR8 sem M1. Todas as barras de escala em B-D correspondem a 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Média do subtomograma de PR8 HA. (A) Vista superior e lateral da reconstrução de AH em dois níveis de contorno equipados de forma flexível com uma estrutura crioEM de partícula única PR8 HA. (B) Visualizações recortadas através da reconstrução HA. As setas coloridas correspondem às caixas coloridas. (C) Reconstrução de AH mostrada no contorno inferior para revelar a densidade de glicanos. Vistas de perto de glicanos na representação de bastões no mapa cryoET também são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Estimativa da resolução da média do subtomograma de AH. (A) Estimativa da resolução local da média do subtomograma de AH mapeada na reconstrução. A barra de cores representa 5-7 Å na paleta azul-branco-vermelho. (B) Curvas FSC de meios mapas e de resolução map-to-model. A curva azul é da reconstrução desmascarada e a vermelha é da mascarada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Parâmetros de coleta de dados para conjuntos de dados crioET do vírus influenza PR8.

Figura suplementar 1: Fluxo de trabalho de média do subtomograma para HA. Alinhamento, média e classificação iterativos são conduzidos para subtomogramas de HA por meio de desbinning gradual. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a divulgar.