Criando oscilações rápidas de oxigênio na análise de crescimento microbiano de célula única usando um dispositivo microfluídico de camada dupla

Resumo

Este protocolo apresenta um método para fabricar um chip microfluídico de camada dupla e analisar o crescimento microbiano sob oscilações rápidas de oxigênio. O desempenho do dispositivo foi validado por meio de sensoriamento de oxigênio em canais de fluidos e cultivo microbiano.

Resumo

A análise microbiana de célula única usando microfluídica juntamente com microscopia de lapso de tempo é promissora para investigar o comportamento do crescimento microbiano em ambientes confinados com resolução espaço-temporal, oferecendo insights que não podem ser obtidos com o cultivo convencional e plataformas analíticas. O oxigênio desempenha um papel crucial na determinação do crescimento microbiano. No entanto, o controle temporal no intervalo de segundos não foi implementado na análise microbiana usando microfluídica. Recentemente, desenvolvemos um chip microfluídico PDMS de camada dupla que permite o controle temporal de oxigênio na faixa de dezenas de segundos. O chip compreende uma camada superior para gaseificação e uma camada inferior para cultivo e perfusão de fluidos. As duas camadas são separadas por uma fina membrana intermediária de PDMS, permitindo uma rápida troca gasosa entre as duas camadas. Neste artigo metodológico, explicamos o procedimento para fabricação, caracterização e cultivo microbiano do chip usando o chip. Como resultados representativos, demonstramos a capacidade de troca rápida de oxigênio em dezenas de segundos, cultivo microbiano e análise de crescimento resolvida no tempo sob condições de oxigênio constantes e oscilantes. Este protocolo visa auxiliar pesquisadores interessados em implementar o controle temporal de oxigênio em sua configuração microfluídica.

Introdução

O oxigênio está intimamente ligado ao crescimento microbiano e à fisiologia entre vários fatores ambientais, afetando particularmente os processos celulares, como resposta ao estresse oxidativo, homeostase do ferro e infecções patogênicas ^1,2,3. Convencionalmente, o cultivo microbiano tem sido conduzido em condições ambientais ou com controle mínimo em níveis específicos de oxigênio. Em cenários realistas, por outro lado, os ambientes de oxigênio geralmente não são constantes em muitos casos, mas flutuam ao longo do tempo. Por exemplo, os micróbios podem ser expostos a mudanças nos níveis de oxigênio em segundos a minutos em sistemas aquáticos à medida que se movem pelo ambiente devido ao movimento de fluidos e à motilidade microbiana ^4,5,6. Da mesma forma, os biorreatores industriais também criam ambientes de oxigênio não homogêneos devido à mistura inadequada, o que afeta o crescimento microbiano e o rendimento final ^7,8. Estudar as respostas microbianas a essas condições dinâmicas é vital para entender os processos ecológicos e melhorar as aplicações biotecnológicas.

Anaeróbios facultativos, como Escherichia coli (E. coli), podem alternar entre vias aeróbicas e anaeróbicas, dependendo da disponibilidade de oxigênio ^9,10. Embora pesquisas anteriores tenham explorado essa adaptabilidade metabólica, a maioria dos estudos se concentra em mudanças únicas de oxigênio usando sistemas de cultivo convencionais, que não conseguem replicar as mudanças rápidas que os micróbios costumam enfrentar 9,11,12,13,14. Como resultado, há uma compreensão limitada de como os micróbios respondem fisiologicamente às mudanças frequentes nos níveis de oxigênio.

Como mencionado, as configurações tradicionais de laboratório carecem da precisão e velocidade necessárias para imitar as flutuações rápidas de oxigênio e não suportam monitoramento contínuo e de alta resolução. Para resolver isso, desenvolvemos recentemente uma plataforma microfluídica especializada com um chip de polidimetilsiloxano (PDMS) de camada dupla, permitindo controle rápido de oxigênio e imagens de célula única¹⁵. Aqui, fornecemos protocolos para a fabricação de um chip microfluídico de camada dupla que cria oscilações rápidas de oxigênio e permite a análise de crescimento microbiano de célula única sob condições controladas de oxigênio. O chip é composto por duas camadas – uma camada superior para perfusão de gás e uma camada inferior para perfusão de fluidos e cultivo microbiano. A membrana fina intermediária entre as duas camadas permite uma rápida troca gasosa. Como demonstração, E. coli MG1655 foi cultivada no chip desenvolvido. O crescimento sob condições de oxigênio constante e oscilante foi analisado.

Protocolo

1. Preparação do molde

1. Prepare um molde para a camada superior por impressão 3D. Fabrique o molde da camada superior com uma superfície lisa para garantir uma superfície lisa da camada superior do PDMS resultante. Recomendamos o uso de impressão 3D de estereolitografia (SLA).
   1. Projete o molde com software CAD 3D (Figura 1A). Certifique-se de que o projeto inclua canais de gás que se sobreponham aos canais de fluido inferiores. Execute este processo de design em paralelo ao design da camada inferior (etapa 1.2.1).
   2. Imprima o molde usando a impressão 3D SLA. Remova a resina restante do molde impresso e lave-o em banho de álcool isopropílico (IPA) por 30 minutos (Figura 1B).
   3. Realize a pós-cura expondo o molde à luz de 405 nm com duração e temperatura adequadas, dependendo do tipo e geometria da resina.
   4. Deixe o molde de molho em IPA em um banho de ultrassom por 15 min para remover a resina não curada restante no molde, o que poderia inibir a cura do PDMS.
2. Prepare um molde de wafer de silício para a camada inferior.
   1. Projete o chip microfluídico com o editor de layout CAD (Figura 1C). Certifique-se de que o projeto inclua entradas, canais de fluido e saídas.
   2. Crie um molde de wafer de silício usando fotolitografia de duas camadas, conforme descrito no artigo anterior (Figura 1D)¹⁶.
      NOTA: Os canais na camada inferior são do tamanho de μm e requerem fabricação precisa, enquanto os canais na camada superior são do tamanho de mm. Como a impressão 3D SLA oferece menor tempo de fabricação e, portanto, prototipagem mais rápida, a impressão SLA foi usada para fabricar estruturas bastante grandes para o molde da camada superior. A camada inferior foi fabricada por fotolitografia para garantir uma fabricação precisa. Caso os canais na camada superior também estejam na faixa de μm e exijam precisão, considere fabricar um molde usando fotolitografia também.

2. Fabricação de chips microfluídicos de camada dupla PDMS

1. Prepare a solução de pré-cura PDMS misturando bem a base e o agente de cura na proporção de 10:1. Desgaseifique a mistura em um dessecador por 1 h.
2. Limpe o molde da camada superior com IPA e seque com ar comprimido.
3. Despeje o PDMS no molde da camada superior, seguido de cura térmica a 80 °C por 20 min (^1ª etapa de cura, Figura 1E). A^1ª etapa de cura permite descascar, cortar e perfurar o PDMS enquanto ele não está totalmente curado.
4. Verifique a viscosidade do PDMS manualmente ou com uma pinça após 20 min de aquecimento. Se o PDMS ainda estiver pegajoso, ajuste o tempo de aquecimento.
5. Retire o PDMS do molde da camada superior e corte-o em pedaços únicos (aqui 20 mm x 18 mm). Furos (diâmetro = 0,75 mm) para entradas de gás (Figura 1F). Limpe a superfície inferior da camada superior enxaguando com IPA, secando com ar comprimido e colocando fita adesiva.
6. Limpe o molde da camada inferior com IPA e seque-o com ar comprimido. Fixe o molde da camada inferior em um revestidor giratório e despeje o PDMS no centro do molde. Despeje o PDMS perto do wafer para reduzir as bolhas de ar. Se forem encontradas bolhas de ar após o vazamento do PDMS, mova-as para o lado externo usando uma pinça ou agulha limpa
7. Gire o PDMS no molde da camada inferior a 1000 rpm por 60 s, seguido de cura térmica a 80 °C por 10 min (^1ª etapa de cura, Figura 1G). Verifique a viscosidade do PDMS manualmente ou com uma pinça após 10 min e ajuste o tempo de aquecimento, se necessário.
8. Coloque as peças do PDMS da camada superior na camada do PDMS inferior do molde e pressione firmemente a partir da parte superior para garantir a fixação da superfície das camadas superior e inferior (Figura 1H).
9. Cure termicamente o PDMS completamente a 80 °C por pelo menos 1 h (^2ª etapa de cura). A^2ª etapa de cura permite a cura final do PDMS, onde as camadas superior e inferior são irreversivelmente unidas (Figura 1H).
10. Corte delicadamente a camada inferior do PDMS em pedaços. Retire cuidadosamente todo o chip PDMS do molde (Figura 1H).
    NOTA: Se os cavacos PDMS forem difíceis de descascar do molde, considere um tratamento de superfície adicional do molde da camada inferior, como silanização e revestimento químico da superfície, para facilitar o procedimento de descascamento. Se as camadas superior e inferior se soltarem durante o descascamento, considere encurtar o tempo para a^1ª etapa de cura.
11. Furos (diâmetro = 0,5 mm) para entradas e saídas de fluido em ambas as extremidades dos canais de fluido (Figura 1H). Limpe cuidadosamente a superfície inferior do chip enxaguando com IPA, secando com ar comprimido e prendendo fita adesiva.
12. Cole o chip com uma lamínula de 0,175 mm de espessura após ativar a superfície por oxidação por plasma (25 s, Figura 1H).
13. Depois de colocar o chip no substrato de vidro, lave a camada superior com ar pressurizado para garantir que a camada inferior da membrana PDMS esteja devidamente presa ao vidro.
14. Aqueça o cavaco colado a 80 °C por 10 s a 1 min para aumentar a estabilidade da colagem.
    NOTA: A etapa de cura PDMS mencionada acima e o tempo de cura necessário podem ser afetados por vários parâmetros, como espessura do molde, equipamento e condições ambientais. Portanto, ajuste o tempo de cura de acordo, caso o protocolo sugerido não se adapte à aplicação.

3. Configuração experimental

NOTA: Um microscópio invertido equipado com uma câmera semicondutora de óxido metálico complementar (CMOS), uma câmera de microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) (domínio da frequência) e uma incubadora de temperatura é usada como configuração experimental padrão. Uma fonte de laser de excitação modulada (445 nm, 100 mW) é conectada à câmera FLIM. Três controladores de fluxo de massa (nitrogênio, oxigênio e dióxido de carbono) são usados para controle de gás. As bombas de seringa são usadas para perfusão média.

1. Prepare os tubos para perfusão de gás (entrada) e fluido (entrada e saída). Ligue a incubadora para atingir a temperatura desejada antes do experimento (aqui 37 °C).
2. Selecione uma lente objetiva desejada (aqui, 20x para detecção de oxigênio e 100x para observação microbiana) e adicione óleo de imersão, se necessário. Fixe o chip de camada dupla em um porta-chip com adesivos.

4. Controle e detecção de oxigênio no chip

1. Preparar uma solução de corante sensível ao oxigénio com concentração adequada (neste caso, 3 mM de tris(2,2'-bipiridil)diclororutênio(II)hexa-hidratado, RTDP).
2. Calibre a câmera FLIM usando um slide de referência com uma vida útil conhecida (aqui 3.75 ns). Meça a intensidade do sinal com a câmera FLIM e ajuste o tempo de exposição ou a abertura do microscópio para atingir uma intensidade de sinal de 0,68 - 0,72 para melhor calibração.
3. Fixe o porta-chip na platina do microscópio. Conecte os tubos apropriados à entrada e saída de fluido. Comece a perfundir a solução de corante sensível ao oxigênio a uma taxa de fluxo constante usando uma bomba de seringa (aqui 100 nL / min).
4. Conecte a entrada de gás e os controladores de fluxo de massa com a tubulação apropriada. Comece a lavar o gás com concentração de oxigênio controlada (aqui 0% ou 21% de oxigênio, vazão mássica total de 600 mL / min).
5. Meça o tempo de vida da fase na ausência de oxigênio (τ₀) e em outra concentração de oxigênio conhecida (aqui a 21%). Calcular a constante de extinção (K_q) utilizando a equação de Stern-Volmer do seguinte modo, que descreve a extinção da fluorescência na presença de oxigénio. Alternativamente, a intensidade de fluorescência (I) pode ser usada; no entanto, a medição baseada em intensidade pode ser afetada por variações na intensidade da fonte de luz, branqueamento fotográfico e assim por diante.
   
   NOTA: Recomenda-se aguardar alguns minutos após iniciar a lavagem do gás para garantir uma calibração precisa, principalmente ao atingir níveis de depleção de oxigênio tão baixos quanto 0%. Para maior precisão, considere complementar o processo com métodos adicionais de esgotamento de oxigênio, como o uso de sequestrantes de oxigênio ou uma configuração adicional de câmara selada.
6. Meça a vida útil da fase e calcule a concentração de oxigênio correspondente usando a equação de Stern-Volmer. Para criar condições de oxigênio oscilante, use qualquer sistema de controle de instrumento para automatizar o ajuste das taxas de fluxo de volume para nitrogênio e oxigênio.

5. Preparação da cultura bacteriana

1. . Inicie uma pré-cultura inoculando um organismo desejado (aqui, E. coli MG1655, único grânulo pronto para uso de um frasco criogênico por frasco) em um meio desejado (aqui, meio LB compreendendo 10 g / L de peptona, 5 g / L de extrato de levedura e 10 g / L de NaCl) e incube durante a noite (aqui, 37 ° C a 150 rpm).
2. Medir a densidade óptica resultante com um fotómetro a 600 nm (OD₆₀₀).
3. Inicie a próxima cultura em meio LB inoculando a pré-cultura (aqui OD_{inicial 600} = 0,3 ou 0,0001). Incubar a cultura até atingir a fase de crescimento exponencial.
   NOTA: Se o meio para cultivo no chip for diferente do primeiro meio de pré-cultura, é desejável realizar uma segunda pré-cultura com o meio para cultivo no chip para permitir que os organismos se familiarizem com um novo meio¹⁶.
4. Preparar uma solução de sementeira diluindo a cultura até obter uma densidade óptica adequada. Transfira a solução de semeadura para uma seringa de 1 mL para a próxima etapa. Para E. coli, a densidade óptica (OD₆₀₀) da solução de semeadura foi de cerca de 0,5.

6. Cultivo microbiano no chip e imagens de lapso de tempo sob condições controladas de oxigênio

1. Fixe o porta-chip na platina do microscópio. Deixe o porta-cavacos e o chip PDMS aquecerem na incubadora (aqui 37 °C) por várias horas, pois isso diminuirá o risco de desfocagem durante a imagem de lapso de tempo devido ao deslocamento associado à temperatura.
2. Antes de iniciar o cultivo, inicie a gaseificação com a concentração inicial de oxigênio desejada, ajustando a porcentagem volumétrica de fluxo mássico de oxigênio e nitrogênio, mantendo a vazão total e a vazão de dióxido de carbono constantes.
3. Conecte a entrada de gás do chip e os controladores de fluxo de massa.
4. Semeie o organismo no chip conectando a seringa com a solução de semeadura à saída do fluido e empurrando manualmente a seringa. Verifique através do microscópio se as células estão presas com sucesso nas câmaras de cultivo.
5. Após a inoculação celular, remova a seringa e conecte outra seringa com o meio fresco à entrada do fluido. Empurre manualmente a seringa para lavar as células restantes no canal de suprimento do meio.
6. Comece a perfundir o meio a uma taxa de fluxo constante (aqui 100 nL / min) com a bomba de seringa. Garanta uma vazão suficiente, pois uma taxa inadequada pode levar ao ressecamento da câmara. A vazão suficiente pode variar dependendo de vários fatores, incluindo a geometria do canal de fluido e a vazão de gás no canal da camada superior.
7. Inicie a aquisição de imagens com lapso de tempo. Para cultivo em condições de oxigênio oscilante, inicie o controle automático dos controladores de fluxo de massa ao mesmo tempo em que a aquisição da imagem começa. Caso haja algum atraso no início do controle de gás e aquisição de imagens, leve em consideração o atraso para posterior análise dos dados de imagem.

7. Análise de dados de imagem

1. Salve a imagem de lapso de tempo como uma pilha de imagens por posição.
2. Pré-processe a imagem para girar, alinhar e cortar a colônia cultivada usando programas de análise de imagem. Exemplos de arquivos . As imagens TIF estão disponíveis aqui: https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747¹⁵
3. Segmente células e extraia valores relevantes, como número de células, comprimento, área, intensidade de fluorescência e assim por diante. Analise ainda mais os comportamentos de crescimento. Exemplos de scripts Python estão disponíveis aqui: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Resultados

Fabricação de chips de camada dupla PDMS
O chip de camada dupla fabricado é representado na Figura 2A, com canais de gás coloridos (vermelho) e canais de fluido (azul) para visualização. O chip tem três canais de fluido idênticos e canais de gás sobrepostos para permitir experimentos paralelos. O canal de fluido possui uma área de cultivo com uma série de câmaras de cultivo (Figura 2A(i)). As células ficam presas dentro das câmaras de cultivo e crescem em um formato de monocamada, o que permite imagens de lapso de tempo de alta resolução com uma alta taxa de aquisição de imagem. A seção transversal do chip ilustra uma camada superior de 3 mm de espessura e camadas inferiores de 65 μm de espessura, permitindo a rápida difusão do gás do canal de gás para o canal de fluido através da membrana PDMS intermediária (Figura 2A (ii-ii')).

Controle de oxigênio no chip
A capacidade de troca gasosa do chip desenvolvido foi testada usando FLIM e corante sensível ao oxigênio¹⁵. Conforme mostrado na Figura 2B, a concentração de oxigênio no canal de fluido mostrou uma diminuição ou aumento correspondente em dezenas de segundos quando a concentração de oxigênio foi alterada entre 21% e 0%. Esses resultados de medição de oxigênio demonstram que a rápida oscilação de oxigênio em dezenas de segundos pode ser replicada no chip microfluídico de camada dupla desenvolvido.

Cultivo microbiano sob condições constantes de oxigênio
O chip foi empregado pela primeira vez para caracterizar o crescimento anaeróbio facultativo de E. coli sob condições gasosas constantes com várias concentrações de oxigênio. O dióxido de carbono sempre foi adicionado ao gás de suprimento, uma vez que observamos crescimento restrito de E. coli sob depleção de dióxido de carbono em experimentos preliminares (dados não mostrados). A Figura 3A e a Figura 3B mostram imagens representativas de contraste de fase de E. coli sob condições aeróbicas (21% de suprimento de oxigênio) e anaeróbicas (0% de suprimento de oxigênio), respectivamente. Após 3 h de cultivo, E. coli cultivada em condições aeróbias resultou em colônias maiores em comparação com condições anaeróbias. A análise quantitativa também mostra diferentes taxas de aumento no tamanho da colônia (colônia A) dependendo da disponibilidade de oxigênio, conforme mostrado nas curvas de crescimento na Figura 3C. Observe que uma_colônia é normalizada pela área inicial para permitir a comparação em diferentes colônias e condições. A taxa de crescimento exponencial μ pode ser determinada a partir da curva de crescimento da seguinte forma e resumida na Figura 3D.

Os resultados validam a capacidade do dispositivo de controlar o oxigênio nas concentrações desejadas e analisar efetivamente o crescimento microbiano correspondente a partir de imagens de lapso de tempo adquiridas.

Cultivo microbiano sob condições de oxigênio oscilante
Finalmente, E. coli foi cultivada sob condições oscilantes de oxigênio, alternando entre fases de gaseificação aeróbica e anaeróbia com um intervalo de comutação T'. Vários T' entre 60 min e 1 min foram examinados para testar a capacidade de análise de crescimento resolvida no tempo em correlação com condições oscilantes de oxigênio. A Figura 4 mostra o crescimento quantificado de E. coli sob condições oscilantes de oxigênio com T' = 60, 30, 10, 5, 2 e 1 min. Além da curva de crescimento baseada na _colônia A, a taxa de crescimento instantânea μ_Δt também é determinada para adquirir insights resolvidos no tempo da seguinte forma.

As taxas de crescimento sob condições aeróbicas e anaeróbicas constantes também são mostradas com linhas pontilhadas (μ_21%, μ_0%) na Figura 4 como referências de crescimento. O crescimento de E. coli apresentou dinâmica distinta em resposta às condições gasosas oscilantes. Por exemplo, depois que a fase de gaseificação foi alterada de condições aeróbicas para anaeróbicas (T' = 60 min), o crescimento mostrou (i) fase de resposta: diminuição repentina na taxa de crescimento, seguida por (ii) fase de recuperação: aumento gradual na taxa de crescimento e (iii) fase de estabilização: estabilização do crescimento em torno de μ_0%. A dinâmica de crescimento de E. coli foi resolvida temporalmente com sucesso sob vários T' tão curtos quanto 1 min, onde E. coli mostrou uma taxa de crescimento monótona para cima e para baixo devido ao tempo limitado para adaptar o crescimento às mudanças nas condições gasosas. Além disso, o comportamento do crescimento pode ser analisado não apenas no nível da colônia, mas também no nível de uma única célula. A Figura 5 ilustra o desenvolvimento da área unicelular sob oscilações de oxigênio em vários intervalos de comutação T '. O crescimento de uma única célula pode ser inferido seguindo gráficos vizinhos, sem análise de rastreamento. O comportamento de crescimento no nível de célula única se assemelha ao que foi observado no nível da colônia na Figura 4; um aumento de área mais rápido durante a fase de gaseificação aeróbica e uma mudança clara na velocidade de crescimento no evento de troca de gás. Os resultados aqui demonstram a capacidade de cultivar micróbios sob condições gasosas oscilantes e de analisar o crescimento microbiano em correlação com a disponibilidade de oxigênio de maneira resolvida no tempo.

Figura 1: Procedimento de fabricação de chips de camada dupla. O procedimento começa com (A, C) projeto do molde, (B, D) fabricação do molde, (EG) moldagem PDMS e (H) montagem do cavaco. Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Chip de camada dupla fabricado e sua capacidade de controle de oxigênio. (A) A imagem representativa do chip fabricado é apresentada, apresentando canais de gás coloridos (vermelho) e canais de fluido (azul) para visualização. A imagem SEM é mostrada em (i), representando uma série de câmaras de cultivo conectadas a canais de fluido em ambos os lados (barra de escala de 100 μm). A seção transversal do chip é mostrada em (ii-ii'), representando a camada superior de 3 mm de espessura e a camada inferior de 65 μm de espessura. (B) A concentração de oxigênio medida no canal de fluido após a troca entre condições aeróbicas (21% de oxigênio) e anaeróbicas (0% de oxigênio). Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Cultivo de E. coli sob condições constantes de oxigênio. (A) As células são cultivadas aeróbicas (21% de suprimento de oxigênio) por 3 h, e as imagens de lapso de tempo são adquiridas usando microscopia de contraste de fase. (B) As células são cultivadas anaerobicamente (0% de suprimento de oxigênio) e as imagens de lapso de tempo são adquiridas por 3 h. (C) O crescimento celular sob várias condições constantes de oxigênio é plotado com base em uma_colônia. (D) A taxa de crescimento exponencial é calculada e resumida. Todas as barras de escala = 5 μm. Os dados são expressos como ± média DP n = 35 colônias (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cultivo de E. coli em condições oscilantes de oxigênio. O crescimento celular sob várias condições oscilantes de oxigênio é examinado (T', intervalo de comutação entre condições aeróbicas e anaeróbicas). O crescimento celular baseado em uma_colônia é plotado ao longo do tempo (superior) e μ_Δt é plotado ao longo do tempo para permitir a interpretação de dados resolvidos no tempo (inferior). Os dados são expressos como ± média DP n = 5 colônias (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Área unicelular (uma _{única célula} ) de E. coli cultivada sob condições oscilantes de oxigênio. Os dados são de uma colônia representativa de cada intervalo de comutação T'. Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo para fabricação e operação de um sistema microfluídico de camada dupla foi fornecido para observar o crescimento microbiano sob condições de oxigênio de rápida oscilação com alta resolução espaço-temporal. Juntamente com a imagem de lapso de tempo, esta plataforma permite o cultivo no chip e o monitoramento em tempo real de microrganismos sob condições controladas de oxigênio, permitindo a análise do crescimento microbiano em correlação com a disponibilidade de oxigênio.

Neste protocolo, as camadas superior e inferior são preparadas separadamente e depois montadas em um único chip. Este conceito modular permite vários designs de chips simplesmente substituindo as configurações de duas camadas. Diferentes métodos de fabricação foram usados para os moldes da camada superior e inferior - impressão 3D SLA para a parte superior e fotolitografia para a parte inferior - com base em seus respectivos requisitos de tamanho e precisão. Essa abordagem melhora a eficiência geral do processo de fabricação. A montagem das duas camadas é realizada por meio de um processo de cura PDMS em duas etapas. É essencial otimizar o tempo de aquecimento para a primeira etapa de cura de acordo com o projeto, pois a espessura do molde e as condições de aquecimento local podem afetar os resultados de cura do PDMS.

Aproveitamos a natureza do PDMS ser altamente permeável ao ar para obter uma troca rápida de oxigênio. Por outro lado, a precisão do controle do oxigênio também pode ser afetada pela difusão passiva do oxigênio através do PDMS, particularmente em níveis mais baixos de oxigênio. Para compensar essa limitação, outras melhorias podem ser adicionadas ao protocolo. Por exemplo, o método de calibração para o sensor de oxigênio tem oportunidades de melhoria. No protocolo demonstrado, o sensor é calibrado em dois pontos de referência, níveis de oxigênio de 0% e 21%, usando o chip de camada dupla PDMS. Consequentemente, a precisão da detecção de oxigênio depende da capacidade de criar condições precisas de esgotamento de oxigênio para calibração. Conforme mencionado no protocolo, recomenda-se aguardar alguns minutos após iniciar a lavagem do gás para garantir uma calibração precisa, principalmente ao atingir níveis de depleção de oxigênio tão baixos quanto 0%. No entanto, essa tarefa é desafiadora devido a possíveis vazamentos ou retenção de ar no chip PDMS permeável ao ar. A precisão da calibração pode ser melhorada ainda mais utilizando produtos químicos que eliminam oxigênio ou envolvendo o chip em uma câmara hermeticamente fechada e empobrecida em gás^17,18. Esses suplementos podem permitir uma análise mais robusta e precisa do comportamento microbiano sob condições estritamente anaeróbicas e com baixo teor de oxigênio.

O dispositivo demonstrado seria de interesse para vários campos de pesquisa. Por exemplo, seria útil para replicar as condições de oxigênio em biorreatores industriais, onde a disponibilidade de oxigênio é assumida como espaço-temporalmente não homogênea 7,8,19,20. O uso do chip de camada dupla permite que os pesquisadores caracterizem e entendam o comportamento microbiano em ambientes de oxigênio que flutuam rapidamente, o que não era possível em configurações de cultivo convencionais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Clewin 5	Software WieWeb, Países Baixos	N/A	Editor de layout
Câmera CMOS	Nikon, Japão	DS-Qi2
vidro de cobertura	Schott AG, Alemanha	D263 Biografia	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Limpador de plasma Femto	Diener Electronics, Alemanha	-	ligação de plasma de chip
Formulário 3B	Formlabs, EUA	-	Impressora 3D
Referência vitalícia	Starna Scientific, Reino Unido	UMM-SFG
Controlador de fluxo de massa	Vö gtlin Instruments GmbH, Suíça	GSC-A9SA-BB22	de nitrogênio, de oxigênio
Controlador de fluxo de massa	Vö gtlin Instruments GmbH, Suíça	GSC-A9SA-BB21	dióxido de carbono
Resina modelo v3	Formlabs, EUA	RS-F2-DMBE-03	Resina para impressão 3D
NaCl	Carl Roth, Alemanha	3957.1	Componente médio LB
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Japão	-	Microscópio invertido
Câmera pco.flim	PCO AG, Alemanha	-
Laser pco.flim	Omicron-Laserprodukte GmbH, Alemanha	-
Peptona	Carl Roth, Alemanha	8986.1	Componente médio LB
Plano Apo λ	Nikon, Japão	-	100x óleo, 20x
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Chemical Company, EUA	Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184
Ferramenta de perfuração, Φ 0,50 milímetros	Instrumentos de Precisão Mundial, EUA	504528
Ferramenta de perfuração, Φ 0,75 milímetros	Instrumentos de Precisão Mundial, EUA	504529
Frasco criogênico ROTI Store	Carl Roth, Alemanha	-
Edição x64 do Solidworks 2016	Dassault Systems, França	N/A	CAD 3D
Revestidor de rotação de substrato	APT Automation, Alemanha	SPIN150i	Revestimento giratório PDMS
Bomba de seringa	CETONI, Alemanha	neMESYS
Incubadora de temperatura	Okolab, Itália	-	Equipamento de microscópio
tris(2,2'-bipiridil)diclororutênio(II)hexahidratado, (RTDP)	Acros Organics, Bélgica	208750010
Tubulação	Saint-Gobain, França	Tygon F-4040-A	Tubulação de entrada de gás
Tubulação	Saint-Gobain, França	Tygon AAD04103	Tubulação de fluido
Extrato de levedura	Carl Roth, Alemanha	2363.3	Componente médio LB