Um adesivo de hidrogel colorido estrutural inteligente que integra diagnóstico e tratamento para o tratamento da osteomielite crônica

Resumo

Este estudo apresenta um adesivo de hidrogel colorido estrutural inteligente (CPG) para o diagnóstico e tratamento da osteomielite crônica (OMC). O adesivo integra um hidrogel GelMA responsivo à temperatura, um andaime CSMA-PBA sensível ao pH e ácido salicílico para liberação controlada de medicamentos, monitoramento de infecções e promoção da regeneração tecidual.

Resumo

A osteomielite crônica (OMC) é uma infecção óssea persistente que é difícil de tratar com antibióticos convencionais devido a problemas como resistência a medicamentos e efeitos colaterais adversos. Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos um novo adesivo de hidrogel colorido estrutural inteligente (CPG) para o diagnóstico e o tratamento da COM. O adesivo combina quitosana metilacrilada modificada com ácido fenilborônico (CSMA-PBA) como um andaime, hidrogel GelMA responsivo à temperatura como enchimento e ácido salicílico (SA) para administração de medicamentos. A caracterização mostrou excelentes propriedades mecânicas e resistência adesiva. Experimentos de liberação de medicamentos confirmaram que o CPG responde efetivamente às mudanças de pH, permitindo a liberação controlada de medicamentos. O CPG também serve como uma ferramenta de diagnóstico, detectando mudanças de pH e temperatura no local da infecção, auxiliando na recuperação pós-operatória. Testes antimicrobianos mostraram inibição significativa do crescimento bacteriano, e experimentos in vitro demonstraram a capacidade do CPG de promover a expressão do fator de crescimento endotelial vascular enquanto reduz os marcadores inflamatórios. O estudo destaca as capacidades multifuncionais do adesivo de hidrogel, incluindo efeitos antimicrobianos, anti-inflamatórios e pró-vasculares, posicionando-o como uma opção terapêutica promissora para a osteomielite crônica.

Introdução

A osteomielite crônica tornou-se uma grande preocupação para os pacientes devido ao seu processo de tratamento desafiador e prolongado, alto risco de falha do tratamento e recorrência¹. As estratégias atuais de tratamento para osteomielite envolvem desbridamento cirúrgico de tecido necrótico e antibióticos parenterais. No entanto, a necessidade de altas doses de antibióticos para fornecer níveis terapêuticos no local de ação permanece ineficaz no tratamento da doença. Além disso, o uso de antibióticos em altas doses está associado a complicações adversas, como nefrotoxicidade, ototoxicidade, resistência a antibióticos e efeitos colaterais gastrointestinais. A administração local de antibióticos pode ser uma estratégia mais apropriada para superar essas desvantagens. Embora a administração local de antibióticos possa tratar infecções ósseas com efeitos colaterais mínimos, induzir a regeneração óssea é crucial para o sucesso do tratamento². Portanto, a administração simultânea de antibióticos e fatores de crescimento ósseo parece ser uma estratégia de tratamento promissora. Nas últimas décadas, o polimetilmetacrilato (PMMA) não biodegradável tem sido a base da antibioticoterapia local na osteomielite. No entanto, o uso de PMMA como sistema local de liberação de antibióticos enfrenta limitações como a necessidade de uma segunda cirurgia para remoção de grânulos, formação de biofilme bacteriano que favorece a colonização da superfície, liberação de antibióticos a longo prazo em níveis subterapêuticos levando à resistência a antibióticos, toxicidade sistêmica de monômeros residuais e falta de propriedades indutivas ósseas³. Assim, o desenvolvimento de sistemas de entrega local biodegradáveis usando polímeros biocompatíveis pode superar essas desvantagens. A literatura sugere que nanopartículas de fibroína de seda (SFNPs) incorporadas em um andaime de seda para entrega local de vancomicina podem ser usadas para tratar osteomielite grave. No entanto, a ausência de quaisquer moléculas bioativas indutoras de osso no material nanocompósito resultou nas construções preparadas não induzindo significativamente a regeneração óssea. Portanto, o projeto de materiais de andaime nanocompósitos adequados para o tratamento da osteomielite crônica tem sido uma questão desafiadora de preocupação. Os hidrogéis à base de polímeros naturais têm recebido ampla atenção devido à sua semelhança estrutural com a matriz extracelular (MEC) e sua capacidade de controlar a liberação de fármacos⁴.

Uma característica proeminente dos hidrogéis é sua capacidade de resposta a diferentes fatores, como temperatura e pH. As infecções crônicas podem aumentar o pH devido à carga microbiana, desregulação do equilíbrio regeneração-degradação e aumento das reações metabólicas de degradação. Além disso, a excisão cirúrgica de material desbridado, como tecido necrótico e pus, pode acelerar a transição do pH para valores mais altos⁵. Portanto, o uso de hidrogéis sensíveis ao pH capazes de detectar o pH da infecção crônica é crucial para o prognóstico da osteomielite crônica.

Neste estudo, propomos uma abordagem integrada de diagnóstico e tratamento usando um adesivo de hidrogel colorido estrutural inteligente, possuindo as características necessárias para o tratamento da osteomielite crônica, conforme ilustrado na Figura 1. Os hidrogéis supramoleculares derivados da montagem de redes poliméricas supramoleculares são materiais atraentes semelhantes à matriz extracelular natural (MEC). Devido às suas excelentes propriedades, incluindo resistência mecânica adequada, propriedades autocurativas, antibacterianas e anti-inflamatórias, os hidrogéis supramoleculares encontraram muitas aplicações no campo biomédico⁶. Em contraste, a cor estrutural, como um tipo de cor produzida por interações únicas de luz com nanoestruturas periódicas intrínsecas, tem atraído grande atenção em campos como displays ópticos, rótulos antifalsificação e dispositivos eletrônicos vestíveis. Particularmente, quando os materiais de cor estrutural são construídos a partir de polímeros responsivos, sua cor pode ser ajustada por diferentes estímulos por meio da expansão ou contração desses polímeros, sugerindo o potencial desses materiais como sensores. Portanto, pode-se imaginar que a combinação de hidrogéis supramoleculares com cores estruturais fornecerá uma estratégia única para a construção de novos adesivos de hidrogel para o tratamento da osteomielite crônica ^7,8,9.

Aqui, desenvolvemos uma abordagem integrada de diagnóstico e tratamento usando um adesivo de hidrogel colorido estrutural inteligente (CPG) composto de quitosana metilacriladana modificada mista com ácido fenilborônico (CSMA-PBA) como um andaime de pedra anti-proteína, hidrogel GelMA responsivo à temperatura como enchimento e carregado com ácido salicílico (SA) ¹⁰. Devido à reversibilidade das ligações de hidrogênio e interações não covalentes dentro da rede, o adesivo de hidrogel resultante não apenas exibiu excelentes propriedades mecânicas, mas também possuía capacidades de autocura. Além disso, devido à presença de CSMA, este adesivo de hidrogel também exibiu potente bioatividade antibacteriana. Além disso, utilizando a capacidade de resposta térmica do polímero GelMA, o adesivo de hidrogel pode liberar substâncias ativas quando colocado no local de inflamação de temperatura relativamente mais alta. Simultaneamente, devido à presença de ligações éster de boronato em CSMA-PBA, o hidrogel respondeu a mudanças no pH ambiental¹¹. Com base nessas vantagens, demonstramos que o adesivo de hidrogel supramolecular de cor estrutural proposto poderia tratar a osteomielite crônica, regulando negativamente a expressão de fatores inflamatórios, atividade antibacteriana e promovendo a angiogênese. Notavelmente, beneficiando-se das propriedades ópticas únicas do andaime de pedra anti-proteína, o adesivo de hidrogel pode até exibir capacidade de mudança de cor em resposta a estímulos de temperatura, demonstrando potencial significativo no monitoramento e gerenciamento da osteomielite crônica e na orientação do tratamento clínico.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica e realizados seguindo as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório (publicação do NIH nº 80-23, revisada em 1978). Ratos machos da raça Sprague-Dawley (8 semanas de idade) foram utilizados nos experimentos.

Preparação de moldes de cristais coloidais de sílica (SCCs)
As CCEs foram preparadas conforme descrito anteriormente 12,13,14. Lâminas de vidro limpas e tratadas com plasma foram imersas em uma solução a 5% de nanopartículas de sílica monodispersas (12 nm de diâmetro) dispersas em água deionizada. A solução foi continuamente agitada à temperatura ambiente (25 °C) por 1 h para garantir a dispersão uniforme das nanopartículas de sílica. As lâminas foram removidas da solução e secas ao ar por 1 h em temperatura ambiente. O processo de secagem foi fundamental para garantir a aderência adequada das nanopartículas na superfície das lâminas de vidro. Após a secagem ao ar, as lâminas foram colocadas em um forno ventilado a 60 °C por 2 dias para evaporar qualquer solvente remanescente e facilitar a formação de cristais coloidais. Durante essa evaporação, as lâminas foram posicionadas em um ângulo de 45° para promover a formação de matrizes de cristais coloidais ordenados. As matrizes de cristal coloidal ordenadas foram caracterizadas por automontagem e exibiram diferentes cores estruturais dependendo do espaçamento entre partículas. Essas matrizes foram então usadas como modelos para a fabricação subsequente de patches de hidrogel.

Elaboração de adesivos de hidrogel colorido estrutural inteligente (CPG) integrados para diagnóstico e tratamento
Scaffolds de pedra anti-proteína foram replicados a partir dos vazios de moldes de cristal coloidal de sílica (SCCs). As lâminas de vidro limpas foram primeiro imersas em uma solução a 5% de nanopartículas de sílica monodispersas (12 nm de diâmetro) em água deionizada, e a solução foi agitada à temperatura ambiente (25 °C) por 1 h para garantir a dispersão uniforme das nanopartículas pela superfície. O processo de agitação foi crucial para evitar a formação de agregados e garantir uma distribuição homogênea das nanopartículas. Após a imersão, as lâminas foram secas ao ar por 1 h em temperatura ambiente (RT), seguidas de secagem em estufa a 60 °C por 2 dias para facilitar a evaporação do solvente e promover a automontagem das nanopartículas de sílica em matrizes de cristais coloidais bem ordenadas. Durante a evaporação, as lâminas foram posicionadas em um ângulo de 45° para facilitar o alinhamento das nanopartículas, promovendo a formação de um arranjo periódico com distâncias controladas entre as partículas. Essa matriz ordenada exibiu cor estrutural, uma característica dos cristais coloidais, e serviu como modelo para a estrutura subsequente do hidrogel.

Os CCEs preparados foram então embebidos na solução pré-gel CPG, que consistia em GelMA na concentração de 10% p/v dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As amostras foram deixadas por 5 min à temperatura ambiente (RT) para garantir a infiltração completa do GelMA nos vazios entre as nanopartículas de sílica, garantindo uma distribuição uniforme dentro da estrutura do molde. Esta etapa foi crítica para garantir que a matriz de hidrogel fosse incorporada uniformemente ao molde e que a estrutura final do hidrogel replicasse o arranjo de nanopartículas ordenado dos SCCs. Após a imersão, a solução de pré-gel foi polimerizada sob luz UV (365 nm) na intensidade de 3 mW/^cm2 por 5 min. Essa exposição aos raios UV iniciou a reticulação do GelMA, solidificando a matriz de hidrogel. O tempo e a intensidade da exposição foram cuidadosamente otimizados para obter reticulação suficiente sem superexpor o hidrogel, o que poderia levar a gelificação excessiva ou perda da estrutura do molde.

Caracterização do CPG
A morfologia da seção transversal do hidrogel foi observada por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) com tensão de aceleração de 5 kV após revestir as amostras (1 mm x 1 mm) com ouro¹⁵. Isso nos permitiu visualizar a estrutura nanoporosa e confirmar a uniformidade da rede de hidrogel. O comportamento do inchamento foi avaliado pela imersão de amostras de hidrogel de 10 mg em 10 mL de PBS em diferentes intervalos de tempo (0, 30, 60, 120 e 180 min). A porcentagem de inchaço foi calculada medindo o aumento do volume de hidrogel ao longo do tempo, o que forneceu informações sobre a capacidade do hidrogel de absorver água em diferentes condições. A análise reológica foi realizada por meio de um reômetro com deformação de 1%, aplicando-se frequências angulares variando de 1 rad/s a 100 rad/s para medir o módulo de armazenamento (G') e o módulo de perda (G''). Esta etapa foi essencial para entender as propriedades mecânicas do hidrogel, incluindo seu comportamento viscoelástico sob estresse. As propriedades adesivas de cisalhamento foram avaliadas com uma máquina universal de ensaio de tração (Instron) de acordo com a ASTM F2255-05 (2015) a uma velocidade de 10 mm/min e uma pré-carga de 0,01 N para avaliar a capacidade do hidrogel de aderir aos tecidos biológicos. A liberação do fármaco foi avaliada por meio de espectrofotômetro UV por meio do monitoramento da absorbância em λ = 280 nm após imersão do hidrogel em 5 mL de PBS (pH 7,4). A liberação foi quantificada usando uma curva padrão de concentrações de ácido salicílico para confirmar as capacidades de liberação controlada do hidrogel CPG. Por fim, os hidrogéis foram imersos em soluções tampão de pH 4,5 e 7,2 por 30 min para avaliar a responsividade ao pH, observando mudanças no volume e na aparência sob diferentes condições de pH¹⁶.

Temperatura e pH responsivos de patches CPG
Os adesivos de CPG (aproximadamente 2 mm de diâmetro) foram colocados em uma solução tampão de 5 mL com pH 7,2 e mantidos a 37 °C usando banho-maria com temperatura controlada por 30 min para mimetizar as condições fisiológicas. Os espectros de refletância foram medidos usando um espectrofotômetro UV-Vis em comprimentos de onda variando de 400 nm a 800 nm. Após as medições iniciais, os adesivos foram transferidos para soluções tampão com diferentes valores de pH (por exemplo, pH 4,5, 7,2 e 9,0) e mantidos a 37 °C por 30 min. A resposta ao microambiente, incluindo qualquer mudança de cor, foi observada visualmente, e os espectros de refletância foram registrados novamente para analisar a mudança de cor. Essa capacidade de resposta à temperatura e ao pH fornece informações valiosas sobre como o hidrogel reage às mudanças no ambiente da ferida.

Testes antibacterianos in vitro
Os testes antibacterianos foram realizados usando procedimentos padrão. As cepas de Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) e Escherichia coli (E. coli, ATCC 53868) foram usadas para avaliar a atividade antibacteriana dos adesivos CPG. Essas cepas de referência padrão foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) e foram usadas como cepas de controle de qualidade (QC) para validar os procedimentos de teste antimicrobiano. O teste de suscetibilidade antimicrobiana foi realizado usando o método de microdiluição em caldo de acordo com as diretrizes CLSI M100. As suspensões bacterianas foram preparadas em caldo Mueller-Hinton, um meio padrão para testes antimicrobianos. A turbidez foi ajustada para um padrão de McFarland de 0,5, equivalente a aproximadamente 1,5 × 10⁸ UFC/mL. As suspensões foram então inoculadas com adesivos CPG (2 mm de diâmetro), preparados com água deionizada ou tampão pH 6,0 de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) (10 mM). Os adesivos foram adicionados às suspensões bacterianas na proporção de um adesivo por 1 mL de cultura. As suspensões foram incubadas a 37 °C por 24 h. Após a incubação, o crescimento bacteriano foi avaliado por meio de diluições seriadas das culturas em ágar nutriente, e as unidades formadoras de colônias (UFCs) foram contadas após uma incubação de 24 horas a 37 °C. Este procedimento forneceu uma medida quantitativa da eficácia antibacteriana.

Avaliação de biocompatibilidade
Os experimentos foram conduzidos conforme descrito anteriormente. Os adesivos de CPG foram processados por diálise em PBS (pH 7,4) por 4 h, seguido de esterilização com etanol (70%) por 10 min e desinfecção UV (365 nm) por 30 min para garantir que todos os contaminantes biológicos fossem removidos. As células L929 (ATCC CCL-1) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C com 5% de CO² para manter a viabilidade celular. As células foram semeadas em placas de 24 poços a 2 × 10⁵ células/mL, com ou sem remendos de CPG (2 mm de diâmetro), em triplicata. As células foram divididas em três grupos experimentais: controle em branco, grupo CPG e grupo CPG (MES). Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio MTT, um método amplamente aceito para avaliar a atividade metabólica celular. Para o ensaio de MTT, 20 μL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço, seguidos de incubação a 37 °C por 4 h. Após a incubação, o meio foi removido e 150 μL de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan formados pelas células vivas. A absorbância foi medida a 570 nm usando um leitor de microplacas para quantificar o número de células viáveis. Essa abordagem garantiu a avaliação confiável da citotoxicidade e biocompatibilidade dos adesivos de hidrogel.

Atividade anti-inflamatória
A atividade antioxidante do CPG foi avaliada usando um kit de ensaio ROS. As células L929 (ATCC CCL-1) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e incubadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 h para permitir a fixação celular e proliferação inicial. Para induzir o estresse oxidativo, as células foram tratadas com 3 μg/mL de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 12 h. Após a indução do estresse oxidativo, o extrato de hidrogel (preparado pela dissolução de 1 mg de hidrogel CPG em 1 mL de meio DMEM) foi adicionado às células. As células foram incubadas por mais 12 h para permitir os potenciais efeitos antioxidantes do hidrogel CPG. Posteriormente, as células foram coradas com solução de 10 μM DCFH-DA (diluída em meio DMEM) e incubadas a 37 °C por 20 min. DCFH-DA é uma sonda fluorescente usada para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) dentro das células. Após a coloração, as células foram lavadas com PBS e as imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio de fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. A intensidade da fluorescência verde foi inversamente correlacionada com a atividade antioxidante do hidrogel, fornecendo uma avaliação visual da capacidade do hidrogel de mitigar o estresse oxidativo nas células.

Modelo animal de osteomielite de rato
Um modelo de osteomielite crônica foi estabelecido: ratos Sprague-Dawley machos (8 semanas de idade) foram anestesiados com isoflurano (2-3% em oxigênio) para garantir que permanecessem imóveis e sem dor durante a cirurgia. Uma incisão de 2 cm foi feita na face lateral do fêmur esquerdo, e uma agulha estéril de 27-G foi usada para injetar 1 10⁷ UFC de S. aureus diretamente na região trabecular do fêmur. A injeção foi realizada na cavidade da medula óssea do fêmur para induzir infecção no espaço da medula, o local primário da osteomielite. As bactérias foram entregues lentamente para garantir a deposição adequada na medula óssea. Após 10 dias, os ratos foram eutanasiados por inalação de CO₂ e os fêmures infectados foram cuidadosamente dissecados. O tecido de granulação foi excisado do local da infecção e imediatamente imerso em paraformaldeído a 4% por 24 h para preservar a integridade do tecido. Após a fixação, o tecido ósseo foi descalcificado usando um agente descalcificante (por exemplo, EDTA) por 48-72 h, dependendo do tamanho do osso, para permitir a secção adequada para análise histológica e imuno-histoquímica. As amostras de osso descalcificado foram então processadas para exame histológico, imuno-histoquímica (IHQ) e coloração por imunofluorescência. Para análise quantitativa de PCR em tempo real (qPCR), o tecido de granulação foi armazenado a -80 °C para extração subsequente de RNA, permitindo a análise de perfis de expressão gênica relacionados à inflamação, regeneração óssea e respostas imunes

Avaliação do tratamento da osteomielite in vivo
O tecido de granulação foi embebido em parafina e seccionado a 5 μm usando um micrótomo. Os cortes foram corados com tricrômico de Masson (15 min com hematoxilina, 1 h com azul de anilina) para avaliar a deposição de colágeno e remodelamento tecidual. A coloração de hematoxilina e eosina (HE) (5 min com hematoxilina, 2 min com eosina) foi usada para observar a morfologia geral do tecido e a inflamação. A imuno-histoquímica (IHQ) com anti-CD31 (1:100) e anti-EGF (1:200) foi realizada por 1 h a 37 °C, seguida de incubação secundária de anticorpos em temperatura ambiente (TR) por 30 min usando IgG anti-camundongo ou IgG anti-coelho (diluído 1:200), dependendo do anticorpo primário utilizado, para avaliar a angiogênese e a expressão do fator de crescimento. A coloração por imunofluorescência foi realizada com anti-VEGF (1:100) e anti-bFGF (1:200) por 1 h a 37 °C, seguida de incubação secundária de anticorpos por 30 min em RT. Cortes foram observados para expressão de CD31, EGF, VEGF e bFGF usando um microscópio de fluorescência. Para análise quantitativa de PCR em tempo real (qPCR), a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6) foi analisada após extração de RNA com RNAiso Plus e síntese de cDNA usando o kit de reagentes PrimeScript RT. A PCR foi realizada usando SYBR Green PCR Master Mix para avaliar quantitativamente a resposta inflamatória em nível molecular.

Medidas de controle de qualidade
Para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados experimentais, todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos padronizados. Cada experimento incluiu grupos de controle apropriados, como controles em branco (ratos infectados com S. aureus , mas sem tratamento), grupos de controle (ratos submetidos a procedimentos cirúrgicos sem infecção bacteriana e sem tratamento) e grupos de tratamento comparativo (ratos recebendo diferentes tratamentos para osteomielite, como antibióticos ou uma droga experimental), para minimizar a variabilidade. Todos os ensaios foram realizados em triplicata para garantir consistência e reduzir o viés experimental. Cada grupo continha 6 ratos para garantir significância estatística. Instrumentos, incluindo um espectrofotômetro UV-Vis, reômetro e testador de tração, foram calibrados rotineiramente antes do uso de acordo com as especificações do fabricante. As culturas bacterianas e celulares foram preparadas sob condições ambientais controladas em um gabinete de biossegurança, e os procedimentos de coloração foram seguidos usando protocolos consistentes para garantir a reprodutibilidade. A aquisição de dados foi realizada com configurações de microscópio unificadas para minimizar a variabilidade entre amostras e garantir uma medição precisa.

Análise estatística
A análise estatística foi realizada no programa GraphPad Prism (versão 8.0). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). Para comparação entre vários grupos, uma análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida pelo teste post-hoc de Tukey foi usada para avaliar diferenças nas propriedades mecânicas, comportamento termorresponsivo, atividade antibacteriana e viabilidade celular. O teste t de Student foi usado para comparações pareadas quando apenas dois grupos foram comparados, como no caso de comparar os picos de reflexão de manchas de CPG em diferentes valores de pH ou mudanças de temperatura. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo para todas as análises. Todos os experimentos foram realizados em triplicata para garantir consistência e reprodutibilidade dos resultados.

Resultados

Fabricação e caracterização de remendos CPG (Figura 1)
Em um experimento típico, nanopartículas de sílica monodispersas foram automontadas por evaporação de solvente para formar matrizes compactadas, resultando em revestimentos de cores estruturais (SCCs) ^{17 , 18 , 19} , que foram posteriormente usados para criar manchas de hidrogel de cor estruturais multifuncionais, conforme mostrado na Figura 1. O processo envolveu a infiltração de uma solução de pré-gel nas lacunas em nanoescala dos SCCs por meio de ação capilar. A polimerização UV foi então empregada para formar o filme híbrido de SCCs e hidrogel. Uma vez que os CCEs foram gravados, um andaime de pedra anti-proteína inversa com uma estrutura porosa periódica foi obtido. Finalmente, o hidrogel GelMA termorresponsivo foi preenchido nas lacunas em nanoescala do andaime de pedra anti-proteína, seguido de cura, para criar os adesivos CPG independentes.

A forte rede de reticulação do hidrogel conferiu excelentes propriedades mecânicas aos patches CPG. Observou-se que os remendos eram resistentes o suficiente para suportar o alongamento sem causar nenhum dano e podiam ser esticados até 2,5 vezes seu comprimento original. É importante ressaltar que os patches CPG exibiram cores estruturais vibrantes e sofreram mudanças dinâmicas de cor durante o alongamento, uma característica única resultante do arranjo periódico de nanoestruturas de alta ordem dentro dos patches. Essas nanoestruturas criam lacunas de banda fotônica (PBGs), onde a luz em certos comprimentos de onda dentro do PBG é refletida seletivamente em vez de transmitida, dotando os patches CPG com suas cores estruturais características e picos de reflexão.

A posição de reflexão do pico do patch CPG pode ser estimada pela equação²⁰:

λ = média de 1,633dn

onde d é a distância entre os planos de difração e n_média é o índice de refração médio do material, que é calculado como a média dos índices de refração dos componentes, incluindo hidrogel GelMA e outros materiais usados no patch. Esta equação sugere que, à medida que o patch é esticado e d diminui, o comprimento de onda de reflexão diminui, levando a um desvio para o azul na cor estrutural do patch. A resistência à tração dos remendos também foi testada, e verificou-se que a capacidade de deformação dos remendos diminuiu devido ao enchimento do hidrogel GelMA nas lacunas em nanoescala do andaime de pedra anti-proteína. A deformação dos remendos CPG após o estiramento oferece um meio altamente sensível para detecção de deformação, tornando-os adequados para aplicações que requerem monitoramento mecânico.

Comportamento termorresponsivo e sensível ao pH de patches CPG (Figura 2)
Os adesivos CPG exibiram propriedades termorresponsivas notáveis devido ao hidrogel GelMA. Ao aumentar a temperatura ambiente para 37 °C, o hidrogel sofreu encolhimento, liberando moléculas de água e carga carregada. Esse encolhimento resultou em uma redução no tamanho dos nanoporos dentro dos patches CPG, alterando seu PBG e, consequentemente, mudando o espectro de reflexão. A Figura 2 ilustra esse comportamento, mostrando como a cor estrutural das manchas muda em resposta a variações de temperatura e pH.

Para confirmar essas observações, os adesivos CPG foram colocados em um ambiente simulado de ferida de infecção crônica a 37 °C e pH 7,2. À medida que o pH da solução aumentou, foi observado um desvio para o azul no pico de reflexão das manchas de CPG, indicando que o tamanho dos nanoporos diminuiu. Por outro lado, quando o pH diminuiu, as manchas exibiram um desvio para o vermelho, correspondendo a uma expansão dos nanoporos. Esse comportamento sensível ao pH foi atribuído à hidrólise de ligações éster de boronato no CSMA-PBA sob condições ácidas, que quebrou as ligações e resultou em um desvio para o vermelho da cor estrutural. No entanto, quando o pH foi alcalino, não foi observada mudança significativa de cor, indicando a estabilidade das manchas em condições básicas. Esses achados sugerem que os adesivos CPG podem ser usados para monitorar as mudanças de temperatura e pH em ambientes de feridas, o que é crucial para o tratamento eficaz de feridas.

Atividade antibacteriana dos adesivos CPG (Figura 3)
As propriedades antibacterianas dos adesivos CPG foram avaliadas por co-cultivo com S. aureus e E. coli. A Figura 3A,B mostra que os adesivos CPG reduziram significativamente o crescimento bacteriano, demonstrando suas propriedades antibacterianas eficazes. Essa eficácia antibacteriana foi atribuída à interação eletrostática entre a superfície CMCSMA carregada positivamente dos adesivos e as paredes celulares bacterianas carregadas negativamente²¹. Essa interação interrompeu a estrutura da membrana bacteriana, levando à morte bacteriana. Os grupos catiônicos de CMCSMA podem se ligar a componentes aniônicos na membrana bacteriana, levando à despolarização da membrana e aumento da permeabilidade²². Além disso, devido ao seu tamanho molecular relativamente pequeno e cadeias poliméricas flexíveis, o CMCSMA pode penetrar na bicamada lipídica de forma mais eficaz, causando vazamento de substâncias intracelulares e interferindo na atividade metabólica. O pequeno tamanho das moléculas de CMCSMA facilitou ainda mais sua penetração na membrana celular bacteriana, onde interagiram com biomoléculas essenciais, interrompendo o metabolismo bacteriano e os sistemas enzimáticos²³. Além disso, considerando a robusta capacidade de formação de biofilme de S. aureus, vale a pena notar que materiais à base de quitosana, como o CMCSMA, foram relatados para interromper biofilmes bacterianos penetrando na matriz de substância polimérica extracelular (EPS) e interferindo em sua integridade. Isso permite que os agentes antibacterianos acessem e matem bactérias incorporadas em biofilmes, que normalmente são resistentes aos antibióticos convencionais^24,25. Conforme mostrado na Figura 3A, a comparação visual das colônias bacterianas demonstra claramente uma redução substancial após o tratamento com adesivos CPG, destacando sua atividade bactericida eficaz e seu potencial promissor para uso em ambientes de feridas propensas a infecções.

Funcionalidade biológica dos adesivos CPG (Figura 4)
Os adesivos CPG demonstraram funcionalidade biológica significativa, além de suas propriedades antibacterianas. A Figura 4C, D mostra que os patches eliminaram efetivamente as espécies reativas de oxigênio (ROS) dentro das células, conforme indicado pela diminuição do sinal de fluorescência verde no grupo CPG. A eliminação de ROS é essencial na cicatrização de feridas, pois a produção excessiva de ROS pode prejudicar a regeneração tecidual. A viabilidade das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) co-cultivadas com os adesivos CPG foi avaliada por meio da coloração de viabilidade, conforme mostrado na Figura 4A. Os resultados indicaram que a maioria das células estava viva, com apenas uma pequena proporção de células mortas, sugerindo que os adesivos CPG promovem a viabilidade celular e apoiam a proliferação celular.

A Figura 4B mostra os resultados de um ensaio de MTT, que demonstrou que os adesivos CPG promoveram significativamente a proliferação celular. Além disso, a Figura 4F,G mostrou que os adesivos CPG aumentaram a angiogênese ao promover a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e do fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), que são críticos para a proliferação de células endoteliais e a formação de novos vasos sanguíneos. Esses resultados destacam o potencial dos adesivos CPG não apenas para prevenir infecções, mas também para melhorar a regeneração dos tecidos e acelerar a cicatrização de feridas.

Avaliação in vivo de patches CPG (Figura 5)
Experimentos in vivo conduzidos usando um modelo de osteomielite crônica mostraram que os adesivos CPG reduziram significativamente a infecção e a inflamação. A Figura 5A mostra a análise histológica (coloração H&E), onde o grupo controle exibiu inflamação característica, destruição óssea, tecido necrótico e alta infiltração de células de defesa, enquanto o grupo tratamento apresentou redução significativa na infecção, inflamação e infiltração de células de defesa. No grupo CPG, observou-se aumento da migração de osteoblastos, transformação de osteoblastos em células ósseas, formação vascular, nova formação óssea e redução da infecção, confirmando ainda mais a eficácia dos adesivos CPG na promoção da regeneração tecidual.

Além disso, a Figura 5B mostra a coloração da angiogênese, confirmando que os adesivos CPG promoveram a formação de novos vasos sanguíneos, o que é fundamental para o reparo tecidual. Esses achados sugerem que os adesivos CPG desempenham um papel duplo no controle da infecção e na promoção da regeneração tecidual, tornando-os altamente adequados para aplicações crônicas de cicatrização de feridas e regeneração óssea.

Figura 1: Preparação e caracterização do patch de hidrogel colorido estrutural (CPG). (A): Reação entre CSMA e PBA; (B): Fotografia do CPG, demonstrando a mudança de cor ao alongamento; (C): Caracterização de CPG por MEV; (D): Comportamento de inchaço do CPG; (E): Perfil de degradação do CPG; (F): Cinética de liberação de drogas do CPG. Barra de escala: 100 nm. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Seis ratos foram utilizados no grupo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Detecção inteligente do patch CPG. (A): Variação da cor estrutural do patch CPG com mudanças na temperatura ambiente e pH; (B): Análise espectral do patch CPG em diferentes temperaturas; (C): Análise espectral do patch CPG em diferentes níveis de pH. Barra de escala: 1 mm. Os dados representam ± média DP, analisados por meio de ANOVA de uma via com teste post-hoc de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Atividade antibacteriana do adesivo CPG. (A): Imagens representativas da co-cultura de S. aureus e E. coli com adesivo CPG; (B): Análise dos valores de densidade óptica (OD). Barra de escala: 5 mm. As barras de erro representam DP. A significância estatística foi determinada por ANOVA de uma via com teste post-hoc de Tukey. Foram utilizadas seis repetições por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Avaliação funcional biológica do retalho CPG. (A): Coloração de viabilidade de células HUVEC co-cultivadas com adesivo CPG por 48 h, mostrando células vivas (verde) e células mortas (vermelho); (B): Proliferação celular medida pelo ensaio MTT; (C): Coloração ROS do adesivo CPG; (D): taxa de sequestro de DPPH no grupo VEGF; (E): análise de q-PCR de fatores inflamatórios; (F): Promoção da angiogênese por patch CPG; (G): Resultados de Western blot da expressão de VEGF e bFGF; (H): Análise estatística dos valores em escala de cinza de VEGF e bFGF. Barra de escala: 100 μm. As barras de erro representam SD. Os dados foram analisados usando ANOVA de uma via com teste post-hoc de Tukey. Seis ratos foram usados em cada grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Experimentos in vivo do patch CPG. (A): coloração HE; (B): Coloração de angiogênese. Barra de escala: 100 μm. Os dados representam ± média do DP, analisados por ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey. Cada grupo continha 6 animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os resultados deste estudo demonstram a multifuncionalidade dos adesivos de hidrogel CPG, particularmente em termos de suas mudanças estruturais de cor, sensibilidade à temperatura, capacidade de resposta ao pH e propriedades antimicrobianas. Esses adesivos de hidrogel podem sofrer mudanças visíveis de cor estrutural quando submetidos a deformação mecânica, oferecendo um mecanismo altamente sensível para monitorar a tensão. Esse recurso se alinha com estudos anteriores que exploraram a cor estrutural em materiais para aplicações de sensores, onde tais mudanças de cor são empregadas como indicadores de deformação ou pressão^26,27. Nosso estudo estende essas descobertas utilizando essas mudanças de cor como um meio não invasivo de monitorar o estresse da ferida, o que é essencial para avaliar a cicatrização da ferida em tempo real. A capacidade de monitorar essas tensões mecânicas fornece informações críticas para os médicos, potencialmente ajudando a identificar sinais precoces de complicações, como deiscência de sutura, apoiando intervenções mais direcionadas e oportunas. É importante ressaltar que a leitura óptica fornece um mecanismo de detecção direto e intuitivo sem a necessidade de energia adicional ou dispositivos de imagem, oferecendo uma solução de monitoramento descentralizada ideal para cuidados pós-operatórios no local de atendimento ou em casa.

Os comportamentos termorresponsivos e sensíveis ao pH dos adesivos de hidrogel CPG aumentam seu potencial para uso clínico. À medida que as feridas cicatrizam, flutuações de temperatura e pH são comuns, principalmente na presença de infecção ou inflamação²⁸. Sabe-se que temperaturas elevadas e valores alterados de pH no local da ferida estão associados a essas condições. Neste estudo, os retalhos de CPG exibiram sensibilidade a tais alterações, permitindo o monitoramento em tempo real das condições locais da ferida. Esse recurso é de particular valor em ambientes clínicos, onde a detecção precoce de infecção ou inflamação é essencial para otimizar as estratégias terapêuticas. O monitoramento das variações de temperatura e pH é especialmente importante no tratamento de feridas porque servem como biomarcadores precoces e não invasivos do estado da ferida²⁹. A temperatura elevada pode sinalizar o início da infecção antes que os sintomas clínicos se manifestem, enquanto as mudanças para o pH alcalino geralmente indicam cronicidade, colonização microbiana e cicatrização prejudicada. Em contraste, ambientes ácidos estão associados a feridas agudas e melhor potencial de cicatrização²⁴. Assim, a integração de elementos responsivos à temperatura e ao pH nos curativos permite intervenções oportunas e avaliação contínua do progresso da cicatrização, o que pode prevenir a deterioração da ferida ou a progressão para infecção sistêmica. A capacidade do hidrogel de se adaptar dinamicamente a essas mudanças também fornece uma nova ferramenta para os médicos monitorarem continuamente o estado da ferida, oferecendo maior precisão no rastreamento do processo de cicatrização. Além disso, essa capacidade de resposta dinâmica permite o controle espaço-temporal sobre a liberação terapêutica, garantindo que a administração do medicamento seja sincronizada com pistas patológicas, que é um objetivo central dos biomateriais inteligentes modernos.

Além disso, as propriedades antimicrobianas dos adesivos de hidrogel CPG são críticas para reduzir a carga bacteriana no local da ferida. A quitosana, que foi incorporada à estrutura do hidrogel, é reconhecida há muito tempo por suas propriedades antimicrobianas, devido à sua natureza catiônica, que facilita as interações eletrostáticas com as paredes celulares bacterianas carregadas negativamente²⁹. No entanto, o mecanismo antibacteriano dos materiais à base de quitosana não se limita à simples atração de carga. Ao entrar em contato com as membranas bacterianas, a quitosana pode aumentar a permeabilidade da membrana, levando ao vazamento de conteúdo intracelular, como íons potássio, proteínas e ácidos nucléicos. Além disso, a quitosana pode quelar íons metálicos divalentes (por exemplo, Ca²⁺ e Mg²⁺), interrompendo a atividade enzimática e as funções metabólicas. A quitosana de baixo peso molecular também pode penetrar na parede celular bacteriana e se ligar ao DNA, inibindo a transcrição do mRNA e a síntese de proteínas. Esses mecanismos multifacetados foram amplamente documentados. A estrutura porosa do andaime de hidrogel amplifica ainda mais esses efeitos, aumentando a área de superfície e o contato bacteriano, resultando em eficácia antibacteriana sinérgica. Essa propriedade é particularmente relevante no tratamento de infecções crônicas, como a osteomielite, onde a formação de biofilme complica o processo de cicatrização^25,30. Os resultados deste estudo demonstram que os adesivos de hidrogel CPG foram eficazes na inibição do crescimento bacteriano, reduzindo a carga bacteriana no local da ferida e potencialmente criando um ambiente mais favorável para a regeneração tecidual. Essa atividade antimicrobiana, combinada com as outras propriedades do hidrogel, posiciona os adesivos como um candidato promissor para o tratamento de feridas crônicas, que muitas vezes são atormentadas por contaminação bacteriana e cicatrização retardada. Além disso, ao inibir a colonização bacteriana local, o hidrogel impede indiretamente a regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias que são frequentemente sustentadas em feridas crônicas infectadas, promovendo assim um microambiente pró-regenerativo.

Embora as EROs sejam tipicamente associadas ao estresse oxidativo e danos teciduais, é amplamente reconhecido que a geração controlada de EROs desempenha um papel crucial na erradicação bacteriana. ROS, como radicais hidroxila e ânions superóxido, podem oxidar proteínas bacterianas, lipídios e DNA, levando à ruptura da membrana e à morte celular. Portanto, a presença de ROS em níveis moderados serve como um componente crítico dos mecanismos de defesa antimicrobiana inatos. No contexto da osteomielite crônica, onde a colonização bacteriana e a formação de biofilme persistem, a eliminação de patógenos é um pré-requisito para uma regeneração tecidual significativa. O hidrogel CPG, ao suprimir ROS excessivos enquanto mantém a atividade antibacteriana eficaz por meio da ruptura da membrana mediada por CMCSMA e penetração de biofilme, oferece uma abordagem equilibrada. Essa dupla função garante que a inflamação não seja prolongada pela presença bacteriana persistente, permitindo uma transição da ativação imunológica para um microambiente regenerativo. Assim, em vez de eliminar indiscriminadamente as ROS, este sistema modula o microambiente oxidativo para apoiar a depuração bacteriana e a cicatrização do tecido.

Além da atividade antimicrobiana, os adesivos de hidrogel CPG exibiram funcionalidade biológica crucial para o reparo e regeneração tecidual³¹. Ensaios in vitro demonstraram que o hidrogel apoiou a viabilidade e proliferação celular, bem como a angiogênese. Esses achados são consistentes com estudos anteriores que destacaram a importância da angiogênese na cicatrização de feridas³². A angiogênese é fundamental para fornecer suprimento adequado de oxigênio e nutrientes ao tecido ferido, facilitando a regeneração do tecido. Além disso, os efeitos pró-angiogênicos do hidrogel são particularmente importantes para o tratamento de feridas crônicas, pois essas feridas frequentemente sofrem de má vascularização, o que dificulta o processo de cicatrização^33,34. Ao promover a formação de vasos sanguíneos, o hidrogel CPG não apenas contribui para a regeneração do tecido, mas também cria um ambiente mais propício para a sobrevivência a longo prazo do tecido recém-formado. Além disso, a capacidade do hidrogel de promover a migração e diferenciação de osteoblastos agrega valor significativo no contexto da cicatrização óssea, especialmente para pacientes com infecções ósseas crônicas ou defeitos ósseos³⁵. O aprimoramento da osteogênese é um caminho promissor para melhorar os resultados na osteomielite e condições ósseas relacionadas, onde a cicatrização é frequentemente comprometida. Essa funcionalidade osteoindutiva, integrada ao controle de infecção localizada, aborda um desafio central na engenharia de tecidos musculoesqueléticos: a necessidade de soluções convergentes que promovam a defesa antimicrobiana e a regeneração tecidual em uma única plataforma.

Os resultados in vivo corroboram ainda mais o potencial terapêutico dos adesivos de hidrogel CPG, mostrando sua capacidade de apoiar o reparo tecidual, reduzir a infecção e promover a osteogênese. Em modelos de feridas crônicas, esses hidrogéis facilitaram efetivamente o fechamento da ferida e a regeneração do tecido. Em modelos de regeneração óssea, o hidrogel CPG promoveu a migração e diferenciação de osteoblastos, potencializando a cicatrização óssea. Esses achados se alinham com os de outros estudos que exploraram estratégias de cicatrização de feridas e regeneração óssea baseadas em hidrogel³⁶. A capacidade dos adesivos de hidrogel CPG de tratar simultaneamente a infecção, promover a angiogênese e apoiar a osteogênese fornece uma plataforma poderosa para o tratamento abrangente de feridas, tornando-o um candidato promissor para uso clínico.

Apesar desses resultados promissores, existem várias limitações para o estudo atual. Primeiro, enquanto os modelos in vitro e in vivo demonstraram resultados positivos, os estudos pré-clínicos foram conduzidos principalmente em modelos murinos. Embora os camundongos sejam amplamente utilizados para estudos de cicatrização de feridas, eles podem não replicar totalmente a complexidade da cicatrização de feridas humanas. Portanto, uma validação adicional em modelos animais maiores, bem como em ensaios clínicos em humanos, é necessária para confirmar a segurança e a eficácia desses adesivos de hidrogel em ambientes clínicos do mundo real. Em segundo lugar, embora os hidrogéis CPG exibissem boas propriedades mecânicas e funcionalidade biológica no curto prazo, sua estabilidade a longo prazo e comportamento de degradação in vivo permanecem obscuros. Os hidrogéis podem se degradar com o tempo, e seus produtos de degradação podem afetar o processo de cicatrização ou até mesmo induzir reações adversas. Estudos futuros devem se concentrar na otimização da taxa de degradação desses hidrogéis para garantir que eles se degradem de maneira controlada, sem liberar subprodutos nocivos. Além disso, a liberação controlada de agentes bioativos incorporados ao hidrogel deve ser refinada para garantir efeitos terapêuticos sustentados ao longo do tempo, especialmente para o tratamento de feridas crônicas.

Embora este estudo se concentre em um andaime supramolecular baseado em hidrogel, abordagens alternativas para abordar a mesma hipótese terapêutica incluem biossensores eletroquímicos, sistemas microfluídicos enrolados em chip e bandagens inteligentes que incorporam componentes eletrônicos para sensoriamento ambiental. No entanto, ao contrário das tecnologias que geralmente requerem fontes de energia e interfaces complexas, o patch de hidrogel desenvolvido aqui fornece uma plataforma independente e visualmente interpretável sem instrumentação externa, tornando-o especialmente atraente para configurações com recursos limitados.

A importância deste trabalho reside em seu potencial translacional. Além da osteomielite, a plataforma CPG pode ser personalizada para outras condições relacionadas à inflamação, como úlceras de pé diabético, infecções de sítio cirúrgico e monitoramento pós-ressecção tumoral. A integração de funcionalidades diagnósticas e terapêuticas em uma única matriz de hidrogel oferece uma oportunidade única para o desenvolvimento de curativos inteligentes de última geração. Além disso, o sistema de cores estruturais baseado em cristal fotônico apresenta oportunidades de biossensoriamento colorimétrico em tempo real aplicável na medicina personalizada. Além disso, a modularidade do projeto CPG permite a adaptação para integração futura com células-tronco, exossomos ou vetores de entrega de genes para estender ainda mais suas capacidades regenerativas, alinhando-se com as trajetórias atuais na medicina regenerativa de precisão.

Olhando para o futuro, a pesquisa futura deve se concentrar em várias áreas-chave. Primeiro, otimizar a composição e a estrutura dos adesivos de hidrogel CPG será crucial para melhorar sua estabilidade e desempenho a longo prazo. Modificar a densidade de reticulação e incorporar outros agentes bioativos, como fatores de crescimento ou citocinas, pode melhorar o potencial terapêutico do hidrogel para aplicações clínicas específicas. Em segundo lugar, expandir a gama de aplicações desses hidrogéis além de feridas crônicas para outros tipos de regeneração de tecidos, como reparo de nervos ou cartilagens, pode demonstrar ainda mais sua versatilidade. Pesquisas sobre como os hidrogéis CPG podem ser adaptados a tipos específicos de feridas, como úlceras diabéticas ou úlceras de pressão, são necessárias para expandir sua aplicabilidade clínica. Em terceiro lugar, a integração de terapias avançadas, como terapia com células-tronco ou terapia genética, com adesivos de hidrogel pode melhorar suas propriedades regenerativas, permitindo tratamentos mais abrangentes e eficazes. Finalmente, ensaios clínicos multicêntricos em larga escala e estudos de aplicação do mundo real serão necessários para avaliar a segurança, a capacidade de fabricação, a conformidade do usuário e a prontidão regulatória da plataforma CPG, apoiando assim sua eventual tradução clínica.

Em conclusão, os adesivos de hidrogel CPG representam uma plataforma promissora para o tratamento avançado de feridas e regeneração de tecidos. Sua capacidade de monitorar o estresse da ferida, responder a mudanças de temperatura e pH, exibir propriedades antimicrobianas e promover a regeneração de tecidos oferece uma abordagem multifacetada para o tratamento de feridas crônicas. Embora os resultados dos estudos pré-clínicos sejam encorajadores, são necessárias mais otimização e validação clínica para realizar plenamente o potencial desses adesivos de hidrogel em ambientes clínicos. As direções futuras da pesquisa devem incluir melhorias na composição do material, aplicações mais amplas, integração com estratégias terapêuticas avançadas e ensaios clínicos para estabelecer sua eficácia e segurança em humanos.

Neste experimento, utilizamos uma combinação de metil CSMA-PBA como andaime de opala inversa, hidrogel GelMA responsivo à temperatura como enchimento e o carregamos com SA para criar um adesivo de hidrogel colorido estrutural inteligente de diagnóstico e terapêutico integrado CPG. Os resultados experimentais demonstram que este adesivo de hidrogel apresenta excelentes propriedades mecânicas e força adesiva. Pode inibir o crescimento bacteriano, regular significativamente a expressão do fator de crescimento endotelial vascular e diminuir os níveis de fatores inflamatórios, proporcionando assim perspectivas clínicas significativas para o tratamento da OMC. Além disso, é importante ressaltar que, com base na capacidade do CPG de detectar mudanças de temperatura e pH no local da infecção, ele desempenha um papel de monitoramento na recuperação pós-operatória da osteomielite crônica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acrilamida (AM, 99%)	Sigma-Aldrich	Rolamento A8887	Monômero para polimerização de hidrogel
Cloreto de acriloil (AC, 99%)	Produtos químicos TCI	Rolamento A0376	Usado em reações de modificação química
Alumina alcalina (200-300 mesh)	Aladdin	A112336	Usado para purificar metacrilato de metila
Anticorpo anti-bFGF	Santa Cruz	SC-9084	Coloração por imunofluorescência para detecção do fator de crescimento
Anticorpo anti-CD31	Abcam	AB28364	Imuno-histoquímica para detecção de marcadores vasculares
Anticorpo anti-EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Coloração imuno-histoquímica
Anticorpo anti-VEGF	Santa Cruz	SC-7269	Coloração por imunofluorescência para angiogênese
A bisacrilamida (BIS, 97%)	Sigma-Aldrich	M7279	Agente de reticulação na rede de hidrogel
Kit de contagem de células-8 (CCK-8)	Dojindo	CK04	Avaliação da viabilidade celular
Quitosana, metilacrilada, (CSMA-PBA)	Sigma-Aldrich	C3641	Formação de andaimes em manchas de hidrogel
Sonda DCFH-DA	Beyotime	S0033	Detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS)
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Corporação Nacional do Grupo Farmacêutico da China	DMSO-AR	Solvente para formulação de hidrogel
Escherichia coli (E. coli)	ATCC	-	Usado em testes antibacterianos
Microscópio de fluorescência	Olimpo	BX53	Imunofluorescência e imagem celular
Metacrilato de gelatina (GelMA)	Sigma-Aldrich	G1894	Componente de hidrogel responsivo à temperatura
Ácido clorídrico (HCl)	Chongqing Tianyun	HCl-AR	Ajuste de pH na síntese
Peróxido de hidrogénio (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009	Induz estresse oxidativo nas células
Ácido fluorídrico (HF, 4%)	Sinopharm	H814912	Gravura a água-forte cristais coloidais do silicone
Máquina de teste de tração universal Instron	Instron	3345	Testes de resistência mecânica e adesiva
Células L929	ATCC	CCL-1	Usado para ensaios de citotoxicidade e biocompatibilidade
Micrótomo Leica	Leica	RM2235	Usado para seccionamento de tecidos com parafina
Ratos Sprague-Dawley machos (8 semanas)	Biotecnologia Reagan	-	Modelo de osteomielite crônica in vivo
Masson ' s Kit de Mancha Tricrômica	Solarbio	G1340	Coloração histológica para fibrose
Metacrilato de metila (MMA, 99%)	Sigma-Aldrich	M27805	Monômero para formação de andaimes
Kit de ensaio MTT	Beyotime	M5655	Avaliação da proliferação celular e citotoxicidade
Paraformaldeído (4%)	Biografia do serviço	G1101	Fixação tecidual
Parafina	Sigma-Aldrich	Pág. 1003	Meio de incorporação para histologia
PBS Buffer	Gibco	10010023	Usado no processamento de células e hidrogel
Fenilalanina (99%)	Sigma-Aldrich	Pág. 5482	Usado na modificação química
Ácido fenilborônico (PBA)	Produtos químicos TCI	Pág. 0157	Componente sensível ao pH em hidrogel
Persulfato de potássio (KPS)	Pequim Baolingwei	KPS-AR	Iniciador de radicais na polimerização
Kit de reagentes PrimeScript RT	Takara	RR047A	Usado para síntese de cDNA
Kit de ensaio de espécies reativas de oxigênio (ROS)	KeyGen Biotech	KGAF019	Avaliação da atividade antioxidante
Sistema de PCR em tempo real	Biossistemas Aplicados	Passo OnePlus	Quantificação da expressão gênica
RNAiso Plus	Takara	9108	Reagente para extração de RNA
Reômetro (HR-1)	Instrumentos TA	HR-1	Caracterização reológica do hidrogel
Ácido Salicílico (SA)	Sigma-Aldrich	S3254	Molécula de medicamento em hidrogel
Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM)	JEOL	JSM-7500F	Análise morfológica da estrutura do hidrogel
Nanopartículas de sílica (12 nm)	Sigma-Aldrich	637246	Formação de moldes de cristal coloidal de sílica
Hidróxido de sódio (NaOH)	Corporação Nacional do Grupo Farmacêutico da China	NaOH-AR	Ajuste de pH
Staphylococcus aureus (S. aureus)	ATCC	-	Usado em testes antibacterianos
SYBR Green PCR Master Mix	Biossistemas Aplicados	4367659	reagente de detecção de qPCR
Fonte de luz UV (365 nm, 3 mW / cm²)	Herolab	UVT-28	Usado para polimerização UV
Espectrofotômetro UV	Shimadzu	UV-2600	Medição da liberação de medicamentos