Artigo de método

Um método minimamente invasivo para gerar um modelo ortotópico singênico de câncer de pulmão em camundongos

DOI:

10.3791/68676

⸱

19 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um grande desafio do desenvolvimento de novas terapias para o câncer de pulmão inclui a modelagem do microambiente tumoral à medida que a doença regional progride para a doença metastática. Aqui, descrevemos um método simples de estabelecer um modelo singênico ortotópico de câncer de pulmão que permite o rastreamento in vivo da doença ao longo do tempo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) continua a ser a causa número um de morte relacionada ao câncer para mulheres e homens em todo o mundo. Mais informações precisam ser coletadas para entender as interações entre as células cancerígenas, o sistema imunológico, o microambiente dentro de cada tumor e o tecido hospedeiro para desenvolver modalidades de tratamento mais eficazes. Relatado aqui é um método simples e repetível para induzir câncer no pulmão de camundongo, permitindo o monitoramento do crescimento do tumor desde o estágio inicial até o estágio final da doença. O procedimento cirúrgico envolve uma pequena incisão superficial na pele e uma injeção de células cancerígenas através dos músculos intercostais no pulmão. Os sistemas de imagem in vivo (IVIS) em combinação com células projetadas para expressar luciferase fornecem uma maneira conveniente de avaliar o crescimento do tumor e a progressão da doença ao longo de um estudo. Essa técnica é facilmente transferível entre vários modelos de câncer de pulmão e pode ser usada para testar a viabilidade e a eficácia de novas terapias em um modelo pré-clínico de câncer de pulmão que imita o microambiente natural do tumor. Isso amplia a relevância dos estudos de eficácia e segurança/toxicidade usando tratamentos padrão, incluindo ressecção cirúrgica, radiação e imunoterapias em conjunto com terapêuticas experimentais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O câncer de pulmão continua sendo um dos cânceres mais diagnosticados e a causa número um de morte relacionada ao câncer entre homens e mulheres em todo o mundo 1,2,3. O câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por quase 90% de todos os casos de câncer de pulmão nos Estados Unidos e, embora o cenário do tratamento tenha melhorado muito nos últimos anos, continua a haver muito interesse no desenvolvimento de novas terapias que melhorem os resultados4. Embora tenha havido muitos avanços no desenvolvimento de terapias direcionadas para mutações específicas e imunoterapias para subtipos de NSCLC responsivos, a taxa de sobrevida global de cinco anos continua baixa, situando-se em torno de 20% para todos os estágios do câncer de pulmão 2,5,6,7. Além disso, embora a imunoterapia tenha feito grandes avanços na melhoria da sobrevida na doença avançada, essas melhorias apenas mudaram a agulha de uma sobrevida global de cinco anos de 6,8% para 10,7% e aumentaram o tempo de sobrevida de 7 meses para 8 meses8. Ainda há uma grande necessidade de entender os mecanismos de ação da doença e desenvolver novas terapias que sinergizem com as terapias padrão atuais. Compreender os mecanismos em jogo da progressão natural do NSCLC e a resposta a novas terapias requer modelos pré-clínicos que sejam reprodutíveis de forma confiável, fáceis de induzir e encapsulem o microambiente tumoral no qual o câncer se desenvolve.

Nas últimas décadas, muitos procedimentos diferentes foram desenvolvidos para avaliar modelos ortotópicos de câncer de pulmão em roedores. Os procedimentos variam de muito invasivos, exigindo alto nível de especialização, como implante intrapulmonar ou transplante que abre a cavidade torácica9,10,11,12,13; moderadamente invasivos, como procedimentos intratraqueais e orotraqueais 14,15,16,17; a procedimentos minimamente invasivos, como injeções percutâneas, veia da cauda ou indução intranasal 18,19,20,21. Todos os procedimentos oferecem diferentes riscos e benefícios - com técnicas mais invasivas permitindo mais precisão, mas taxas de atrito potencialmente mais altas, e técnicas menos invasivas que proporcionam melhor sobrevida, mas mais variabilidade dos locais de implantação do tumor. Desses vários protocolos, alguns optam por não rastrear o crescimento tumoral in vivo e apenas avaliações completas de tumores ex vivo 9,11,12,16. Dos protocolos que rastreiam o crescimento do tumor ao longo do tempo, os protocolos anteriores dependem mais de sistemas como tomografia computadorizada (TC)14,19, tomografia por emissão de posição (PET)18 e ressonância magnética (MRI)17, enquanto os protocolos posteriores, depois que os sistemas de imagem de bioluminescência (BLI) e as células geneticamente modificadas se tornaram mais prontamente disponíveis, optam por rastrear o crescimento do tumor ao longo do tempo com o BLI 20, 21.

O objetivo de desenvolver este protocolo foi aproveitar os aprendizados desses outros procedimentos e criar um método simples, mas confiável, de induzir um tumor de pulmão solitário para estudar a progressão do NSCLC a partir do início da doença, onde o tumor está confinado ao pulmão. O objetivo geral deste artigo é descrever os métodos para gerar um modelo de camundongo ortotópico singênico confiável e minimamente invasivo de câncer de pulmão que pode ser monitorado usando imagens in vivo e pode permitir que os pesquisadores estudem o câncer de pulmão no órgão do qual a doença surge. Este método é eficaz para gerar modelos de camundongos ortotópicos de xenoenxerto usando linhagens de células de câncer de pulmão humano e modelos de camundongos ortotópicos singênicos usando linhagens de células de câncer de pulmão de camundongo em camundongos com sistema imunológico intacto, dando versatilidade ao método para estudar os tipos de câncer humano e a complexa interação do sistema imunológico e NSCLC.

Nós nos concentramos em otimizar este protocolo no modelo de camundongo NSCLC imunocompetente, Lewis Lung Carcinoma (LLC), pois este modelo permite que os pesquisadores entendam melhor a resposta do sistema imunológico com e sem terapias atuais, como quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e outras terapias direcionadas 22,23,24,25. O protocolo gera um modelo que é representativo da doença em estágio inicial na inoculação (tumor no parênquima pulmonar) e metástase no final dos estudos, pois o tumor geralmente supera o parênquima pulmonar e semeia outros tecidos.

Um aspecto importante do estudo de modelos ortotópicos é a capacidade de rastrear o crescimento do tumor repetidamente, com estresse mínimo para o animal e rapidamente, para que cada animal em um estudo possa ser avaliado em um único momento. Embora as técnicas de imagem como ressonância magnética ou tomografia computadorizada permitam uma resolução aprimorada do tumor, essas modalidades de imagem são caras, demoradas e têm dificuldade em rastrear o crescimento inicial do tumor em modelos de pequenos animais, como camundongos 26,27,28,29,30,31. Portanto, optamos por monitorar o crescimento do tumor por meio da bioluminescência usando células cancerígenas modificadas com luciferase. Neste protocolo, injetamos 25.000-50.000 células LLC projetadas com luciferase de vaga-lume (LLC-luc) e detectamos tumores logo no dia seguinte por BLI. A reação luciferina-luciferase é uma ferramenta útil para rastrear o crescimento tumoral in vivo usando instrumentos de imagem espectral. Devido à sensibilidade desses sistemas de imagem para rastrear fótons de luz, as células cancerígenas que expressam luciferase podem ser rastreadas in vivo precocemente, muitas vezes antes que os tumores possam ser detectados em um modelo de camundongo por ressonância magnética ou tomografia computadorizada, e frequentemente 26,32,33,34.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos envolvendo animais são revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa (IACUC). Camundongos C57BL6 / N (4-6 semanas de idade) são comprados e aclimatados por pelo menos 1 semana antes das cirurgias. Todos os animais estão em um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais são alojados 4 por gaiola e têm acesso total a comida e água até o momento da anestesia.

1. Seleção e crescimento de células injetáveis

  1. Efectuar um ensaio de luciferase para seleccionar uma linhagem celular, conforme descrito noponto 35.
    1. Cultive células LLC-luc no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), L-glutamina e penicilina/estreptomicina em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C com alta umidade. Realize o ensaio quando as células estiverem 50% -100% confluentes.
    2. Antes de realizar o ensaio, lave as células com 1x PBS.
    3. Adicione 200 μL de tampão de lise/poço (25 mM de Tris/fosfato, 4 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol) em uma placa de 6 poços. Raspe as células do poço e transfira para um tubo de microcentrífuga. Gire as células a 16.000 × g por 5 min em temperatura ambiente. Confirme se um pellet de célula compacta se forma no fundo do tubo e colete o sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga.
    4. Transfira metade do extrato celular para um novo tubo de microcentrífuga e guarde para quantificação de proteínas. Adicione 2 mM de ditiotreitol à metade restante e misture bem.
    5. Combine 8 μL de extrato celular contendo 2 mM de ditiotreitol com 42 μL de tampão de ensaio (25 mM de Tris/fosfato, 20 mM de MgSO4, 4 mM de EGTA, 2 mM de ATP, 1 mM de ditiotreitol). Adicione 50 μL de luciferina 0,5-1 mM.
    6. Meça o pico de luminescência relatado como unidades de luz relativa (RLU) e avalie o conteúdo de proteína por um método de quantificação de proteína preferido para relatar a luminescência como RLU por mg de proteína (RLU / mg).
  2. Selecione uma linha celular com luminescência entre 8.000-15.000 RLU/mg.
    NOTA: Evite a seleção de uma expressão de luciferase mais alta (>15.000 RLU/mg), pois isso pode saturar o instrumento BLI.

2. Preparação celular

  1. Cultive células LLC-luc em DMEM suplementadas com 10% de FBS, L-glutamina e penicilina/estreptomicina em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C com alta umidade por pelo menos 1 semana antes do uso.
    NOTA: Monitore o crescimento para limitar a confluência a 70% -80% e divida usando 0,25% de tripsina-EDTA conforme necessário para atingir a quantidade desejada para injeções, conforme descrito anteriormente36.

3. Preparação pré-cirúrgica

  1. Para camundongos com pelo, faça a barba 1 dia antes da cirurgia.
  2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução para anestesiar com isoflurano. Defina a taxa de fluxo de oxigênio para 2.0 L/min e vaporizador a 2% de isoflurano; Ajuste isso com base no tamanho do mouse que está sendo induzido.
  3. Monitore a respiração dos camundongos e empregue um reflexo de retirada do pedal para confirmar a anestesia apropriada.
  4. Coloque o mouse em um cone de nariz na posição de bruços em um dispositivo de aquecimento aprovado pela IACUC. Verifique se o mouse está devidamente anestesiado usando o reflexo de retirada do pedal antes de continuar.
  5. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos.
  6. Quando o mouse estiver devidamente anestesiado, use uma tesoura elétrica para remover uma grande área retangular (2 cm x 3 cm) na porção dorsal esquerda do mouse. Faça a barba na coluna medialmente, a mesa lateralmente até que nenhum pelo seja visível, a última costela (13ª) inferiormente e a borda superior da escápula em direção à cabeça.
  7. Coloque o mouse em uma gaiola vazia em um dispositivo de aquecimento aprovado pela IACUC e observe a respiração do mouse até que ele esteja acordado e alerta. Neste momento, retorne o mouse à sua gaiola de origem até a cirurgia.

4. Preparação da suspensão celular para injeção

  1. No dia da colheita de células (etapa 2.2), adicione meio fresco com 50 mg / mL de gentamicina 3-4 h antes da coleta para remover as células mortas e destacadas.
  2. Aspire o meio e lave as células com 1x PBS. Adicione tripsina-EDTA e incube por 1-2 min a 37 °C.
  3. Disperse as células e adicione meios para neutralizar a tripsina. Colete as células em um tubo cônico de 50 mL.
  4. Gire a 1.200 × g por 3 min em temperatura ambiente. Confirme se um pellet de célula compacta se forma no fundo do tubo, aspire o sobrenadante e lave o pellet com 1x PBS. Repita esta etapa 3x.
  5. Ressuspenda o pellet celular em 1x PBS a aproximadamente 1-2 milhões de células/mL para contagem. Filtre através de um filtro de células de 40 μm antes da contagem.
  6. Combine 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e conte usando um hemocitômetro. Faça uma suspensão de célula 2x e conte ambas para verificar a contagem de células. Calcule a contagem total de células e a viabilidade.
  7. Gire as células a 1.200 × g por 3 min em temperatura ambiente para ressuspensão no volume final de injeção. Aspire o PBS.
  8. Ressuspenda as células em 0,5 mg / mL de Matrigel em 1x PBS até o número de células desejado por injeção em um volume de 50 μL. Mantenha a suspensão celular final no gelo durante todo o procedimento para evitar a solidificação.
    NOTA: Este protocolo usa células LLC-luc. Injete a 25.000-50.000 células em 50 μL de volume por camundongo.

5. Preparação cirúrgica

  1. Realize o procedimento em uma sala cirúrgica aprovada pela IACUC para procedimentos assépticos. Limpe a mesa cirúrgica com um desinfetante aprovado para veterinários.
  2. Coloque uma almofada de aquecimento desinfetada aprovada pela IACUC na área cirúrgica. Coloque uma cortina cirúrgica estéril sobre a almofada de aquecimento.

6. Anestesia cirúrgica

  1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução para anestesiar com isoflurano. Defina a taxa de fluxo de oxigênio em 2,0 L/min e o vaporizador em 2% de isoflurano.
    NOTA: A concentração de isoflurano pode ser ajustada com base no tamanho do mouse.
  2. Monitore a respiração do mouse e empregue um reflexo de retirada do pedal para confirmar a anestesia apropriada.
  3. Coloque o mouse em um cone de nariz na posição reclinada lateral direita na cortina cirúrgica estéril. Verifique se o mouse está devidamente anestesiado usando o reflexo de retirada do pedal antes de continuar.
  4. Administre analgésico pré-operatório, meloxicam (2 mg/kg de peso) por via subcutânea e pomada oftálmica em ambos os olhos.

7. Injeção pulmonar ortotópica

  1. Limpe o local da cirurgia 3x alternando entre etanol 70% e betadina usando gaze estéril. Coloque um campo cirúrgico fenestrado esterilizado com uma abertura de 3 cm x 4 cm no mouse. Coloque os instrumentos esterilizados autoclavados no campo cirúrgico.
  2. Determine onde fazer a incisão localizando a borda cranial da escápula e a borda caudal da caixa torácica usando uma pinça. Certifique-se de que a pele esteja esticada usando o polegar e o indicador do cirurgião e faça uma incisão superficial de 5 mm apenas na pele diretamente abaixo da escápula com uma lâmina tamanho 10.
    NOTA: O cirurgião deve usar luvas estéreis.
  3. Use uma tesoura reta de 115 mm para dissecar sem corte a gordura subcutânea das costelas e músculos intercostais. Não corte os músculos intercostais.
    NOTA: Tenha cuidado para não danificar a artéria toracodorsal e o ramo profundo da artéria cervical transversa, que estão localizados perto da escápula. Pode ocorrer sangramento leve devido ao corte dos capilares na pele e na gordura subcutânea. Pare o sangramento aplicando uma leve pressão com um aplicador esterilizado com ponta de algodão.
  4. Use uma pinça Micro-Adson para manter a incisão aberta. Começando pela sétima costela verdadeira, use uma pinça curva de ponta média para contar para cima para identificar as costelas quatro e cinco. Observe esta área para injeção.
  5. Misture a suspensão celular invertendo suavemente 3-4x. Imediatamente antes da injeção, use uma seringa estéril de insulina de 300 μL 31 G 8 mm para extrair 50 μL da suspensão celular e certifique-se de que não haja bolhas.
  6. Adicione uma tira de fita metálica esterilizada de 4 mm de espessura à agulha, nivelada com a seringa, para funcionar como rolha. Isso garante que a agulha penetre apenas 4 mm de profundidade no pulmão.
  7. Injetar a suspensão celular de 50 μL diretamente abaixo da quarta costela no espaço intercostal entre a costela quatro e cinco em um ângulo de 90° perpendicular ao pulmão. Depois de injetar a suspensão celular, segure a agulha no lugar por 2-3 s para permitir que o Matrigel endureça e evite que as células saiam do local da injeção.
  8. Remova lentamente a agulha no mesmo ângulo e descarte em um recipiente para objetos cortantes.
  9. Suture a pele usando 2-3 pontos, fechando com nós quadrados, e adicione adesivo cirúrgico veterinário para garantir que a ferida esteja suficientemente fechada.

8. Procedimentos pós-cirúrgicos

  1. Coloque o mouse em uma gaiola vazia em um dispositivo de aquecimento aprovado pela IACUC. Monitore o mouse até que ele esteja totalmente recuperado da anestesia, o que deve levar de 1 a 2 minutos.
  2. Quando o mouse estiver alerta e em movimento, coloque-o em uma gaiola com roupa de cama limpa. Observe o mouse frequentemente nas primeiras 24 horas em busca de sinais de dor ou infecção.
  3. Administre analgésico AINE, meloxicam (2 mg/kg de peso), por injeção subcutânea por 2 dias após a cirurgia.

9. Monitoramento do crescimento do tumor por BLI in vivo

  1. Monitore o crescimento do tumor no pulmão usando o BLI já no dia seguinte à cirurgia e até uma vez por dia.
  2. Realize imagens in vivo usando um sistema de imagem in vivo (IVIS).
    1. Fazer luciferina a 15 mg/mL em 1x PBS sem magnésio ou cálcio. Para um camundongo de 20 g, isso equivale a injetar 200 μL da solução de luciferina de 15 mg / mL.
      NOTA: Proteja a solução de luciferina preparada da luz, cobrindo com papel alumínio quando não estiver em uso, pois é sensível à luz.
    2. Abra o software e defina os parâmetros para Imagens Bioluminescentes. Defina o tempo de exposição como automático. Defina o Fator de compartimentalização como 4.
    3. Injete camundongos por via intraperitoneal com 150 mg de luciferina por kg de peso.
    4. Ao obter imagens de um novo modelo de célula cancerosa pela primeira vez, execute uma curva cinética para identificar o tempo ideal de captação de luciferina, que é indicado por quando a luminescência atinge o pico antes de começar a se estabilizar.
      1. Injete luciferina em camundongos. Aguarde 3 minutos para que a luciferina seja absorvida.
      2. Camundongos de imagem a cada 5-10 minutos por 60 minutos.
        NOTA: O tempo ideal de captação para diferentes linhagens celulares geralmente varia de 5 a 15 minutos.
    5. Para todas as sessões de imagem subsequentes, use o tempo ideal de captação de luciferina. Anestesiar os camundongos em preparação para a imagem durante este tempo. Coloque os camundongos em uma câmara de indução a 2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de 2,0 L / min.
    6. Após a conclusão da captação, tire duas imagens selecionando Adquirir.
      1. Primeira imagem do mouse deitado na posição reclinada lateral direita. Isso permite que a câmera capture o local da injeção, localizado na parte lateral esquerda do mouse. Use essa visualização para quantificar o crescimento do tumor. As imagens capturadas nesta posição serão indicadas a partir daqui como vista lateral esquerda.
      2. Imediatamente após a conclusão da primeira imagem, tire uma segunda imagem do mouse em decúbito dorsal. Isso permite que a câmera capture os fótons emitidos pelo tumor na cavidade torácica a partir da visão ventral. Use esta visão (aqui denotada como a visão ventral) para estimar a localização do câncer dentro da cavidade torácica.
  3. Para analisar as imagens, altere as unidades de Contagens para Radiância.
  4. Abra o Tool Palate. Vá para Ajuste de imagem, selecione Manual. Escolha um mínimo e um máximo para a barra de cores que melhor se adapta às imagens tiradas.
  5. Abra Ferramentas de ROI. Selecione o menu suspenso do círculo para adicionar um círculo de região de interesse (ROI) à imagem. Mova o círculo sobre a incisão para a vista lateral esquerda e sobre o centro do tórax para a vista ventral.
  6. Selecione Medir ROIs.

10. Avaliação dos critérios de inclusão e exclusão

  1. Primeiro, confirme a presença de luminescência tumoral no pulmão observando a imagem da vista lateral esquerda.
  2. Em seguida, confirme a presença de luminescência tumoral na cavidade torácica esquerda na imagem da visão ventral. Em seguida, confirme se há apenas um único local de luminescência na imagem da visão ventral.
  3. Se esses dois critérios (etapas 10.1, 10.2) forem atendidos, avalie os critérios de exclusão, garantindo que a luminescência não cruze a linha média na cavidade torácica na imagem da visão ventral. Se nenhuma luminescência for detectável na imagem da vista lateral esquerda após duas imagens consecutivas do IVIS ao longo de 4 dias após a cirurgia, exclua este camundongo de estudos adicionais, pois as células cancerígenas provavelmente não fizeram.

11. Avaliação de tumores ao final dos estudos

  1. Quando o fluxo total da luminescência do tumor atingir 1 × 108 fótons/s (p/s) ou mais, colha os camundongos para avaliações de endpoint.
  2. Colete o tumor para análise anatômica macroscópica ou histologia, realizando as seguintes etapas para anestesia e perfusão do pulmão, conforme descrito anteriormente37.
    1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução para anestesiar com isoflurano. Defina a taxa de fluxo de oxigênio em 2,0 L/min e o vaporizador em 2% de isoflurano. Monitore a respiração do mouse e empregue um reflexo de retirada do pedal para confirmar a anestesia apropriada.
      NOTA: A concentração de isoflurano pode ser ajustada com base no tamanho do mouse.
    2. Coloque o mouse em um cone de nariz na posição supina. Verifique se o mouse está devidamente anestesiado usando o reflexo de retirada do pedal antes de continuar.
    3. Abra a cavidade torácica do mouse para visualizar os pulmões e o coração atrás do diafragma.
    4. Faça um longo corte vertical inferiormente ao longo da linha média do mouse. Mova os intestinos para visualizar a artéria renal esquerda.
    5. Corte o diafragma para visualizar o coração.
    6. Corte a artéria renal esquerda.
    7. Injete aproximadamente 5-10 mL de 1x PBS através do ventrículo direito do coração a uma taxa de aproximadamente 5 mL / min.
    8. Faça uma incisão ao longo do pescoço. Limpe qualquer gordura subcutânea localizada acima da traqueia. Tenha cuidado para não cortar a traqueia.
    9. Perfure a traqueia paralelamente com uma agulha para injetar formalina a 10% diretamente na traqueia para inflar e fixar os pulmões.
    10. Obtenha os pulmões da cavidade torácica cortando a traqueia acima do ápice do pulmão e corte a pleura e os ligamentos que ligam o pulmão à cavidade torácica.
    11. Coloque 10% de formalina para fixar.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, camundongos C57BL6/N foram injetados de acordo com o protocolo apresentado (Figura 1). Células LLC geneticamente modificadas para expressar luciferase (LLC-luc) foram usadas. Além disso, um camundongo simulado foi injetado com Matrigel sem células cancerígenas. O BLI no IVIS pode ser iniciado 1 dia após a cirurgia. Este estudo LLC-luc foi otimizado no BLI para avaliar o câncer de pulmão em estágio inicial. O sistema BLI usado neste artigo tem u...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo descreve um procedimento otimizado, minimamente invasivo, que permite tempos de recuperação rápidos e monitoramento quase imediato do tumor, o que difere dos métodos mais intensos cirurgicamente descritos anteriormente10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SCH e CSC são fundadores da Geminii, Inc. Os termos deste acordo foram revisados e aprovados pelo Escritório de Conflito de Interesses em Pesquisa da Universidade de Iowa. Todos os outros autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios Carter e Sheffield, Susan Walsh, Bryan Allen e Kranti Mapuskar pelas valiosas discussões. Também gostaríamos de agradecer a Samantha Eckley, veterinária clínica sênior do Escritório de Recursos Animais, por sua orientação e conselhos. Gostaríamos de reconhecer o uso do Sistema de Imagem IVIS Lumina S5 no Small Animal Imaging Core Facility, um recurso central apoiado pelo Departamento de Radiologia da Universidade de Iowa. Ilustrações gráficas de figuras geradas usando Biorender (https://biorender.com). Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Programa de Biologia de Radiação de Radicais Livres NCI T32CA078586 (SCH), Sistema de Imagem IVIS Lumina S5 adquirido em 1S10OD026835.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina-EDTA (1x)Gibco25200-056
Formalina tamponada 10% neutraVWR16004-112
Recipientes Tratados com Cultura de Tecidos de 100 mm x 20 mmDot Scientific Inc.667621
Etanol Puro de 190 ProofLaboratórios de Descontaminação2801
Seringa de insulina 3/10 mL com agulha BD Ultra-Fine 31 g x 5/16 pol.Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
Solução Betadina 10% Povidona-Iodo AntissépticoArvio Health L.P.67618-150-04
Mouses C57BL6/NLaboratórios Charles River
Cell Strainer 40um Nylon Falcão352340
Máquina Anestésica CompactaAnestesia Vetamac  
Base de Aquecimento Infravermelha Distante com ControladorKent Scientific Corporation & nbsp;
Cabo de lâmina cirúrgica convencional, tamanho 3Brad-Parker371030
Pinças Curvas de Ponto Médio de Uso GeralFisherbrand16-100-110
DitiotreitolProdutos de Pesquisa InternacionalD11000
D-Luciferina (sal de sódio)Cayman Chemical14682
Drape, Cirúrgico 18" x 26" Sem Fenestrados, EstérilDealmed783410
Dulbecco' s Eagle Médio Modificado (1x)Gibco11965-092
Dulbecco' s Soro Tamponado com Fosfato (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Soro Fetal BovinoGibcoA5670402
Fonte de luz do Microscópio de Fibra Óptica FL150Meiji 
Solução de Sulfato de GentamicinaIBI ScientificIB02030
GlicerolProdutos de Pesquisa InternacionalG22025
IsofluranoPrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Software de Imagem VivaPerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Use a linha celular cancerígena que melhor atenda às necessidades do estudo 
Sulfato de MagnésioFisher ScientificM63
Matriz de Membrana Baseal MatrigelCorning354234
Suporte para agulhas de maionese, 6", mandíbulas serrilhadasMiltex8-44TC
Micro-Adson ForcepsFerramentas Científicas Finas10018-12
Aparador de Patas N5 com Lâminas DuplasOneisall 
Esponjas de gaze não estéreis, de 12 camadasNDCP157112
Lubrificante Ocular OptixcareAventix5914304
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-122
Sutura de Seda Permanente 6-0 1 x 18"Ethicon K802H
Ácido Fosfórico 85%Fisher ScientificA242
Lâmina de bisturi tamanho 10, aço inoxidável, estérilCincinnati Surgical110
Tubo de tampa de rosca cônico 50 mLSarstedt62.547.100
Tesoura de tecido 4,5" Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
Tintura azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Fita de alumínio utilitária com revestimentoIPGALF150L
Aplicadores de Algodão com Ponta de Haste de MadeiraNDC76200

Referências

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