Artigo de método

Visualização precisa dos receptores de insulina A e B no cérebro murino com um ensaio de hibridização in situ de RNA

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DOI:

10.3791/68677

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15 de julho de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Estabelecemos um ensaio de hibridização in situ Duplex para mapear as isoformas do receptor de insulina IR-A e IR-B no plexo coróide murino, superando as limitações dos métodos tradicionais. Essa abordagem de alta resolução revela a expressão específica da isoforma, oferecendo novos insights sobre a sinalização da insulina cerebral e possíveis terapias direcionadas à isoforma para distúrbios neurológicos.

Resumo

Os receptores de insulina (IRs) são amplamente expressos em todos os tecidos e todos os tipos de células. Ele existe em duas isoformas funcionalmente distintas - IR-A e IR-B - diferindo em 12 aminoácidos devido ao splicing alternativo do éxon 11. Essas isoformas exibem padrões de expressão específicos de tecidos e células, com sua abundância relativa variando ao longo do desenvolvimento, envelhecimento e doença. Devido à sua alta similaridade de sequência, distinguir entre IR-A e IR-B usando métodos imunológicos tradicionais tem sido um desafio. Aqui, descrevemos um novo ensaio de hibridização in situ duplex (ISH) que permite a visualização da expressão de IR-A e IR-B no tecido. Usando essa abordagem, demonstramos pela primeira vez que, embora ambas as isoformas sejam expressas no plexo coróide murino, o IR-A é predominante. Este método fornece uma ferramenta poderosa para investigar a distribuição espacial das isoformas do receptor de insulina in situ em diferentes tecidos. Embora a qPCR em tempo real possa detectar transcritos IR-A e IR-B em culturas monocelulares in vitro , ela não tem a capacidade de localização espacial em tecidos complexos, destacando a necessidade e a utilidade da técnica Duplex ISH.

Introdução

O receptor de insulina (IR) é um receptor enzimático transmembrana de passagem única que medeia os diversos efeitos fisiológicos da insulina. Funciona como uma proteína dimérica, com cada monômero composto por duas cadeias peptídicas ligadas por uma ligação dissulfeto: a subunidade α extracelular, que contém o domínio de ligação ao ligante, e a subunidade β transmembrana, cuja sequência intracelular possui atividade intrínseca de tirosina quinase1. Por meio do splicing alternativo do éxon 11, a transcrição do gene IR dá origem a duas variantes de mRNA IR. IR-A não possui éxon 11, enquanto IR-B o retém. Consequentemente, IR-A e IR-B diferem por uma sequência de 12 aminoácidos perto do terminal C da subunidade α, resultando em ligação distinta de fatores de crescimento além da insulina madura e propriedades de sinalização a jusante variáveis. Embora ambas as variantes exibam afinidade semelhante pela insulina, o IR-A tem uma afinidade maior pelo fator de crescimento semelhante à insulina-II (IGF-II) e pró-insulina em comparação com o IR-B. Os padrões de expressão de IR-A e IR-B variam dependendo do tipo de tecido e célula e do estado da doença2.

Sua expressão diferencial em tecidos e doenças ressalta sua contribuição única para a fisiologia e patologia. O plexo coróide (PC), uma estrutura especializada que produz líquido cefalorraquidiano (LCR) e faz parte da barreira sangue-LCR, desempenha um papel crítico no transporte de nutrientes, eliminação de resíduos e neuroproteção, especialmente durante a inflamação. Ambas as isoformas de IR são expressas no CP, onde provavelmente regulam o volume e a composição do LCR. O IR-A, por meio de sua ligação de alta afinidade pelo IGF-II, provavelmente promove a proliferação celular e o reparo tecidual no epitélio da CP. O IR-B, por outro lado, está implicado no transporte de insulina através da barreira sangue-LCR, apoiando a disponibilidade de insulina no cérebro para astrócitos, neurônios, glia e homeostase da glicose 3,4.

Os níveis de RI pré-diabéticos têm sido associados à elevação da tau no LCR em indivíduos assintomáticos com risco genético para a doença de Alzheimer (DA)5, e alterações na relação IR-A/IR-B têm sido associadas à resistência à insulina, envelhecimento e aumento da atividade proliferativa - fatores que podem contribuir para o câncer e outras patologias6. A identificação de padrões de expressão específicos de isoforma de IR-A e IR-B representa um passo crítico para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para distúrbios complexos do sistema nervoso central. No entanto, as abordagens atuais, como imunocoloração e qPCR, são limitadas: nem todas as proteínas podem ser imunomarcadas de forma confiável devido à falta de anticorpos validados e, embora a qPCR seja altamente específica, ela carece de resolução espacial.

Para superar essas limitações, utilizamos a hibridização in situ Duplex (ISH), uma tecnologia avançada de detecção de RNA baseada na plataforma RNAscope BaseScope. Este ensaio emprega um design exclusivo de sonda Z duplo que requer ligação em tandem ao RNA alvo, permitindo alta especificidade e sensibilidade, mesmo para transcritos de baixa abundância. O sinal fluorescente ou cromogênico é amplificado por meio de vários eventos de ligação à sonda, melhorando a detecção e reduzindo o fundo7. Ao contrário do RNAscope padrão, este ensaio é otimizado para detectar sequências curtas de RNA (50-300 bases), tornando-o particularmente adequado para identificar eventos alternativos de splicing, variantes de nucleotídeo único e transcritos raros em tecidos complexos como o cérebro8.

Este ensaio visualiza alvos simultaneamente como sinais cromogênicos verdes (C1) e vermelhos (C2) distintos sob campo claro. Ele garante o sucesso usando tecidos fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) ou formalina tamponada neutra a 10% (NBF) e seccionados a 5 μm-15 μm (congelado/FFPE), contendo RNA de baixa a alta abundância. Devido à sensibilidade à degradação do RNA, fixação excessiva e erros de sonda, precisamos otimizar o pré-tratamento, o design da sonda e os controles para maximizar a especificidade e minimizar o fundo. Aqui, aplicamos este ensaio Duplex ISH para caracterizar os padrões de expressão de IR-A e IR-B no PC murino, oferecendo novos insights sobre a biologia espacial das isoformas de IR e seus possíveis papéis na saúde e doença do cérebro.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram conduzidos em conformidade com os protocolos aprovados pelo National Institute on Aging (NIA), que é totalmente credenciado pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Os protocolos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Programa de Pesquisa Intramural da NIA (IRP/NIA). Os camundongos foram alojados em uma instalação com temperatura controlada sob um ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso ad libitum à água e ração padrão, a menos que especificado de outra forma. Camundongos machos C57BL / 6J foram obtidos no Laboratório Jackson e usados para experimentos aos 3-4 meses de idade.

1. Preparação fixa de amostras congeladas

  1. Perfunda o camundongo com PFA a 4% recém-preparado em 1x PBS e coloque todo o cérebro em PFA a 4% recém-preparado por 17 a 24 h a 4 ° C.
    NOTA: Tecido colocado em 4% de PFA (10 mL para cada cérebro) por não mais de 24 h.
  2. Mergulhe o tecido em sacarose a 10% (10 mL) em 1x PBS a 4 °C até que o tecido afunde no fundo do recipiente. Em seguida, transfira sequencialmente o tecido para 20% de sacarose e, finalmente, para 30% de sacarose, permitindo que ele afunde a cada passo.
    NOTA: O tempo necessário para o tecido afundar varia de acordo com o tipo e tamanho do tecido. Para o tecido cerebral, leva aproximadamente 18 h.
  3. Congelar o tecido em meios de inclusão OCT e armazenar os blocos de tecido num recipiente hermético a -80 °C.
  4. Corte coronalmente os tecidos cerebrais congelados fixados em formaldeído em fatias de 10 μm e armazene a -80 ° C até o uso.
    NOTA: Monte as seções em lâminas de microscópio carregadas positivamente; Outros tipos de lâminas podem resultar em perda de tecido. Se as lâminas não forem usadas imediatamente, armazene-as a -80 °C por até 3 meses.

2. Pré-tratamento da seção antes do ensaio de detecção duplex

  1. No dia do ensaio, lave as lâminas em 1x PBS por 5 min, movendo suavemente o suporte de lâminas para cima e para baixo para remover qualquer OCT residual.
  2. Asse as lâminas a 60 °C por 30 min.
  3. Pós-fixar as lâminas em PFA a 4% pré-resfriado em 1x PBS por 15 min a 4 °C.
  4. Transfira as lâminas sequencialmente através de uma série de EtOH: 50% de EtOH por 5 min em RT, 70% de EtOH por 5 min em RT, 100% de EtOH por 5 min em RT, 100% de EtOH novamente por 5 min em RT.
  5. Seque as lâminas ao ar por 5 min em RT.
  6. Aplique 2-4 gotas de peróxido de hidrogênio em cada seção e incube por 10 min em RT. Enxágue uma vez com água destilada.
  7. Prepare 700 mL de solução fresca 1x Target Retrieval em um béquer. Cubra com papel alumínio e leve para ferver consistentemente (99–100 °C).
    NOTA: Não ferva por mais de 30 min antes de usar. Enquanto isso, pré-aqueça o forno (consulte a Tabela de Materiais) a 40 °C.
  8. Mergulhe cuidadosamente o rack deslizante na solução de recuperação de alvo em ebulição e incube por 5 min. Mantenha a temperatura entre 98–102 °C e monitore de perto.
    NOTA: O tempo de fervura pode precisar ser ajustado (5–15 min) dependendo do tipo de tecido.
  9. Transfira imediatamente a grelha quente para um prato com água destilada, movendo a grelha para cima e para baixo 3–5x. Repita com água destilada fresca.
  10. Enxágue as lâminas em 100% EtOH fresco, movendo-as para cima e para baixo 3–5x. Lâminas secas ao ar.
  11. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar ao redor de cada seção de tecido 2–3x. Deixe a barreira secar completamente em RT.
  12. Coloque os slides na bandeja de slides em lote. Adicione protease (consulte a Tabela de Materiais) a cada seção, garantindo que o tecido esteja totalmente coberto. Incubar na estufa a 40 °C durante 15 min.
    NOTA: O tempo de incubação da protease pode exigir ajuste dependendo do tipo de tecido e do gene alvo.
  13. Retire a bandeja deslizante do forno e coloque-a em água destilada. Lave suavemente as lâminas movendo-as para cima e para baixo por 2 min, repetindo esta etapa 2x com água destilada fresca.

3. Ensaio de detecção duplex

  1. Sondas
    1. Prepare duas seções adicionais para sondas de controle positivo e negativo.
    2. Selecione as pontas de prova de controle com o mesmo número de pares ZZ que a ponta de prova alvo. Para 1 par ZZ, use um controle positivo e um controle negativo (consulte a Tabela de materiais).
    3. Antes de usar, equilibre as sondas a 40 ° C por 10 min e leve os reagentes AMP1-12 para RT.
  2. Hibridização de sonda
    1. Gire brevemente a sonda C2 e misture na proporção de 1:50 com a sonda C1. Adicione uma mistura de sonda (100–200 μL) suficiente para cobrir totalmente cada seção e incube as lâminas no forno a 40 °C por 2 h. Lave as lâminas por 2 x 2 min em 1x tampão de lavagem em RT.
    2. Aplicação Duplex AMP1 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP1 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 30 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
    3. Aplicação Duplex AMP2 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP2 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 30 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
    4. Aplicação Duplex AMP3 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP3 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
        NOTA: Não exceda 15 min de incubação.
    5. Aplicação Duplex AMP4 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP4 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
    6. Aplicação Duplex AMP5 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP5 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 30 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
    7. Aplicação Duplex AMP6 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP6 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
        NOTA: Quanto ao AMP3, não exceda 15 min de incubação.
    8. Aplicação Duplex AMP7 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP7 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção e incubar em temperatura ambiente por 30 min.
        1. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
          NOTA: Incube com AMP7 em temperatura ambiente (RT) por 30 min.
    9. Aplicação Duplex AMP8 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP8 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção e incubar em temperatura ambiente por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
        NOTA: Incube com incubação AMP8 por 15 min em RT.
    10. Detecção de sinal vermelho (C2)
      1. Gire brevemente o Fast Red-B e misture com Fast Red-A na proporção de 1:60.
      2. Aplique em cada seção (100–200 μL), cubra a bandeja e incube por 10 min em RT no escuro.
      3. Lave 2x em 1x tampão de lavagem.
        NOTA: Use a solução Fast Red misturada dentro de 5 min. Proteger da luz (luz solar ou UV).
    11. Aplicação Duplex AMP9 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP9 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
    12. Aplicação Duplex AMP10 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP10 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Volte ao forno e incube a 40 °C por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
    13. Aplicação Duplex AMP11 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP11 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Incubar em RT por 30 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
        NOTA: Incubar com AMP11 em RT por 30 min.
    14. Aplicação Duplex AMP12 de escopo básico
      1. Remova o excesso de tampão de lavagem das lâminas e adicione AMP12 (100–200 μL) para cobrir totalmente cada seção. Incubar em RT por 15 min.
      2. Lave 2 x 2 min em 1x Wash Buffer.
        NOTA: Não exceda 15 min de incubação.
    15. Detecção de sinal verde (C1)
      1. Gire brevemente o tubo Fast Green-B e misture com Fast Green-A na proporção de 1:50.
      2. Aplique a solução VERDE em cada seção (100–200 μL), cubra a bandeja e incube por 10 min em RT.
      3. Lave por 5 min em 1x Wash Buffer e enxágue brevemente em água destilada.
        NOTA: Use a solução Fast Green misturada dentro de 5 min. Proteja da luz. A proporção verde B para A é de 1:50. Os substratos RED e GREEN são sensíveis ao álcool. Não use nenhum reagente que contenha álcool.

4. Contra-mancha

  1. Mergulhe as lâminas em solução de coloração de hematoxilina a 50% por 1 min em RT até que as seções pareçam roxas.
  2. Enxágue em água da torneira 3–5x movendo para cima e para baixo. Repita com água fresca da torneira até que o fundo clareie
  3. Mergulhe as lâminas em 0,02% de água com amônia para cima e para baixo 3x até que as seções fiquem azuis.
  4. Enxágue novamente em água da torneira 3–5x.

5. Montagem

  1. Lâminas completamente secas em forno seco a 60 °C por ~15 min.
  2. Mergulhe as lâminas em xileno fresco.
    NOTA: Como o meio de montagem é bastante viscoso, um breve mergulho no xileno antes da montagem facilita a distribuição mais suave do meio pela seção de tecido e reduz a formação de bolhas de ar sob a lamínula.
  3. Aplique o meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) na lâmina e na lamínula, evitando bolhas.
  4. Secar as lâminas ao ar por pelo menos 5 min.

6. Avalie as amostras

  1. Visualize as seções sob um microscópio de campo claro padrão com ampliação de 20x ou 40x. (Figura 1).
    NOTA: Os controles positivos devem mostrar pontos pontuados nas células. Controles negativos são aceitáveis se não houver mais de 1 ponto por 20 células com ampliação de 20x.

7. Pontuação (opcional)

  1. Use software de análise de imagem (por exemplo, Halo ou QuPath) para quantificar os pontos de RNA por célula.

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Resultados

O receptor de insulina (IR) é um receptor de tirosina quinase transmembrana composto por duas subunidades α extracelulares e duas subunidades β transmembrana, formando um heterotetrâmero funcional. As subunidades α medeiam a ligação à insulina, enquanto as subunidades β possuem atividade intrínseca de tirosina quinase que inicia a sinalização a jusante. O splicing alternativo de mRNA IR do éxon 11 gera duas isoformas do IR, IR-A e IR-B. Como tal, o IR-B inclui um segmento de 12 aminoácido...

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Discussão

Dentro do cérebro, a expressão dos receptores de insulina (RI) é heterogênea, com altas densidades observadas em regiões como o bulbo olfatório, hipotálamo, hipocampo e plexo coróide10. A caracterização abrangente dos padrões de expressão variante em regiões cerebrais e tipos de células específicos forneceria informações cruciais, permitindo-nos estudar e compreender os papéis específicos da insulina e da sinalização de IGF-II na plasticidade sináptica, aprendizad...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural / Instituto Nacional do Envelhecimento / Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Água de amônioCiência do Microscópio Eletrônico 26754-4A
Kit de reagentes de detecção BaseScope DulplexBiografia ACD323810
BaseScope Dulplex Duplex Sonda de Controle Positivo - Mouse(mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZBiografia ACD700121
Sonda de controle positivo duplex BaseScope-C1-DAPB-1ZZ/C2-DAPB-1ZZBiografia ACD700141
Hematoxilina I de GillSigma-AldrichGHS132-1L
Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenRolamento A32731
HybEZ OVEN, bandeja, rack e bandeja de lavagemBiografia ACD321721, 310012, 321716, 321717
Caneta de barreira hidrofóbica ImmEdgeLaboratório de vetoresH-4000
Sondas isoforma A e B INSR: BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2Biografia ACD717411, 717421-C2
Anticorpo do receptor de insulinaSinalização Celular 23413
RNAscope 10x Retrival de AlvoBiografia ACD322000
RNAscope Peróxido de hidrogênio, Protease PlusBiografia ACD322381
Citrato de sódio salino (SSC) 20xFisher CientíficoBP1325-1
Chinelos SuperFrost PlusFisher Científico12-550-18
Meio de montagem permanente VectaMountLaboratório de vetoresH-5000

Referências

  1. Häring, H. U. The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance. Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).
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  6. Belfiore, A., et al. Insulin receptor isoforms in physiology and disease: an updated view. Endocr Rev. 38 (5), 379-431 (2017).
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  8. BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. https://acdbio.com/basescope-duplex-assay (2025).
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