Esse protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada.
Artigo de método
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Esse protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada.
Doenças autoimunes são resultado de células imunológicas que direcionam inadequadamente o próprio tecido, levando a patologias e danos a órgãos vitais. Órgãos linfoides secundários servem como local para a ativação das células B e T e para a tolerância imune periférica, resultantes da drenagem de antígenos e do tráfego de células apresentadoras de antígeno (APC) através de linfáticos locais. O papel dos linfonodos locais drenantes como local inicial de ativação linfócita foi descrito em contextos de tumores, infecções e doenças autoimunes específicas de órgãos, mas não na autoimunidade sistêmica. O lúpus eritematoso sistêmico, uma dessas doenças, é uma doença autoimune generalizada com envolvimento renal comum que leva a lesão renal e eventual falência. O entendimento mais profundo do papel dos linfonodos renais, que são o principal local de drenagem de antígenos e tráfico de CPA a partir dos rins, é limitado pela incapacidade de perturbar seletivamente esse tecido. Aqui está descrito um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada. Incluídos estão instruções detalhadas, recursos visuais, dicas úteis para melhorar o sucesso e solução de problemas procedurais. A sobrevivência a longo prazo é excelente e tem sido observada por pelo menos 4 meses após a cirurgia. Os linfonodos renais ressecados estão intactos e imediatamente prontos para processamento posterior. Esse procedimento é mais adequado para estudos do efeito local dos linfonodos renais.
Doenças autoimunes abrangem todos os órgãos do corpo humano, desde doenças relativamente restritas a órgãos, como hepatite autoimune, uveíte e diabetes tipo 1, até doenças generalizadas como esclerose sistêmica e Sjögrens 1,2,3,4,5. A tolerância imunológica é um estágio crítico no desenvolvimento das células B e T para prevenir a autorreatividade6. Embora a tolerância central via deleção clonal no timo seja necessária e eficaz, isso por si ....
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Todos os procedimentos são realizados em conformidade com os protocolos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais de Yale. Para desenvolver esse procedimento, foram utilizados15 de cepas Balb/c de 8 a 12 semanas, camundongos propensos a lúpus (MRL/MpJ-Faslpr/J/J) e controles simulados pareados de idade/sexo/genótipo. Além disso, camundongos selvagens do tipo C57BL/6 de 8 a 12 semanas também foram testados, e os lântulos foram ressecados com segurança. Tanto ratos machos quanto fêmeas foram incluídos. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais
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Esse procedimento pode ser realizado em 15-20 minutos por mouse. Para confirmar a precisão desse procedimento, foram realizadas linfanectomias renais bilaterais em cinco irmãos de ninhada de 8 a 12 semanas, com compatibilidade de idade, sexo e genótipo. Todos os camundongos toleraram bem o procedimento, com 100% de sobrevivência perioperatória. Amostras excisadas foram colocadas no PBS sobre gelo. Todas as amostras afundaram imediatamente, confirmando baixo teor de adiposo. Amostras exci.......
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Aqui está descrito um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada. A principal limitação desse procedimento é o tamanho relativamente pequeno dos linfonodos renais, o que exige um microscópio cirúrgico. Sem um microscópio cirúrgico, a resseção confiante pode ser difícil de alcançar. Alguns modelos genéticos de camundongos têm linfonodos aumentados, facilitando a identificação e o aprendizado da técnica17. Em camu.......
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R.A.F. é consultora da Glaxo Smith Kline, Plythera Inc. e Ventus Therapeutics. Todos os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecemos a J. Alderman, B. Cadugan, E. Hughes-Picard e J. Horrocks pela assistência administrativa, e a C. Hughes pela gestão da colônia de camundongos. H.N.B. é membro do Programa de Treinamento de Cientistas Cirurgiões de Yale, que financiou e apoiou parcialmente esse projeto. Esse trabalho também foi financiado pelo Howard Hughes Medical Institute (para a R.A.F.) e pelo Prêmio de Pesquisa para Residentes do American College of Surgeons (para H.N.B.).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Circuito anestésico | Qualquer | Ou anestésico injetável | |
| Citômetro de fluxo BD LSRII (ou equivalente) | BD em Biociências | Equipado com o Software FACS Diva | |
| Buprenorfina XR | Qualquer | Para analgesia | |
| Mídia de cultura celular | Qualquer | (para técnicas de células vivas; ou seja, DMEM ou RPMI) | |
| DAPI | Biolenda | 422801 | Concentração de trabalho: 15 ug/mL |
| Luzes LED duplas/duplas de microscópio de pescoço de ganso | Qualquer | ||
| Etanol (70% em água) | Qualquer | Para limpeza | |
| CD45.2 (104) conjugado com FITC anti-mouse | Biolenda | 109806 | Concentração de trabalho: 5 ug/mL |
| Pinça: Pinça de ponta fina e angular (x2) | Roboz | RS-5058 | Material: Dumoxel; Padrão #5, ângulo de 45 graus; Tamanho da ponta 0,1 x 0,06mm |
| Pinça: Pinças de ponta fina | Roboz | RS-4960 | Material: Dumostar; Padrão #1; Tamanho da ponta: 0,20 x 0,12mm |
| Pinça: Pinças de ponta fina | Roboz | RS-4966 | Material: Dumostar, ponta de Biologie; Padrão #3; Tamanho da ponta: 0,08 x 0,04mm |
| Lidocaína | Qualquer | Para analgesia | |
| Ratos | Jax | Para a cepa C57BL/6, camundongos selvagens do tipo selvagem: The Jackson laboratories #000664 | |
| Condutores de agulha | Roboz | RS-6410 | Suporte de agulhas Castroviejo; Reto |
| Microscópio operador | Leica | MZ9.5 | Microscópio operador de cabeça estéreo Leica Mz9.5 |
| OPCIONAL: Evans Blue dye | Sigma | E2129-10G | Para rastreamento linfático. |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Qualquer | ||
| Solução de povidona/iodo | Qualquer | Para preparação/esterilização da pele | |
| Tesoura: Tesoura de ponta extra fina | Roboz | RS-5605 | McPherson-Vannas; Aresta de corte de 3mm; curva |
| Tesoura: Tesoura média | Roboz | RS-5676 | Noyes; Borda de corte de 13mm; Direto |
| Cola cirúrgica | Qualquer | por exemplo, adesivo de tecido 3M Vetbond | |
| Sutura: polipropileno monofilamento azul 6-0 | Qualquer | ||
| Fixador tecidular | Qualquer | (para histologia planejada; ou seja, formalina tamponada com 10% neutro ou 4% paraformaldeído) | |
| Bolsa térmica de circulação de água morna | Qualquer | ||
| Ratos | Os laboratórios Jackson | Para a cepa Balb/c, camundongos propensos ao lúpus (MRL/MpJ-Fas-lpr/J): #000485 |
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