Este artigo descreve como a pomada para queimaduras exposta à umidade promove o reparo da ferida diabética, regulando dinamicamente a neovascularização da ferida diabética e a expressão do mir-31-5p exossômico plasmático.
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Artigo de investigação
Efeitos da pomada para queimaduras expostas úmidas na neovascularização da ferida e no plasma exossômico mir-31-5p em camundongos diabéticos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pomada para queimaduras exposta à umidade (MEBO) é um medicamento tradicional chinês usado para tratar feridas diabéticas crônicas; no entanto, o mecanismo subjacente não é claro. Evidências recentes sugerem o papel dos exossomos e miRNAs funcionais na neovascularização da ferida. Aqui, nosso objetivo foi investigar os efeitos do MEBO na neovascularização da ferida e na expressão exossômica plasmática de mir-31-5p (pExo-mir-31-5p) em camundongos diabéticos. Um total de 120 camundongos C57BL/6 foram divididos aleatoriamente em um grupo controle não diabético (n = 24) e um grupo diabético induzido por estreptozotocina (n = 96), que foi posteriormente randomizado em grupos controle diabético, MEBO, beifuxin e MHY1485 (n = 24 cada). Cinco grupos foram estabelecidos com modelos de ressecção de pele de espessura total, que foram tratados com solução salina fisiológica, solução salina fisiológica, MEBO, beifuxin e MHY1485, respectivamente. Nos dias 1, 7, 13 e 18, a taxa de fechamento da ferida, a densidade de microvasos e os níveis de expressão de pExo-mir-31-5p, juntamente com os níveis de mRNA e proteína de VPS4a e Rab27a nos tecidos da ferida, foram analisados usando ImageJ, coloração de hematoxilina-eosina (HE), reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e western blot (WB), respectivamente. Além disso, foram analisadas correlações entre a expressão de VPS4a, proteína Rab27a, pExo-mir-31-5p e densidade de microvasos. Descobrimos que o MEBO promoveu o reparo de feridas em camundongos diabéticos (p < 0,050). Melhorou a neovascularização da ferida durante os estágios inicial e intermediário da cicatrização, mas a inibiu durante o estágio posterior (p < 0,050). O MEBO regulou positivamente o mRNA e a expressão de proteínas de Vps4a e Rab27a nos tecidos da ferida, bem como o pExo-mir-31-5p durante os estágios inicial e intermediário de cicatrização, enquanto os regulou negativamente no estágio posterior (p < 0,050). Além disso, VPS4a, proteína Rab27a, expressão de pExo-mir-31-5p e densidade de microvasos foram positivamente correlacionadas em camundongos tratados com MEBO (p < 0,050). Em conclusão, o MEBO regula dinamicamente a neovascularização da ferida e a expressão de pExo-mir-31-5p em camundongos diabéticos, fornecendo novos subsídios teóricos para sua aplicação clínica.
Introdução
A prevalência de diabetes mellitus em pacientes idosos é alta e aumenta anualmente. A doença está associada a feridas diabéticas crônicas (CDWs), que têm um efeito prejudicial na saúde, função e qualidade de vida geral do paciente1. Normalmente, o fechamento da ferida envolve quatro fases distintas: hemostasia, inflamação, proliferação e reepitelização2. Destes, a fase proliferativa é a mais importante. Durante a fase proliferativa inicial, as células endoteliais capilares proliferam e migram para a ferida, brotando novos vasos e formando uma intrincada rede3. No entanto, nos estágios posteriores do reparo da ferida, a maior parte dos lúmens capilares sofre oclusão, com uma minoria fazendo a transição para pequenas artérias e veias. Em pacientes com RCD, perda tecidual, necrose e gangrena, e diferentes níveis de inflamação e hiperglicemia, perturbam o equilíbrio dinâmico entre angiogênese e antiangiogênese, retardando a cicatrização da ferida, principalmente quando a angiogênese está prejudicada 4,5,6. A pomada para queimaduras expostas à umidade (MEBO) é um medicamento tradicional chinês usado para tratar CDWs, mas seu mecanismo permanece obscuro. Recentemente, vários estudos demonstraram que os miRNAs carregados de exossomos podem promover a angiogênese e, assim, promover a cicatrização de feridas diabéticas 7,8. No entanto, poucos estudos investigaram a associação entre MEBO e miRNAs transportados por exossomos. Portanto, há uma necessidade de revelar o mecanismo pelo qual o MEBO estimula a angiogênese em CDWs do ponto de vista do exossomo e do miRNA funcional.
Os exossomos são vesículas membranosas esféricas liberadas por células vivas, medindo 30-200 nm de tamanho, 1,1-1,2 g/mL de densidade e contendo proteínas marcadoras como CD81 e suscetibilidade tumoral 101 (TSG101)9. A produção e secreção de exossomos são categorizadas em complexo de classificação endossômico necessário para vias dependentes de transporte (ESCRT) e não dependentes de ESCRT. Os reguladores mais críticos dentro dessas vias são a classificação de proteínas vacuolares 4 homólogas a (VPS4a) e a proteína relacionada a Ras Rab-27a (Rab27a) 10 , 11 , 12 . Vps4a atua como uma ATPase, catalisando o processo de remodelação da membrana dependente de ESCRT, que regula o tamanho do exossomo e a taxa de formação do exossomo13,14. Rab27a é uma pequena GTPase essencial que regula o acoplamento de corpos multivesiculares à membrana plasmática15. A secreção de exossomos é regulada negativamente pelo alvo de mamíferos do complexo de rapamicina 1 (mTORC1)16, que é ativado por MHY1485 ligação competitiva ao domínio estrutural ATP da rapamicina17. No geral, MHY1485 pode inibir indiretamente a síntese e secreção de exossomos. Os exossomos podem ser detectados em quase todos os fluidos corporais. Os exossomos plasmáticos são mais produtivos do que os exossomos derivados de outros fluidos corporais18. Além disso, os exossomos protegem os ácidos nucléicos que carregam da degradação19.
Os miRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificantes que regulam a atividade celular20. Os exossomos foram descobertos abundantemente em vários miRNAs cruciais para aumentar a angiogênese da ferida, especificamente mir-126, mir-125a e mir-31-5p. Um estudo anterior demonstrou que exossomos derivados de células-tronco mesenquimais da medula óssea superexpressando mir-126 promoveram a proliferação, migração e formação de tubos de células endoteliais da veia umbilical humana in vitro por meio da transferência de mir-12621. Outro estudo indicou que exossomos secretados por células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano transferiram mir-125a para células endoteliais e promoveram a angiogênese reprimindo o inibidor angiogênico delta-like 4 em feridas9. Yan et al. relataram que o mir-31-5p carregado em exossomos de leite melhorou as funções das células endoteliais in vitro, promoveu a angiogênese e melhorou a cicatrização de feridas diabéticas in vivo22. Entre esses miRNAs, o mir-31-5p foi o único miRNA que foi significativamente regulado negativamente em feridas de camundongos diabéticos em comparação com feridas normais de camundongos22.
MEBO é uma pomada oleosa que pode ser usada para tratar feridas refratárias, como CDWs 23,24. No entanto, o mecanismo do MEBO que promove a cicatrização de feridas não foi elucidado. Estudos anteriores mostraram que o MEBO promove a neovascularização da ferida por meio da regulação positiva da expressão do fator de crescimento endotelial vascular em ratos diabéticos25. No entanto, apenas alguns estudos abordaram essa questão sob a perspectiva de miRNAs transportados por exossomos. Neste estudo, para investigar os efeitos do MEBO em CDWs, induzimos um modelo de ferida de espessura total em camundongos diabéticos usando estreptozotocina (STZ) e uma dieta rica em gordura. Mostramos que o MEBO acelerou significativamente a cicatrização de feridas em camundongos diabéticos. Além disso, estudamos os efeitos do MEBO na densidade de microvasos, níveis de expressão de pExo-mir-31-5p, juntamente com mRNA e proteína de VPS4a e Rab27a em tecidos de feridas. Portanto, levantamos a hipótese de que o MEBO promoveu a cicatrização de feridas regulando o pExo-mir-31-5p para regular a angiogênese de feridas em camundongos diabéticos. Uma visão geral esquemática do desenho do estudo é apresentada na Figura 1.
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Youjiang para Nacionalidades, Baise, China (2018051501). Camundongos C57BL/6 machos livres de patógenos específicos (FPS) (7 semanas de idade) foram alojados no Centro de Animais de Laboratório SPF da Faculdade de Medicina de Youjiang para Nacionalidades e alimentados com uma dieta comum ou rica em gordura e água limpa. Durante todo o estudo, a temperatura da sala de alimentação dos animais foi mantida entre 23 °C e 25 °C, a umidade foi de 40% a 60% e o ciclo claro/escuro foi de 12 h. Os cuidados com os animais foram fornecidos de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA e do Instituto Nacional de Saúde da China (Pequim, China). Todas as intervenções cirúrgicas foram realizadas sob anestesia com pentobarbital sódico (0,3%, 50 mg/kg) utilizando protocolo padronizado estabelecido em nosso laboratório. Todos os esforços foram feitos para reduzir o número de animais utilizados e minimizar o desconforto dos animais. Todas as seções deste relatório seguem as Diretrizes ARRIVE para relatar pesquisas com animais.
Modelo e tratamento de feridas em camundongos
Um total de 120 camundongos foram aleatoriamente designados para um grupo controle não diabético (NDB-CTR; n = 24) ou diabético (n = 96). Para simular o diabetes tipo 2 humano, os camundongos do grupo diabético foram alimentados com uma dieta rica em gordura e açúcar refinado por 4 semanas e, em seguida, injetados por via intraperitoneal (ip) com STZ (100 mg / kg), uma vez por dia, por 2 dias consecutivos após jejum de 16 h. Os níveis de glicemia de jejum foram medidos no 5º e 6º dia após a injeção de STZ. Camundongos com valores de glicemia de jejum superiores a 16,7 mmol/L em duas ocasiões e com sintomas como polifagia, polidipsia, poliúria e perda de peso foram considerados modelos de diabetes bem-sucedidos26. Após 1 semana, os pelos dorsais foram raspados e uma ferida cutânea redonda de espessura total (diâmetro = 15 mm) foi gerada nas costas de cada camundongo após a administração intraperitoneal de pentobarbital sódico (0,3%, 50 mg / kg). Os camundongos do grupo diabético foram aleatoriamente designados para os grupos MEBO, BFX (beifuxin), DB-CTR (controle diabético) ou MHY1485 (MHY). Os camundongos dos grupos MEBO e BFX foram tratados com MEBO (0,2 g/cm2) e gel BFX (0,2 g/cm2) aplicados na ferida uma vez ao dia, respectivamente. O gel BFX, cujo nome genérico é gel básico de fator de crescimento de fibroblastos bovinos, é um medicamento tópico utilizado no tratamento de feridas crônicas27. Os camundongos dos grupos NDB-CTR, DB-CTR e MHY foram tratados com solução salina fisiológica. O grupo MHY também foi tratado com MHY1485 (10 mg/kg, ip) por 2 dias consecutivos. Os camundongos diabéticos foram injetados por via subcutânea com insulina na dosagem de 2-4 UI / kg uma vez por dia para controlar o nível de glicose no sangue.
Colheita de amostras
Nos dias 1, 7, 13 e 18, seis camundongos de cada grupo foram selecionados aleatoriamente para eutanásia por luxação cervical, e amostras de tecidos epidérmicos em forma de anel, incluindo a ferida, foram coletadas a 0,5 cm da borda da ferida com tesoura de tecido estéril. Em seguida, os tecidos da ferida foram coletados para coloração HE, análise de qPCR e ensaios WB. Amostras de sangue foram colhidas de camundongos dos grupos DB-CTR e MEBO usando o método retro-orbital sob anestesia com pentobarbital sódico. As amostras de sangue foram misturadas com heparina em tubos anticoagulantes e centrifugadas a 3.000 x g por 15 min para recuperação do sobrenadante plasmático. Todas as amostras foram armazenadas a -80 °C. Para calcular a taxa de fechamento da ferida, uma câmera digital foi usada para capturar imagens da cicatrização da ferida em um ponto de tempo fixo e a uma distância igual com uma escala graduada na lateral. A área da ferida foi medida usando o software ImageJ. A taxa de fechamento da ferida foi calculada da seguinte forma:
taxa de fechamento da ferida (%) = [W1-Wn] / W1 x 100%
onde W1 e Wn referem-se às áreas da ferida nos dias 1 e n, respectivamente.
Ensaio histopatológico
A coloração HE foi realizada para observar dinamicamente a cicatrização patológica da ferida. Após a fixação com solução de paraformaldeído a 4% por 16 h, os tecidos da ferida foram desidratados, incluídos em parafina e, em seguida, cortados em cortes de 3 μm. A coloração HE foi realizada em lâminas de tecido. Para explorar a densidade de microvasos dos tecidos da ferida, lâminas de tecido foram fotografadas usando um microscópio óptico. Para quantificar a densidade de microvasos de cada amostra, selecionamos a área com maior densidade capilar em um microscópio de 10x, depois selecionamos e fotografamos três áreas não sobrepostas em um microscópio de 20x. As densidades dos microvasos foram calculadas e calculadas usando o ImageJ.
Isolamento e caracterização de exossomos plasmáticos
A ultracentrifugação foi realizada para isolar os exossomos plasmáticos de acordo com um protocolo publicado com pequenas modificações28. Resumidamente, 2 mL de plasma foram centrifugados a 2.000 x g a 4 °C por 30 min. O sobrenadante foi centrifugado novamente a 10.000 x g a 4 ° C por 45 min para remover as vesículas maiores. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana filtrante de 0,45 μm e o filtrado foi coletado. O filtrado foi então centrifugado a 100.000 x g a 4 °C por 70 min. Após a remoção do sobrenadante, o pellet foi ressuspenso com 10 mL de PBS 1x pré-resfriado e centrifugado a 4 °C, 100.000 x g, por 70 min. O sobrenadante foi removido e o pellet foi ressuspenso com 150 μL de PBS 1x pré-resfriado e armazenado a -80 °C. Para confirmar os exossomos plasmáticos coletados acima, usamos microscopia eletrônica de transmissão (MET) para determinar a morfologia dos exossomos, um sistema de citometria de nanofluxo para analisar o tamanho e a concentração dos exossomos e WB para detectar os níveis de expressão dos marcadores de exossomos CD81 e TSG101.
Extração de RNA, transcrição reversa (RT) e qPCR
qPCR foi realizada para quantificar os níveis de expressão de mRNA de Vps4a, Rab27a e pExo-mir-31-5p. Os tecidos da ferida foram coletados para extração de RNA total usando reagente de extração de RNA. Uma concentração total de RNA entre 400-700 ng/μL foi considerada aceitável. As amostras de RNA foram transcritas reversamente em cDNA usando transcriptase reversa com dsDNase de acordo com as instruções do fabricante. A qPCR foi realizada usando o SYBR Green qPCR Mix (No ROX). Quanto ao mir-31-5p, o RNA dos exossomos plasmáticos foi extraído usando o mini kit, transcrito reversamente usando o Kit de Síntese de cDNA First Strand e amplificado usando SYBR Green qPCR Master Mix. As expressões de mRNAs e miRNAs foram analisadas usando o método 2-ΔΔCt em relação à β-actina e cel-mir-39, respectivamente. Os primers utilizados são apresentados na Tabela 1.
Western blot
O ensaio WB foi utilizado para detectar os níveis de expressão das proteínas Vps4a e Rab27a, bem como os níveis dos marcadores exossômicos CD81 e TSG101. Os níveis de proteína total dos tecidos da ferida e exossomos plasmáticos foram extraídos por tampão de lise RIPA, e a concentração de proteína foi determinada pelo Kit de Ensaio de Proteína do Ácido Bicinchonínico. Um total de 50 μg de proteína foi separado por dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida. Após o blotting nas membranas de fluoreto de polivinilideno, as membranas foram bloqueadas com albumina de soro bovino e, em seguida, incubadas a 4 ° C durante a noite com anticorpos contra Vps4a (1: 3000), Rab27a (1: 1000), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (1: 5000), CD81 (1: 3000), TSG101 (1: 3000) e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários, anti-IgG peroxidase de coelho conjugada (1: 3000), a 37 ° C por 1 h. As membranas foram visualizadas usando um kit de quimioluminescência aprimorado.
Análise estatística
Todos os dados apresentados neste estudo foram analisados quanto à significância estatística usando o software SPSS. Todos os resultados obtidos nessas análises foram visualizados usando o software GraphPad Prism. As diferenças entre os dois grupos foram examinadas usando um teste t de amostra independente. Para comparações de múltiplos grupos, a análise de variância unidirecional foi usada para dados de variância homogênea, enquanto o teste de Welch foi aplicado a dados de variância heterogênea. Além disso, usamos o teste de diferença menos significativa para comparação pareada de dados de variância igual e o teste T2 de Tamhane para dados de variância desigual. Os dados quantitativos são apresentados como média ± desvio padrão. As correlações foram analisadas por meio da análise de correlação de Spearman para variáveis não normalmente distribuídas e foram descritas como coeficientes de correlação e intervalos de confiança de 95%. P < 0,050 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.
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Resultados
MEBO acelera a cicatrização de feridas em camundongos diabéticos
Para validar a eficácia do MEBO em feridas diabéticas, estabelecemos um modelo de ferida diabética e tiramos fotos nos dias 1, 7, 13 e 18. As feridas em cada grupo cicatrizaram gradualmente ao longo do tempo (Figura 2A). As feridas no grupo NDB-CTR cicatrizaram completamente no dia 18. As feridas no grupo MEBO cicatrizaram mais rapidamente entre as feridas diabéticas, formando algumas partículas de granulaçã...
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Discussão
Os CDWs, uma complicação do diabetes, podem levar a mortalidade e incapacidade significativas, e são frequentemente associados a distúrbios vasculares29. O MEBO é eficaz no tratamento de CDWs; no entanto, seu mecanismo subjacente não é claro30. Portanto, objetivamos examiná-lo sob a perspectiva de exossomos e miRNAs funcionais. Neste estudo, descobrimos que a taxa de fechamento de feridas e a densidade de microvasos do grupo MEBO foram as m...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China sob Grant [número 81960875], Fundação de Ciências Naturais de Guangxi sob Grant [número 2023GXNSFDA026008], projeto de desenvolvimento e aplicação de tecnologia médica e de saúde apropriada de Guangxi sob Grant [número S2022134], Comissão de Saúde da Região Autônoma de Guangxi Zhuang de medicina ocidental projeto de pesquisa autofinanciado sob Grant [número 20210234] e Guangxi Bureau of Traditional Chinese Medicine autofinanciado projeto de pesquisa sob Grant [número GZZC2020255].
Contribuição do autor:
Yuanyuan Xu: Redação - rascunho original, Software, Metodologia, Investigação, Análise formal, Conceituação. Jianchang Xu: Recursos, Metodologia, Investigação. Anbang Zhou: Investigação, análise formal. Nimiao Cen: Visualização, Lina Huang: Supervisão. Biaoliang Wu: Revisão e edição de redação, Recursos, Administração de projetos, Metodologia, Aquisição de financiamento, Curadoria de dados, Conceituação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 e vezes; PBS | Solarbio (Pequim, China) | #P1020 | Solução tamponada |
| Solução de paraformaldeído a 4% | Solarbio (Pequim, China) | #P1110 | Consertar tecido |
| IgG peroxidase conjugada anti-coelho | Afinidade | #S0001 | Anticorpo secundário |
| Beifuxin gel | Essexbio (Zhuhai, China) | #042404A06 | Uma pomada para tratar feridas crônicas |
| anticorpo CD81 | Anticorpo de via de sinalização | #41779 | Anticorpo primário |
| Kit de Quimioluminescência Aprimorada | Epizyme (China) | #SQ101 | Kit de quimioluminescência para banda de proteína |
| Anticorpo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) | Afinidade | #AF7021 | Anticorpo primário |
| Prisma do GraphPad | https://www.graphpad.com/prism/ | Visualização | |
| ImagemJ | https://imagej.net/ij/ | Meça a área da ferida | |
| Kit de Ensaio de Proteína de Ácido Bicinchonínico Instantâneo (BCA) | Epizyme (China) | #ZJ102 | Determine a concentração de proteína |
| Sistema LightCycler96 | Roche | equipamento de qPCR | |
| MHY1485 | MedChemExpress (EUA) | #326914-06-1 | Um ativador do alvo mamífero do complexo 1 da rapamicina (mTORC1) |
| Kit mini miRNeasy | Tiangen (China) | #217004 | Extração de RNA (miRNA) |
| Pomada para queimaduras exposta à umidade | Mebo (Shantou, China) | #2403103B | Uma pomada para tratar feridas crônicas |
| Mistura de qPCR MonAmp SYBR Green (Sem ROX) | Mônada (China) | #MQ10101S | Kit de qPCR (mRNA) |
| MonScript RTIII All-in-One Mix com dsDNase | Mônada (China) | #MR05101S | Kit de transcrição reversa (mRNA) |
| Sistema de citometria de fluxo nano | N30E (China) | Um equipamento para analisar o tamanho e a concentração de exossomos | |
| microscópio óptico | Olympus (Tóquio, Japão) | Observar a patomorfologia do tecido | |
| solução salina fisiológica | Kelun (Sichuan, China) | #L24041709 | Solução salina fisiológica |
| membranas de fluoreto de polivinilideno | Millipore (EUA) | #IPVH00010 | Membrana Western blotting |
| Primers | Generay Biotech Co., Ltd. (Xangai, China) | ||
| Rab27a anticorpo | Tecnologia de sinalização celular | #69295 | Anticorpo primário |
| Kit de síntese de cDNA de primeira fita RevertAid | Thermo Fisher (EUA) | #K1622 | Kit de transcrição reversa (miRNA) |
| Tampão de lise RIPA | Solarbio (Pequim, China) | #R0010 | Extração total de proteínas |
| Dodecil Sulfato de Sódio– poliacrilamida | Epizyme (China) | #PG222 | Tampão de eletroforese |
| pentobarbital sódico | Merck (Xangai, China) | #P3761 | Anestésico |
| Camundongos C57BL/6 machos livres de patógenos específicos | Guangdong Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Guangdong, China) | Animais experimentais | |
| SPSS | https://www.ibm.com/spss | Análise estatística | |
| estreptozotocina | Solarbio (Pequim, China) | #S8050 | Induzir modelo de camundongo diabético |
| SYBR Green qPCR Master Mix | Roche (Suíça) | #4943914001-SR | Kit de qPCR (miRNA) |
| microscopia eletrônica de transmissão | Hitachi (Japão) | HT-7700 | Um equipamento para determinar a morfologia dos exossomos |
| TRIZOL | Invitrogen (EUA) | #15596026CN | Extração de RNA (mRNA) |
| anticorpo TSG101 | Abcam | # ab125011 | Anticorpo primário |
| Vps4a anticorpo | Abcam | # ab197896 | Anticorpo primário |
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