A neurofibromatose tipo 1 (NF1) leva a tumores benignos da bainha do nervo periférico (neurofibromas) que requerem um microambiente nervoso específico para o crescimento. Um modelo de xenoenxerto ortotópico otimizado foi desenvolvido, usando injeção intraneural de células humanas de Schwann em camundongos NSG. Este modelo recapitula neurofibromas humanos e fornece uma plataforma valiosa para avaliar estratégias terapêuticas.
Artigo de método
Um Xenoenxerto Ortotópico do Nervo Ciático para Neurofibromatose Tipo 1
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A neurofibromatose tipo 1 (NF1) é um distúrbio genético causado por variantes patogênicas no gene NF1 , levando à perda da função da neurofibromina e ao desenvolvimento de tumores benignos da bainha do nervo periférico conhecidos como neurofibromas. Embora os modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) tenham avançado nossa compreensão da fisiopatologia da NF1, eles muitas vezes não conseguem replicar a tumorigênese espontânea e a complexidade microambiental dos neurofibromas derivados do paciente. Um dos principais desafios na modelagem de neurofibromas benignos é sua dependência do microambiente nervoso, que as abordagens convencionais de xenoenxerto não recapitulam. Aqui, um modelo de xenoenxerto ortotópico otimizado foi desenvolvido para neurofibromas associados à NF1. Usando injeção intraneural de células humanas de Schwann derivadas de neurofibroma imortalizadas no nervo ciático de camundongos imunodeficientes NSG, este modelo recapitula as principais características da biologia do neurofibroma humano, incluindo crescimento dependente do nervo e interações do microambiente tumoral. Este protocolo permite o monitoramento dinâmico e em tempo real da progressão do tumor por meio de imagens de bioluminescência, fornecendo um método reprodutível e quantitativo para avaliar o crescimento do neurofibroma. Ao contrário dos GEMMs, este modelo permite a iniciação controlada do tumor e a avaliação precisa das estratégias terapêuticas pré-clínicas. Além disso, serve como uma ponte entre os GEMMs e os modelos de xenoenxerto derivados de pacientes, aumentando a relevância translacional da pesquisa do neurofibroma. Ao oferecer um cenário fisiologicamente relevante para o estudo das interações tumor-nervo, este modelo fornece uma plataforma valiosa para investigar a biologia do neurofibroma e avaliar possíveis intervenções terapêuticas. Refinamentos futuros, incluindo a integração de componentes imunológicos ou técnicas avançadas de imagem, podem melhorar ainda mais sua aplicação à pesquisa de NF1.
Introdução
A neurofibromatose tipo 1 (NF1) é um distúrbio genético causado por variantes patogênicas no gene NF1 , levando à perda de função da neurofibromina, um supressor tumoral chave que regula negativamente a via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno RAS (MAPK)1. A NF1 é uma síndrome de predisposição tumoral2 com grandes manifestações clínicas envolvendo o sistema nervoso, a pele e o sistema esquelético, afetando principalmente os tecidos derivados da crista neural. Uma marca registrada da NF1 é o desenvolvimento de tumores benignos de nervos periféricos conhecidos como neurofibromas. Esses tumores são compostos principalmente de células de Schwann que abrigam inativação bialélica de NF1 (NF1-/-)3, juntamente com outros elementos estromais, incluindo fibroblastos NF1+/- , células perineurais, células imunes e componentes da matriz extracelular4.
Modelos animais são essenciais para a compreensão da fisiopatologia do neurofibroma e para o teste de estratégias terapêuticas. Camundongos homozigotos para uma mutação Nf1 knockout (KO) (Nf1-/-) morreram no útero; Os camundongos Nf1+/− são viáveis, férteis e propensos ao câncer, como suas contrapartes humanas5. No entanto, esses animais não desenvolvem características marcantes da doença NF1 humana: os camundongos Nf1+/− não manifestaram anormalidades de pigmentação nem neurofibromas. Uma grande variedade de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) foi estabelecida na última década para modelar independentemente alguns dos sintomas, por meio de abordagens condicionais de KO. Alguns GEMMs foram desenvolvidos para induzir a formação de neurofibroma por meio da inativação condicional de Nf1 em precursores de células de Schwann 6,7,8.
Embora esses GEMMs tenham avançado significativamente nossa compreensão da NF19, sua complexidade fenotípica e heterogeneidade requerem modelos de camundongos alternativos e complementares para ensaios terapêuticos. Os xenoenxertos ortotópicos fornecem uma alternativa valiosa, permitindo que as células humanas sejam implantadas diretamente em seu nicho anatômico nativo, oferecendo assim um modelo fisiologicamente mais relevante. No entanto, a maioria dos estudos baseados em xenoenxerto tem se concentrado em tumores malignos da bainha do nervo periférico (MPNSTs)10, provavelmente porque os neurofibromas não se enxertam ectopicamente, deixando uma lacuna na modelagem de tumores benignos.
Este estudo descreve um novo modelo ortotópico de neurofibroma NF1, baseado na injeção intraneural de células Schwann humanas derivadas de neurofibroma imortalizadas (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 linha celular) no nervo ciático de camundongos imunodeficientes NOD SCID gama (NSG). Essa abordagem aproveita ao máximo o microambiente nervoso nativo, permitindo a formação de tumores benignos, ao mesmo tempo em que permite o monitoramento dinâmico por meio de imagens de bioluminescência (BLI).
Este protocolo visa: (1) Estabelecer um modelo de neurofibroma ortotópico reprodutível para NF1, (2) Fornecer uma plataforma pré-clínica robusta para estudar as interações tumor-nervo e avaliar novas terapias e (3) Preencher a lacuna entre os GEMMs11,12 e os xenoenxertos derivados do paciente (PDX)13, oferecendo um sistema experimental intermediário e controlado. Este modelo permite o desenvolvimento rápido e econômico do tumor - normalmente dentro de 5 dias após a injeção - sem exigir a geração de linhagens de camundongos transgênicos, combinando assim a acessibilidade dos xenoenxertos com a relevância anatômica da colocação ortotópica.
Este modelo de camundongo de xenoenxerto tumoral derivado de linhagem celular ortotópica de neurofibroma (CDX) oferece várias vantagens sobre métodos alternativos. Ao contrário dos GEMMs, que dependem de predisposições genéticas para conduzir a tumorigênese, esse modelo permite o controle direto sobre a iniciação e progressão do tumor.
O protocolo de enxerto ortotópico de tumores malignos da bainha do nervo periférico (MPNSTs)10 foi adaptado aos modelos de neurofibromas benignos. Isso representa um passo significativo na pesquisa translacional da NF1, com aplicações potenciais na identificação de novos alvos terapêuticos e no teste de estratégias de tratamento inovadoras.
Protocolo
Todos os procedimentos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (Autorização #50186 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais e foram conduzidos por pessoal treinado seguindo as diretrizes éticas para pesquisa animal. Camundongos gama NOD SCID (NSG) (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) foram selecionados para este estudo devido à sua imunodeficiência grave, o que permite o enxerto de células humanas bem-sucedido. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Modelo animal e preparação da linha celular
- Realize a depilação no local da cirurgia usando um barbeador elétrico um dia antes do enxerto para agilizar o procedimento para grandes coortes de camundongos NSG.
- Para evitar o comprometimento bilateral dos membros posteriores, injete apenas um nervo ciático (lado esquerdo) por camundongo em todos os experimentos. Monitore os ratos em busca de sinais de angústia, perda de peso e déficits motores.
- Após o procedimento, permita que os ratos se recuperem totalmente em uma almofada de aquecimento em uma gaiola sem cama para evitar a inalação acidental de material de cama. Quando os ratos estiverem totalmente móveis e não mostrarem sinais de torpor, reintroduza-os na instalação animal.
- Para xenoenxerto, use a linhagem celular NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78), uma linhagem celular humana de Schwann imortalizada por hTERT derivada de um paciente com NF114. Essas células foram transduzidas de forma estável com uma construção de CMV-luciferase, pLenti CMV Puro LUC (w168-1), permitindo o rastreamento longitudinal via BLI usando um sistema comercial de ensaio de luciferase.
- Manter as células em DMEM suplementadas com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C com 5% de CO2. Expanda as células para 80% de confluência para manter as condições ideais de crescimento.
- No dia da enxertia, tripsinizar as células (≤4 min a 37 °C); conte e ressuspenda-os a 5 × 103 células em 4 μL por camundongo.
2. Procedimento cirúrgico para xenoenxerto ortotópico
- Preparação pré-cirúrgica
- Prepare a estação cirúrgica antes da indução da anestesia, desinfetando completamente a área de trabalho. Cubra todas as superfícies de contato do microscópio cirúrgico e do sistema de iluminação com filme transparente estéril e certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos tenham sido previamente esterilizados em autoclavagem.
- Pré-trate os camundongos com analgesia pré-operatória com buprenorfina subcutânea (0,1 mg / kg) 30 minutos antes da cirurgia para garantir analgesia inicial adequada.
- Induzir e manter a anestesia por meio de injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg), preparadas na hora em solução salina estéril e ajustadas com base no peso corporal (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme a profundidade da anestesia por um reflexo de pinça do dedo do pé antes de prosseguir.
- Mantenha a temperatura corporal usando uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento, incluindo anestesia, enxerto e recuperação.
- Aplique gotas lubrificantes nos olhos para evitar a dessecação da córnea.
- Procedimento de injeção
- Coloque o mouse do lado direito, com as patas traseiras suavemente afastadas. Cubra a área cirúrgica com um campo estéril antes de iniciar a incisão.
- Prepare um campo cirúrgico estéril usando iodopovidona.
- Incisão e dissecção: faça uma pequena incisão na pele (~5 mm) paralela ao fêmur usando uma tesoura fina. Separe cuidadosamente o músculo subjacente para expor o nervo ciático: use uma pinça fina e uma microtesoura para separar suavemente as camadas musculares, tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos. Identifique o nervo ciático como uma estrutura branca, semelhante a um cordão, localizada medial ao fêmur.
- Armazene a suspensão celular em um tubo de 1,5 mL e agite suavemente para ressuspender as células sedimentadas. Carregue 4 μL da suspensão celular em uma seringa Hamilton de 10 μL com uma agulha de 33 G (que foi escolhida para minimizar o trauma nervoso, mantendo a alta viabilidade celular).
- Insira a agulha paralela ao eixo do nervo ciático (para evitar perfuração) a uma profundidade de ~2 mm. Comece a injetar lentamente para criar pressão e um espaço entre o nervo e a bainha periférica. Avance lentamente a agulha por mais 4 a 5 mm. Em seguida, injete lentamente a suspensão enquanto retira a agulha do nervo. Evite qualquer tensão ou movimento do nervo.
- Realize o procedimento sem esticar o nervo ciático para evitar qualquer dano e não use pinças. Aguarde 10-15 s antes de retirar lentamente a agulha para minimizar o refluxo.
- Após a injeção, certifique-se de que o nervo ciático parece ligeiramente inchado no local da injeção, sem vazamento ou descoloração. A injeção bem-sucedida é indicada por uma aparência nervosa estável sem extravasamento.
- Feche a incisão cirúrgica usando 3 a 4 suturas simples interrompidas com material inabsorvível (3-0, 30 mm, 3/8 c) para evitar inflamação no local da cirurgia. Se a cirurgia durar mais de 10 min, administre 1 mL de Ringer lactato (s.c.). Administre Meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) ao final do dia.
- Marque cada mouse para identificação exclusiva usando um punção de orelha ou etiqueta imediatamente após a cirurgia e antes da recuperação da anestesia.
- Permita que os camundongos se recuperem em um ambiente com temperatura controlada e monitore as complicações pós-cirúrgicas.
3. Imagem de bioluminescência para monitoramento de enxerto e crescimento tumoral
- Para avaliar o enxerto bem-sucedido e a progressão do tumor, execute o BLI em vários momentos. Para monitoramento in vivo , use um sistema de imagem in vivo para capturar a luz emitida pela reação enzimática entre a luciferase do vaga-lume, expressa pelas células tumorais, e seu substrato, a D-luciferina. Essa abordagem forneceu um método preciso para visualizar e quantificar a atividade do tumor, oferecendo informações valiosas sobre a dinâmica do tumor ao longo do tempo.
- Quantifique os sinais de bioluminescência em pontos de tempo específicos após o enxerto, incluindo os dias 5, 12, 19, 26, 30 e 33 após o enxerto (Figura 1). Normalmente, crie imagens de cinco mouses simultaneamente para agilizar o processo e manter a consistência entre as medições.
4. Configuração de imagem
- Anestesiar camundongos com isoflurano a 2% durante a aquisição da imagem e usar uma almofada de aquecimento integrada ao gerador de imagens IVIS.
- Posicione os camundongos consistentemente na mesma orientação e visualize-os 10 minutos após a injeção intraperitoneal de D-luciferina na dose de 10 μL / g de peso corporal (concentração estoque: 15 mg / mL em PBS, recém-preparado e filtrado).
- Adquira a imagem durante 1 min, usando o software de aquisição de dados, garantindo que nenhum pixel fique saturado durante o processo.
- Meça a intensidade do sinal bioluminescente como contagens relativas de fótons/s. Use o sistema de imagem com as seguintes configurações: Tempo de exposição: Automático; Binning: Médio; F/Stop: 1.2; Campo de visão: 12,5 cm; Software: Living Image Software v4.7.3.
- Meça a emissão de luz das regiões tumorais, relatadas como contagens relativas de fótons por segundo, usando software proprietário. Visualize a intensidade da bioluminescência usando a escala de pseudocor que é sobreposta em imagens em preto e branco capturadas simultaneamente.
5. Critérios para o sucesso do enxerto
- Exclua os camundongos se eles não exibirem bioluminescência detectável ou se o sinal diminuir com o tempo.
- Inclua apenas camundongos com aumento progressivo da luminescência entre os dias 5 e 12.
- Prossiga para o monitoramento do tumor usando imagens de bioluminescência, conforme descrito na seção Resultados representativos.
Resultados
Usando o procedimento descrito acima, um modelo de tumor ortotópico do nervo ciático foi estabelecido com sucesso em camundongos NSG com células derivadas de neurofibroma imortalizadas (ipNF04.4). A imagem de bioluminescência com D-luciferina revelou uma localização clara do tumor no nervo ciático já no dia 5, com evidência de crescimento exponencial ao longo do tempo. O enxerto foi bem-sucedido em 90% (37/41) dos camundongos injetados. A progressão tumoral foi monitorada nos dias 5, 12, 19, 26, 30 e 33 (Figura 1A), e nenhum sinal inespecífico foi observado durante todo o período de monitoramento. Os camundongos foram sacrificados no dia 33, de acordo com as diretrizes institucionais, ao primeiro sinal de sofrimento ou carga tumoral excessiva. À dissecção, o tumor apresentava-se bem desenvolvido e integrado ao nervo ciático, sem sinais de formação de abscesso (Figura 1B). Notavelmente, os camundongos exibiram deambulação normal imediatamente após a recuperação da anestesia.
Figura 1: Imagem de bioluminescência e análise macroscópica de xenoenxertos ortotópicos do nervo ciático em camundongos NSG. (A) Imagem de bioluminescência longitudinal (BLI) de dois camundongos NSG injetados intraneuralmente com células ipNF04.4 no nervo ciático esquerdo. As imagens foram capturadas nos dias 5, 12, 19, 26, 30 e 33 após a injeção, ilustrando o crescimento progressivo do tumor ao longo do tempo nos mesmos camundongos. O aumento na intensidade do sinal bioluminescente reflete o enxerto bem-sucedido e a expansão do tumor dentro do microambiente nervoso. (B) Visão macroscópica do nervo ciático no dia 33 pós-enxertia, mostrando um tumor bem desenvolvido, integrado e sem sinais de formação de abscesso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fotomicrografia do local do enxerto deste camundongo demonstrando crescimento tumoral e invasão focal. Seções de tecido embebidas em parafina coradas com hematoxilina e eosina (H & E). Exemplos de tumores típicos de três camundongos são mostrados. Barras de escala: 2000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Evolução representativa do peso corporal de camundongos NSG (n = 15) ao longo do experimento de xenoenxerto. Não foi observada perda de peso significativa. Clique aqui para baixar esta figura.
Discussão
O estabelecimento bem-sucedido de um modelo de xenoenxerto derivado de linhagem celular de neurofibromas ortotópicos (CDX) em camundongos NSG representa um avanço significativo na pesquisa de NF1, abordando as principais limitações dos modelos existentes. O protocolo confirma que as células de Schwann associadas à NF1 imortalizadas humanas (ipNF04.4)14,15,16 podem ser eficientemente enxertadas no nervo ciático de camundongos imunodeficientes, levando ao desenvolvimento de tumor reprodutível dentro de um microambiente fisiologicamente relevante. Xenoenxertos ortotópicos de linhagens celulares de Schwann foram mencionados nos estudos originais que estabeleceram linhagens celulares humanas de Schwann14,15, e um protocolo detalhado é fornecido aqui.
A chave para o sucesso deste protocolo foi a preparação e monitoramento meticulosos dos componentes celulares e dos animais hospedeiros. Durante o procedimento, a anestesia foi cuidadosamente administrada, garantindo que os camundongos fossem mantidos em um estado adequado de anestesia sem estresse significativo. Para minimizar qualquer dano potencial, o nervo ciático não foi esticado com pinças ou pinças, e muito cuidado foi tomado para evitar estresse mecânico nos tecidos. O uso de BLI à base de luciferase permitiu o monitoramento longitudinal não invasivo do crescimento tumoral, fornecendo dados quantitativos e reprodutíveis. Essa estratégia de imagem não apenas confirmou a viabilidade do enxerto, mas também permitiu a identificação de desvios precoces na dinâmica do tumor. A ausência de perda de peso significativa (Figura Suplementar 1), disfunção motora ou outros sinais de sofrimento nos camundongos destaca a compatibilidade deste protocolo com os princípios éticos do bem-estar animal e os 3Rs (Substituição, Redução, Refinamento).
Em comparação com os GEMMs, que dependem da inativação condicional de Nf1 6,7,9, essa abordagem oferece várias vantagens distintas. Os GEMMs requerem modificações genéticas específicas, mas podem não replicar totalmente as complexas interações tumor-estroma observadas em neurofibromas humanos 1,17. Esse modelo permite o estudo direto das células humanas de Schwann em seu nicho nervoso nativo, preservando fatores extrínsecos celulares4. Ao contrário dos GEMMs, onde os tumores se desenvolvem de forma imprevisível ao longo do tempo, o modelo de xenoenxerto permite um controle espaço-temporal preciso sobre a formação do tumor. Este modelo fornece uma plataforma rápida e reprodutível para testar terapias candidatas, com o BLI permitindo o monitoramento em tempo real da progressão do tumor e da resposta ao tratamento.
Além disso, esses achados se alinham com estudos anteriores sobre MPNSTs, onde o xenoenxerto ortotópico demonstrou aumentar a fidelidade dos modelos tumorais5. No entanto, os neurofibromas benignos apresentam desafios únicos, pois seu crescimento é altamente dependente de interações nervosas específicas, que os métodos convencionais de enxerto subcutâneo não conseguem recapitular6. Os resultados confirmam que a injeção intraneural fornece um ambiente ideal para o desenvolvimento sustentado do neurofibroma.
Assim, este modelo in vivo pode ser considerado uma alternativa complementar relevante aos GEMMs, para testes terapêuticos pré-clínicos. No entanto, existem limitações para o modelo. As células humanas de Schwann derivadas de neurofibromas foram imortalizadas e exibem um fenótipo tumoral que pode ser considerado mais agressivo do que o de um neurofibroma plexiforme, com proliferação celular densa (Figura 2). Nenhuma evidência de disseminação à distância foi observada em animais e a transformação maligna completa não foi demonstrada. Mais estudos são necessários para mostrar se o fenótipo celular poderia corresponder ao fenótipo "intermediário" que lembra o neurofibroma atípico, como as neoplasias neurofibromatosas atípicas com potencial biológico desconhecido (ANNUBP)18. Outra limitação crítica do modelo reside em sua dependência de camundongos imunodeficientes. A ausência de um sistema imunológico adaptativo em camundongos NSG limita o estudo das interações imunotumorais, que são cada vez mais reconhecidas como contribuintes importantes para a biologia do neurofibroma 7,19,20,21. Refinamentos futuros podem incorporar modelos de camundongos humanizados ou estratégias alternativas para capturar melhor os aspectos imunológicos da doença. Além disso, a dependência da expressão da luciferase para monitoramento de tumores, embora altamente eficaz, pode limitar a aplicabilidade deste protocolo a configurações experimentais sem acesso ao equipamento BLI. Embora o BLI seja um método sensível e não invasivo, ele não fornece informações diretas sobre as alterações histopatológicas. Análises complementares, como ressonância magnética ou histologia avançada, podem melhorar ainda mais a caracterização da progressão do neurofibroma.
Várias etapas do procedimento podem exigir otimização para garantir o enxerto tumoral bem-sucedido. A falha na injeção pode resultar do posicionamento inadequado da agulha ou vazamento excessivo da suspensão celular. Para mitigar isso, a agulha deve ser cuidadosamente inserida paralelamente ao nervo ciático e retirada lentamente após a injeção. A variabilidade nos sinais de bioluminescência pode surgir da dosagem inconsistente de luciferina ou desalinhamento durante a imagem. Recomenda-se que o momento da injeção pós-luciferina (10 min) seja padronizado e que configurações de imagem idênticas sejam mantidas em todos os animais. Se a variabilidade no crescimento do tumor permanecer alta, confirme a viabilidade celular antes da injeção e minimize o estresse do animal durante o manuseio.
Em conclusão, este estudo estabelece um novo e reprodutível modelo de xenoenxerto de neurofibroma ortotópico, oferecendo uma plataforma pré-clínica eficaz para o estudo de tumores benignos associados à NF1. Ao alavancar as células humanas de Schwann em seu microambiente nervoso natural, esse modelo imita de perto a biologia do neurofibroma humano, permitindo o monitoramento do tumor em tempo real e intervenções terapêuticas controladas. Este modelo representa um passo essencial entre os GEMMs e os modelos derivados do paciente (PDXs), abrindo caminho para abordagens clinicamente mais relevantes para a pesquisa e tratamento do neurofibroma.
Refinamentos futuros devem ter como objetivo integrar componentes imunológicos, como modelos de camundongos humanizados, para estudar o papel do microambiente tumoral6. A expansão das modalidades de imagem, incluindo ressonância magnética ou PET, pode complementar o BLI com insights estruturais e metabólicos22. A extensão dos cronogramas experimentais será essencial para investigar o desenvolvimento de neurofibroma a longo prazo e os riscos potenciais de transformação maligna. Ao preencher a lacuna entre os modelos GEMMs e PDX, esta plataforma aprimora a pesquisa translacional em NF1, oferecendo novas oportunidades para inovação terapêutica em tumores benignos da bainha do nervo periférico.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros conflitantes
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Institut national du cancer (Inca_18828). Gostaríamos de agradecer à plataforma HistIM (dirigida por Maryline Favier) e a Pierre Sohier, do Institut Cochin.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Buprecare | Para analgesia pré-operatória | |
| Tapetes de aquecimento | ANIPHY | VI-653246 | Para manter a normotermia durante cirurgia de camundongos |
| hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) linha celular | Materiais Biológicos Aplicados | T0194 | Linhagem celular de Schwann imortalizada com NF1-nulo |
| Isoflurano | Iso-Vet | Para anestesia de camundongos durante imagens por bioluminescência | |
| IVIS Lumina Série III | Revvity | Para imagem por bioluminescência | |
| Ketamina | Cetamina 1000 Virbac | Para anestesia cirúrgica em camundongos | |
| Software de Imagem Viva | Revvity | Incluído no IVIS | Para aquisição e quantificação de imagens |
| Sistema de Ensaio de Luciferase | Promega | E1500 | Para detecção de BLI |
| Meloxicam | METACAM | Medicamento anti-inflamatório não esteroide (AINE) | |
| Sutura monofilamento não absorvível | ETHILON | F2419H | Para suturar a incisão |
| Agulha para seringa | Hamilton | Costume | GA33/12,7mm/PST4-12&Deg; |
| Camundongos NOD SCID gamma (NSG) | Rio Charles | 614NSG | |
| pLenti CMV Puro LUC (w168-1) | Addgene | 17477 | Para a expressão da luciferase do vaga-lume |
| Povidona iodo & eacute; e dermique 10% | Viatris | 330200775 | Antisséptico tópico para desinfecção da pele |
| Lâmina do bisturi | FST | 10015-00 | Para incisão de pele durante a cirurgia |
| Microscópio Estereoscópico L125 | Leica | Para visualizar o local de injeção celular no nervo ciático | |
| Seringa 10 & micro; l | Hamilton | 1701RN | Para injeção celular no nervo ciático |
| Xilazina | Rompun 2% | Para anestesia cirúrgica em camundongos |
Referências
- Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
- Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
- Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
- Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
- Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
- Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
- Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
- Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
- Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
- Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
- Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
- Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
- Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
- Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
- Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
- Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
- Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).
Reimpressões e permissões
