Method Article

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

DOI:

10.3791/68708

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November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

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As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Abstract

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As células tumorais circulantes (CTCs) servem como um biomarcador promissor para rastrear metástase, progressão e recorrência do câncer. As técnicas de biópsia líquida centradas na detecção de CTC demonstraram um potencial considerável devido à sua natureza não invasiva e capacidade de fornecer monitoramento em tempo real da dinâmica do tumor. No entanto, as análises convencionais de CTC em massa não conseguem capturar a heterogeneidade intrínseca entre as populações de CTC, obscurecendo insights cruciais sobre a biologia do tumor. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) permite a caracterização de alta resolução da heterogeneidade da CTC, oferecendo novas oportunidades para oncologia de precisão e estudos mecanicistas da progressão do tumor. Apesar dessas vantagens, as metodologias existentes para sequenciamento de CTC único tendem a sofrer de ineficiências, incluindo baixas taxas de recuperação, fluxos de trabalho intensivos e riscos de contaminação associados a várias etapas de manuseio manual. Para resolver essas limitações, apresentamos um protocolo microfluídico integrado que consolida o enriquecimento da CTC, a purificação e o sequenciamento de célula única em um fluxo de trabalho unificado. O método emprega captura magnética controlada dinamicamente dentro de um chip estruturado em espinha de peixe, onde a mistura de vórtices e a ligação cumulativa de esferas imunomagnéticas permitem um isolamento CTC robusto e de alto rendimento com danos celulares mínimos. A purificação subsequente usando um chip microfluídico revestido com anticorpos leucocitários remove efetivamente as células não-alvo, aumentando ainda mais a pureza da CTC por meio da seleção negativa. Finalmente, um chip de sequenciamento de célula única de alta precisão, projetado com base em princípios de resistência de fluxo diferencial, facilita a captura eficiente de uma única célula e o emparelhamento com microesferas com código de barras exclusivo. Essa nova plataforma supera as limitações dos métodos baseados em distribuição de Poisson, melhorando a utilização do CTC e minimizando o consumo de microesferas e os custos de sequenciamento. Nosso protocolo integrado aumenta significativamente a eficiência, a pureza e o rendimento do sequenciamento de célula única do CTC, tornando-o adequado para aplicações clínicas e pesquisas de câncer em larga escala. Ao permitir uma análise mais precisa e escalável da heterogeneidade da CTC, esse método tem o potencial de refinar o diagnóstico precoce do câncer, o monitoramento do tratamento e os estudos mecanicistas de metástases, avançando no campo da oncologia de precisão.

Introduction

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A metástase tumoral é um processo complexo e multifásico que começa com a disseminação e, em seguida, sofre dormência e colonização por células tumorais dentro do tumor primário. Essas células invadem progressivamente através da membrana basal em tecidos mais profundos e, posteriormente, intravasam em vasos sanguíneos ou linfáticos. Uma vez na circulação, essas células tornam-se células tumorais circulantes (CTCs), que podem viajar para órgãos distantes1. O surgimento de CTCs é uma etapa crítica na cascata metastática, pois elas servem como sementes para metástases à distância1. Nos últimos anos, a tecnologia de biópsia líquida baseada em CTC atraiu atenção considerável devido aos seus méritos, incluindo a natureza não invasiva e conveniente do procedimento, bem como a capacidade de monitoramento dinâmico em tempo real. Essa tecnologia facilita a avaliação precisa, em tempo real e abrangente da biologia do tumor, oferecendo vantagens únicas no monitoramento da eficácia do tratamento, na previsão de recorrência e na orientação da terapia 2,3,4. Além disso, estudos têm mostrado que as CTCs estão presentes no sangue periférico mesmo durante estágios de baixa carga tumoral, como câncer precoce, metástase precoce ou recorrência 5,6. Consequentemente, a biópsia líquida da CTC supera as limitações das biópsias de tecido tradicionais, que se limitam a tumores sólidos detectáveis por imagem7. Ele fornece uma nova perspectiva e suporte tecnológico para diagnóstico precoce do câncer, monitoramento de recorrência e metástase, orientação de tratamento, bem como elucidar os mecanismos de iniciação, progressão e metástase do tumor. Por exemplo, o número de CTCs no sangue periférico demonstrou servir como um preditor independente de sobrevida livre de progressão e sobrevida global em pacientes com câncer, com contagens mais altas de CTC indicando pior prognóstico8. Mudanças dinâmicas nos números de CTC também estão intimamente associadas à progressão da doença e à carga tumoral após o tratamento 9,10.

Estudos recentes têm destacado as tecnologias baseadas em microfluídica como ferramentas transformadoras para o isolamento de CTCs. Essas tecnologias podem ser amplamente categorizadas em abordagens físicas e biológicas, cada uma oferecendo vantagens distintas ao enfrentar desafios específicos. Os métodos baseados em física dependem de diferenças de tamanho e deformabilidade para separar as CTCs, permitindo a classificação sem rótulos com alto rendimento. No entanto, essa estratégia de separação não específica pode comprometer a eficiência e a pureza da captura devido à heterogeneidade inerente das CTCs. Por exemplo, Lu et al. relataram um chip microfluídico que integrou um projeto de separação de foco e redução de velocidade com matrizes de armadilhas, que superou a maioria das técnicas físicas convencionais em termos de enriquecimento e purificação de CTC11. No entanto, o chip alcançou apenas uma depleção de 3-4 log de glóbulos brancos (WBCs), o que permanece insuficiente para aplicações clínicas. Por outro lado, as estratégias de isolamento de CTC baseadas em imunoafinidade geralmente oferecem maior taxa de recuperação e pureza de células-alvo. No entanto, a interação de ligação entre moléculas de captura e CTCs muitas vezes limita o rendimento de tais abordagens12,13. Assim, um método de isolamento que equilibre a alta eficiência de enriquecimento e o rendimento é essencial para o processamento eficaz de amostras clínicas com populações raras de CTC.

Além disso, a heterogeneidade substancial entre as CTCs representa um desafio significativo para as análises a jusante 10,14,15, já que as análises convencionais de CTC em massa freqüentemente obscurecem as distinções celulares individuais. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) facilita a caracterização abrangente em nível molecular da heterogeneidade da expressão gênica CTC, fornecendo informações sobre a classificação, estado e função das CTCs. Essa tecnologia oferece novas abordagens para oncologia de precisão e facilita a pesquisa sobre mecanismos de iniciação, progressão e metástase do tumor16. Por exemplo, Fan et al. construíram um atlas transcriptômico de CTC única de vários locais vasculares em pacientes com carcinoma hepatocelular, revelando heterogeneidade espacial entre as CTCs e identificando os principais mediadores da evasão imunológica17. Ao mesmo tempo, Miyamoto et al. identificaram mutações genéticas no receptor de andrógeno e variantes de splice em CTCs de pacientes com câncer de próstata, elucidando assim os mecanismos subjacentes à resistência aos medicamentos18.

No entanto, o desenvolvimento do sequenciamento transcriptômico de CTC única tem progredido lentamente. As metodologias existentes sofrem de deficiências na automação e integração, resultando em baixa eficiência de recuperação de CTC, procedimentos complexos e baixas taxas de sucesso experimental19. Por exemplo, os protocolos atuais requerem um processo sequencial envolvendo enriquecimento de CTC, purificação, isolamento de célula única e amplificação de ácido nucleico. Essas etapas são executadas em tubos de centrífuga separados, necessitando de várias etapas de pipetagem e transferência. Os procedimentos trabalhosos não apenas reduzem a eficiência, mas também aumentam o risco de perda e contaminação da CTC20. Abordagens convencionais, como a coleta de células baseadas em capilares, limitam ainda mais o rendimento e a eficiência analítica durante o isolamento de uma única célula21. Além disso, os métodos tradicionais também são limitados pela distribuição de Poisson, que é um fenômeno estatístico que descreve o encapsulamento aleatório de células. Isso resulta em uma alta proporção de gotículas vazias ou várias células por gotícula, limitando assim a eficiência da captura. Para enfrentar esses desafios, os pesquisadores desenvolveram chips microfluídicos integrados para análise transcriptômica CTC de célula única. Essas plataformas consolidam várias etapas em um fluxo de trabalho de chip único, reduzindo os riscos de contaminação e melhorando a eficiência analítica. Por exemplo, Euisik Yoon et al. desenvolveram o método Hydro-Seq, que emprega seleção de tamanho baseada em dinâmica de fluidos para isolar CTCs em microcâmaras e emparelhar eficientemente CTCs individuais com microesferas com código de barrasexclusivo 22. No entanto, esse método depende da separação CTC baseada no tamanho, o que geralmente resulta em baixa pureza da CTC e rendimento limitado (10 μL/min), tornando-o inadequado para o processamento de amostras clínicas de grande volume. Portanto, há uma necessidade urgente do desenvolvimento de um sistema de análise CTC de célula única integrado, de alto rendimento, baixo volume e resistente à contaminação.

Aqui, descrevemos um protocolo eficiente e de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de célula única, compreendendo três componentes principais: classificação de CTC, purificação e um chip de sequenciamento de célula única (Figura 1). O chip microfluídico de classificação CTC é projetado com base no princípio das forças de captura magnética reguladas dinamicamente ( Figura 2A ). Ele permite o enriquecimento de CTC de alto rendimento por meio da mistura de vórtices dentro da estrutura em espinha de peixe, bem como a captura cumulativa por esferas imunomagnéticas. A liberação não destrutiva de CTCs é subsequentemente alcançada por meio da modulação precisa do campo magnético. Um chip de purificação é então empregado, onde microcanais revestidos com anticorpos leucocitários são usados para seleção negativa, produzindo CTCs altamente purificadas (Figura 2B). Finalmente, uma plataforma de manipulação de célula única de alta eficiência baseada na resistência de fluxo diferencial foi empregada, superando com sucesso as limitações da distribuição de Poisson e permitindo emparelhamento e captura eficientes de célula única / microesfera codificada (Figura 3A). Ele aumenta significativamente a utilização do CTC, reduzindo o consumo de microesferas e os custos de sequenciamento.

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Figura 1: Esquema da tecnologia de classificação CTC baseada em microfluídica e sequenciamento de célula única. Este fluxo de trabalho ilustra o processo pelo qual as células tumorais se desprendem das lesões tumorais, entram na corrente sanguínea e formam CTCs. Amostras de sangue periférico ou leucopak contendo CTCs são processadas sequencialmente por meio dos chips de captura, purificação e scRNA-seq da CTC, permitindo o sequenciamento transcriptômico e a análise de bioinformática das CTCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

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1. Método 1: Isolamento CTC baseado em microfluídica

  1. Fabricação de chips de espinha de peixe (chip HB)
    1. Preparação do molde mestre
      1. Prepare um wafer de silício limpo e leve ao forno a 135 ° C durante a noite para remover a umidade. Após o resfriamento à temperatura ambiente, trate o wafer usando um limpador de plasma de oxigênio a 150 W por 1 min para ativar a superfície.
      2. Padronize a primeira camada do chip para formar uma matriz de pilares de suporte (28 colunas × 7 linhas, numeradas de # 1 a # 28 ao longo da direção do fluxo) usando o fotorresistente SU-8. Defina o revestidor de rotação para funcionar sequencialmente a 500 rpm por 10 s, 2350 rpm por 55 s e 500 rpm por 10 s. Certifique-se de que a altura desta camada seja de 50 μm.
      3. Asse suavemente a primeira camada a 65 ° C por 1 min, seguida de 95 ° C por 20 min para evaporar o solvente. Resfrie à temperatura ambiente.
      4. Exponha a primeira camada usando uma fotomáscara com o design do pilar de suporte correspondente. Definir a dose de exposição para 130 mJ/cm2.
      5. Execute o cozimento pós-exposição a 65 ° C por 1 min, seguido de 95 ° C por 6 min.
      6. Após o resfriamento, dispense o revelador SU-8 na superfície do wafer para remover o fotorresistente não reticulado e obter a camada inferior. Deixe formar uma poça por 30 s e depois enxágue com água deionizada.
      7. Gire a segunda camada de SU-8 sobre a primeira camada usando os mesmos parâmetros de rotação da etapa 1.1.1.2. Padronize a segunda camada para formar estruturas em espinha de peixe em um ângulo de 45° em relação à parede do canal, com uma largura de ranhura de 100 μm, um passo de 200 μm e seis cristas por ciclo. Certifique-se de que a altura desta camada também seja de 50 μm.
        NOTA: Um diagrama esquemático ilustrando todas as dimensões relevantes das características da microestrutura (incluindo a matriz do pilar de suporte e as ranhuras em espinha de peixe) foi fornecido na Figura Suplementar 1.
      8. Asse suavemente a primeira camada a 65 ° C por 1 min, seguida de 95 ° C por 20 min para evaporar o solvente. Resfrie à temperatura ambiente.
      9. Exponha a segunda camada usando uma fotomáscara com o desenho em espinha de peixe. Definir a dose de exposição para 130 mJ/cm2.
      10. Execute o cozimento pós-exposição a 65 ° C por 1 min, seguido de 95 ° C por 6 min.
      11. Após o resfriamento, use o revelador SU-8 para remover regiões não reticuladas e revelar a microestrutura completa de duas camadas.
    2. Preparação de réplica do PDMS
      1. Formular a mistura PDMS combinando o pré-polímero e o reticulador numa proporção de peso de 10:1. Prepare 10-15 mL da mistura para um único chip.
      2. Despeje a mistura no molde mestre e elimine o ar preso por desgaseificação. Cure o PDMS colocando o molde em um forno a 95 °C por 30 min.
      3. Remova a réplica de PDMS curada do molde. Crie uma entrada e uma saída usando um perfurador PDMS de 1 mm de diâmetro.
    3. Montagem de chip HB
      1. Defina o limpador de plasma de oxigênio para uma potência de 150 W por 3 min. Ative as superfícies tratando a réplica do PDMS e a camada de PDMS pré-colada em uma lâmina de vidro limpa.
        NOTA: Devido à abundância de ligações Si-O nas cadeias poliméricas PDMS, a ativação do plasma permite a ligação covalente entre o PDMS e substratos como vidro, silício, facilitando assim a vedação do cavaco.
      2. Alinhe as estruturas PDMS tratadas e una-as firmemente. Confirme se a matriz de pilares de suporte e os recursos de espinha de peixe estão completamente integrados ao substrato de vidro para finalizar o chip HB.
  2. Preparação de esferas imunomagnéticas (IMBs)
    1. Incubar 25 μL de esferas magnéticas modificadas com estreptavidina lavadas e ressuspensas (SA-MBs) (1 μm) (≈4 × 108 esferas por mL) com 1 μg de anticorpo EpCAM (Molécula de Adesão de Células Epiteliais) biotinilado à temperatura ambiente com rotação a 20 rpm por 40 min para preparar os IMBs.
    2. Após a separação magnética em um rack magnético, remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos em 25 μL de tampão de isolamento (1% BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Operação de chip de isolamento
    1. Pipete 20 μL da suspensão magnética dentro de 1-2 s, garantindo que não sejam introduzidas bolhas de ar.
    2. Coloque imediatamente o chip verticalmente em um ímã e deixe as contas assentarem por 5 min sem perturbação.
    3. Colete a amostra de sangue (sangue periférico ou amostras experimentais de leucopak) e retire imediatamente 4 mL em uma seringa, garantindo que as bolhas de ar sejam removidas. Sele a entrada e a saída do chip com líquido para eliminar bolhas de ar. Insira os tubos de entrada e saída de amostra no chip.
      NOTA: Certifique-se de que as medidas básicas de proteção individual estejam em vigor ao manusear amostras biológicas.
    4. Injete a amostra por bomba de seringa com uma vazão de 1,5 mL / h.
    5. Após o carregamento da amostra, injete 60 μL de D-PBS no chip HB a uma taxa de fluxo de 0,2 mL / h para lavar as células não ligadas.
    6. Remova o ímã e injete manualmente 1,5 mL de BSA (5% p / v em D-PBS) para lavar o chip e liberar as células tumorais capturadas do chip HB.

2. Método 2: Purificação CTC baseada em microfluídica

  1. Modificação do chip HB
    1. Preparar uma solução de trimetoxissilano (3-mercaptopropil) (MPTS) em etanol com uma fracção volumétrica (v/v) de 10%. Introduza imediatamente 20 μL de solução MPTS no chip HB e incube em temperatura ambiente por 1 h.
    2. Enxaguar uma vez com etanol anidro e secar a 100 °C durante 1 h.
    3. Preparar uma solução de éster N-γ-maleimidobutiril-oxisuccinimida (GMBS) em etanol a uma concentração de 0,5 mg/ml. Resfrie o chip a 37 °C, introduza a solução GMBS e incube em temperatura ambiente por 30 min.
      NOTA: Ao usar MPTS e GMBS, sempre use luvas, jaleco e máscara. Esses reagentes possuem propriedades tóxicas e irritantes da mucosa e devem ser manuseados com cuidado em uma área bem ventilada.
    4. Enxágue duas vezes com ddH2O, seguido de dois enxágues com D-PBS.
    5. Adicione imediatamente 15 μg/mL de estreptavidina (SA), incube à temperatura ambiente por 1 h ou durante a noite a 4 °C.
    6. Enxágüe duas vezes com D-PBS.
    7. Prepare o tampão do anticorpo CD45: 0,2% (p / v) BSA e 20 μg / mL de anticorpo CD45 biotinilado, diluído em volume com D-PBS.
    8. Injete 20 μL do tampão de anticorpo CD45 no chip HB para seleção negativa de glóbulos brancos. Incube em temperatura ambiente por 1 h e depois enxágue com D-PBS.
    9. Adicione uma solução de bloqueio contendo 3% (p / v) de BSA e 0,05% (p / v) de Tween-20, incube em temperatura ambiente por 1 h. Enxágüe com D-PBS antes do carregamento da amostra.
  2. Carregamento de amostras
    1. Aspire a amostra usando uma seringa, garantindo que as bolhas de ar sejam removidas. Sele a entrada e a saída do chip com líquido para eliminar bolhas de ar. Insira os tubos de entrada e saída de amostra no chip.
    2. Injete a amostra por bomba de seringa e ajuste a taxa de fluxo para 0,6 mL / h.
    3. Colete as células tumorais purificadas da saída para contagem e sequenciamento de célula única.

3. Método 3: Tecnologia de codificação e sequenciamento de célula única baseada em micropoços

  1. Preparação de reagentes e materiais
    1. Pré-tratamento de cavacos
      1. Adicione 200 μL de 1x D-PBS e solução de F-68 a 0,5% à entrada do cavaco.
      2. Execute a sonicação em banho-maria enquanto segura o chip. Quando as bolhas forem visíveis em toda a região microporosa, continue a sonicação por 30 s para remover as bolhas dos poços duplos.
    2. Preparação de contas com código de barras
      1. Misture bem a solução estoque de contas magnéticas com código de barras e transfira 200 μL para um tubo de centrífuga. Aplique a separação magnética até que a solução clareie e descarte o sobrenadante.
      2. Lave as contas com código de barras duas vezes com 500 μL de TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8.0, 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20).
      3. Lave e ressuspenda as esferas com código de barras em 200 μL de 20x TE (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA) e 50 mM de solução DTT e coloque no gelo.
    3. Preparação da suspensão unicelular
      1. Transfira as células tumorais purificadas para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 400 × g por 3 min em temperatura ambiente. Lave e ressuspenda o pellet em 1 mL de 1x D-PBS.
      2. Realize a contagem de células e prepare a suspensão de célula única de acordo. O volume de carga da amostra deve ser de 200 μL, com um total de 80.000 células (400 células/μL).
    4. Prepare o tampão de lise celular, que inclui 1x Citrato de Sódio Salino (SSC), 0.5 M LiCl, 0.6% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT e 1 U/μL inibidor de RNase.
  2. Operação microfluídica de cavacos
    1. Captura de células
      1. Injete 200 μL da suspensão de células tumorais no chip (60000 poços duplos) e, em seguida, agite a 10 rpm em um agitador descolorante por 5 min para permitir que as células se assentem nos poços de captura por gravidade.
      2. Pipete suavemente a suspensão celular no chip para cima e para baixo duas vezes. Em seguida, coloque o chip em um agitador descolorante a 10 rpm por 5 min para ressuspender as células não capturadas e permitir que elas se assentem novamente.
      3. Adicione 200 μL de solução 1x D-PBS e 0,5% de F-68 através da entrada e aspire a solução da saída. Repita duas vezes para um total de três lavagens do chip.
    2. Captura de contas com código de barras
      1. Ressuspenda a suspensão do cordão com código de barras e, em seguida, injete imediatamente 200 μL da suspensão no chip através da entrada. Agite a 10 rpm por 20 s.
      2. Pipete suavemente a suspensão do talão duas vezes e agite a 10 rpm por 20 s. Repita esta etapa uma vez.
      3. Retire a suspensão de esferas com código de barras da saída, adicione 200 μL de 20x TE (pH = 7,5) e 50 mM de solução DTT e, em seguida, retire o líquido da saída. Repita esta etapa duas vezes, para um total de três lavagens.
    3. Lise celular e captura de mRNA
      1. Adicione lentamente 200 μL do tampão de lise celular ao chip através da entrada. Imediatamente depois, adicione lentamente 200 μL de óleo mineral para selar os poços duplos.
        NOTA: A vedação deve ocorrer imediatamente para evitar contaminação.
      2. Remova a solução que sai da saída de cavacos para o reservatório de resíduos. Coloque o chip horizontalmente e deixe repousar em temperatura ambiente por 5 min.
    4. Recuperação de contas com código de barras
      1. Após a lise, adicione lentamente 200 μL de 6x SSC através da entrada, remova o líquido residual e aspire a solução restante da saída do cavaco.
      2. Adicione lentamente 200 μL de 6x SSC para preencher o chip. Segure um ímã próximo à superfície do chip e mova-o lentamente da entrada para a saída para coletar contas com código de barras dos poços de captura. Em seguida, aspire rapidamente a solução, bem como os grânulos com código de barras do chip em um tubo de centrífuga pré-carregado com 6x SSC.
      3. Lave três vezes com 200 μL de 6x SSC, seguido de uma vez com 1x tampão RT (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Transcrição reversa (RT), tratamento com exonuclease I e reação em cadeia da polimerase
    1. RT
      1. Ressuspenda os grânulos com código de barras em 100 μL de mistura de reação de transcrição reversa, contendo 1× tampão RT, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 2.5 μM Template Switch Oligo (consulte a Tabela de Materiais), 1 U/μL de inibidor de RNase e 10 U/μL de transcriptase reversa. Incubar a solução a 42 °C durante 120 min.
    2. Tratamento com exonuclease
      1. Após a transcrição reversa, lave os grânulos uma vez com 200 μL de 1x TE-SDS (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS), uma vez com 200 μL de 1x TE-TW e uma vez com 200 μL de 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Ressuspenda os grânulos em 100 μL de mistura de exonuclease, contendo 1x tampão de exonuclease I e 1 U / μL de exonuclease I, e incube a 37 ° C por 45 min.
    3. Síntese de segunda fita
      1. Lave os grânulos uma vez com 200 μL de 1x TE-SDS. Ressuspenda os grânulos em 200 μL de NaOH 0,1 M e incube por 5 min à temperatura ambiente com rotação a 30 rpm para desnaturar o produto híbrido mRNA-cDNA. Em seguida, lave os grânulos uma vez com 200 μL de 1x TE-TW e uma vez com 200 μL de Tris-HCl 10 mM (pH = 8,0).
      2. Ressuspenda os grânulos em 100 μL da mistura de reação, contendo 1x tampão RT, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 0,5 μM de primer de síntese de segunda fita (consulte a Tabela de Materiais) e 0,125 U/μL de Fragmento de Klenow. Incubar a solução a 37 °C durante 60 min.
    4. amplificação de cDNA
      1. Lave as esferas uma vez com 200 μL de 1x TE-SDS, uma vez com 200 μL de 1x TE-TW e uma vez com 200 μL de Tris-HCl 10 mM (pH = 8,0).
      2. Ressuspenda os grânulos em 150 μL de mistura de PCR, incluindo 1x mistura de reação de PCR e 0,8 μM de oligo ISPCR (consulte a Tabela de Materiais). Defina o programa de PCR da seguinte forma: 95 °C por 3 min; quatro ciclos de 98 °C por 20 s, 65 °C por 30 s e 72 °C por 3 min; oito ciclos de 98 °C por 20 s, 67 °C por 20 s e 72 °C por 3 min; 72 °C durante 5 min.
      3. Purifique o produto de PCR duas vezes com esferas magnéticas de imobilização reversível em fase sólida (SPRI) 0,6x para purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante e elua em 20,5 μL de H2O. Meça a concentração do produto de PCR purificado usando um ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência.
      4. Realize uma segunda amplificação do produto de PCR purificado usando uma mistura de PCR contendo 1x mistura de reação de PCR e 0.8 μM de oligo ISPCR (consulte a Tabela de Materiais). Defina o programa de PCR da seguinte forma: 98 °C por 3 min; cinco ciclos de 98 °C por 20 s, 67 °C por 20 s e 72 °C por 3 min; 72 °C durante 5 min.
      5. Purifique o produto de PCR duas vezes com esferas magnéticas de SPRI 0,6x para purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante e elua em 20,5 μL de H2O. Meça a concentração do produto de PCR purificado usando um ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência23.
    5. Construção da biblioteca de cDNA
      1. Construa a biblioteca com um kit de preparação de biblioteca de DNA padrão (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Amplifique a biblioteca por PCR usando o par de primers N70X / P5 (consulte a Tabela Suplementar). Defina o programa de PCR da seguinte forma: 72 °C por 3 min; 98 °C durante 30 s; doze ciclos de 98 °C por 15 s, 58 °C por 30 s e 72 °C por 3 min; 72 °C durante 5 min.
      3. Purifique a biblioteca com esferas magnéticas SPRI 0,6x para purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante e elua em 20 μL de H2O. Meça a concentração do produto de PCR purificado usando um ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência.
        NOTA: Geralmente, uma concentração final da biblioteca de DNA de ≥ 2 ng/μL e uma quantidade total de ≥ 50 ng é considerada aceitável24.

Results

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A montagem e liberação da interface de captura de CTC podem ser avaliadas por microscopia. Uma distribuição uniforme dos grânulos magnéticos (MBs) na parte inferior do chip HB sob um campo magnético indica uma montagem bem-sucedida, enquanto MBs residuais mínimos ou inexistentes confirmam a liberação bem-sucedida (Figura 2C). Esta etapa é crítica para determinar o rendimento e a pureza dos CTCs capturados. Para validar a eficiência de captura do chip de isolamento CTC, realizamos um experimento de pico. Um pequeno número de células tumorais com alta expressão de EpCAM (PC3 ou LNCaP) foi enriquecido em PBS contendo uma grande população de células Jurkat, que exibem baixa expressão de EpCAM, simulando a presença de células sanguíneas abundantes em circulação. O chip de isolamento CTC capturou com eficiência células tumorais de amostras de 1 mL e 10 mL, demonstrando seu alto rendimento e capacidade eficiente de classificação CTC (Figura 2D). Para avaliar a especificidade da captura baseada em IMB, usamos um chip de controle modificado com SA-MBs sem conjugação de anticorpos EpCAM. A ausência de captura significativa de células tumorais confirmou a especificidade do isolamento da CTC mediada por IMB (Figura 2D).

Além da eficiência de captura, a pureza é outro parâmetro crítico para avaliar as plataformas de isolamento CTC. Comparamos a pureza das células tumorais isoladas usando o chip de captura ou o chip de purificação sozinho, bem como a pureza alcançada por meio de seleção positiva e negativa sequencial (Figura 2E). Ambos os chips melhoraram significativamente a pureza das células tumorais em comparação com o grupo controle, demonstrando sua eficácia no isolamento de CTCs. Mais importante, o uso combinado de seleção positiva e negativa aumentou ainda mais a pureza e o rendimento das células tumorais em comparação com o uso de um único método.

Para avaliar melhor o desempenho dos chips de captura e classificação do CTC em ambientes clínicos, coletamos amostras de sangue periférico (PB) de seis doadores saudáveis e conduzimos experimentos de cravação. Dada a abundância extremamente baixa de CTCs em amostras clínicas, aproximadamente 500-1000 células LNCaP foram cravadas em cada amostra de 10 mL de PB. As contagens de leucócitos em todas as amostras de PB coletadas estavam dentro da faixa normal (4-10 × 106 células/mL). Os resultados demonstraram que o sistema de triagem CTC manteve alta eficiência de captura e pureza de células tumorais, mesmo durante o processamento de amostras clínicas (Figura 2F-G e Figura Suplementar 2).

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Figura 2: Plataforma de captura e purificação CTC estruturada em espinha de peixe. (A) Fluxo de trabalho do chip de isolamento CTC. Primeiro, um campo magnético estável e IMBs conjugados com anticorpos EpCAM montam a interface de captura. Em seguida, a mistura de vórtices dentro do chip HB aumenta a eficiência da transferência de massa entre CTCs e IMBs, facilitando a captura acumulada. Finalmente, a liberação suave de CTCs é alcançada removendo o campo magnético. (B) Fluxo de trabalho do chip de purificação CTC. O chip HB é modificado com anticorpos de seleção negativa e a mistura de vórtices facilita ainda mais as interações leucócitos-anticorpos, produzindo CTCs altamente purificadas. Barra de escala, 100 μm. (C) A imagem microscópica demonstra a montagem e liberação bem-sucedidas do chip de captura. (D) Os gráficos de barras comparam a eficiência de captura CTC da plataforma de isolamento em diferentes volumes de amostra, usando SA-MBs não funcionalizados como controle. Barras de erro, média ± DP, n = 3. (E) Os gráficos de barras comparam a pureza das CTCs obtidas usando apenas um único chip HB versus aquelas submetidas a captura e purificação sequenciais. O grupo controle representa a pureza da CTC não tratada. Barras de erro, média ± DP, n=3. (F) Identificação de células no chip de isolamento CTC. As células LNCaP foram coradas com Hoechst e Calcein AM, enquanto as células sanguíneas foram coradas apenas com Hoechst. Barra de escala, 100 μm. (G) Pureza das células tumorais e eficiência de captura em experimentos de pico usando 1 mL ou 10 mL de sangue periférico. Barras de erro, média ± DP, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As células tumorais isoladas foram posteriormente submetidas a sequenciamento de célula única de alto rendimento. Nosso protocolo incorpora um sistema de código de barras de célula única que consiste em 60.000 micropoços aninhados (Figura 3A-B). Os micropoços inferiores em forma de quadrado servem para capturar células individuais, enquanto os micropoços superiores são projetados para carregamento de contas. Cada micropoço inferior mede 25 μm de comprimento, largura e altura, adequado para a maioria dos tipos de células. Os poços hexagonais superiores têm um diâmetro de círculo inscrito e altura de 50 μm para acomodar grânulos que normalmente variam de 30 a 50 μm. O sistema aumenta a eficiência da captura de células com base na captura cumulativa, evitando duplicatas de células por meio dos micropoços de exclusão de tamanho. Para otimizar o protocolo de carregamento celular, investigamos a eficiência de captura celular e a taxa de ocupação de micropoços sob diferentes condições de entrada celular (Figura 3C). Os resultados mostraram que o aumento da entrada celular não diminuiu a eficiência de captura; em vez disso, aumentou significativamente a taxa de ocupação. Para o chip de captura de 60.000 poços, a taxa de ocupação de micropoços se estabilizou quando a entrada da célula atingiu 80.000, não mostrando nenhum aumento adicional com a entrada adicional. Para minimizar a ocorrência de dupletos devido à carga excessiva de células, selecionamos 80.000 células como a entrada ideal. Conforme mostrado na Figura 3D, o chip de código de barras de célula única alcançou uma taxa de ocupação de 85,6% de células e 95,7% de contas com código de barras, resultando em uma taxa de emparelhamento de 81,9%. Além disso, foram realizados múltiplos assentamentos de acordo com o protocolo, o que melhorou significativamente a eficiência de captura e a taxa de pareamento por meio do efeito de captura cumulativa (Figura 3D). Notavelmente, a diferença observada nas taxas de ocupação entre células e grânulos é atribuída à maior densidade e massa dos grânulos em comparação com as células, o que permite que eles se acomodem com mais eficiência nos micropoços sob gravidade. Portanto, sob condições de carregamento otimizadas, uma taxa de ocupação de emparelhamento de aproximadamente 80% é geralmente considerada ideal.

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Figura 3: Tecnologia de codificação de barras e sequenciamento de célula única de alto rendimento baseada em micropoços. (A) Fluxo de trabalho do protocolo de sequenciamento CTC único. (B) A microcópia demonstra estruturas microfluídicas de poços de captura de esferas de célula única/código de barras. Os processos de captura de células, captura de contas e recuperação de contas são mostrados da esquerda para a direita. Barra de escala de 30 μm. (C) Os gráficos de linha ilustram a eficiência de captura de células e a taxa de ocupação de micropoços do chip de código de barras de célula única (60000 poços duplos) sob diferentes condições de entrada de células. (D) Taxas de ocupação de células e contas com código de barras sob condições otimizadas de entrada de células, juntamente com a proporção de emparelhamento célula-grânulo correspondente. Os painéis esquerdo e direito mostram a abordagem de captura utilizando várias tentativas de assentamento e apenas assentamento único, respectivamente. Barras de erro, média ± DP, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, para validar o protocolo integrado para classificação de CTC e scRNA-seq, misturamos células PC3, LNCaP e Jurkat em uma proporção estimada de 1:3:4000 e as carregamos nos chips microfluídicos para captura de células tumorais, purificação e sequenciamento de célula única. Através da eficiente plataforma de isolamento de células tumorais, obtivemos células tumorais positivas para EpCAM de alta pureza (Figura 4B). Ao mesmo tempo, o chip scRNA-seq baseado em microfluídica demonstrou capacidade precisa de perfil de tipo de célula, com os resultados visualizados por meio da análise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) (Figura 4A). Identificamos com sucesso três populações de células distintas, cada uma das quais poderia ser distinguida por marcadores únicos (Figura 4C). Além disso, as proporções de células na saída final corresponderam às da entrada purificada, confirmando que o processo de código de barras de célula única era imparcial e livre de contaminação (Figura 4B). Um cluster foi identificado como células Jurkat com base na expressão específica de TRBC1, IGLL1, CD1E e CD3D (Figura 4D). A análise de enriquecimento da via confirmou ainda mais a robustez dessa classificação (Figura 4E). Além disso, as duas linhagens celulares de câncer de próstata foram distintamente separadas em grupos individuais de acordo com genes diferencialmente expressos (DEGs) (Figura 4F-G). O cluster PC3 foi caracterizado por alta expressão de microsseminoproteína (MSMP), também conhecida como microproteína secretada por PC3. Por outro lado, o cluster LNCaP expressou exclusivamente marcadores relacionados à adesão, proliferação e pluripotência celular, como NEDD4, CTNNA1 (α-catenina 1) e RBBP7.

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Figura 4: Validação da classificação CTC e sequenciamento de célula única usando um experimento spike-in. (A) Gráfico t-SNE mostrando o perfil do tipo de célula das células capturadas e purificadas. (B) Gráfico de barras representando as proporções dos três tipos de células em três estágios: entrada inicial, pós-purificação e saída de sequenciamento final. (C) Gráfico de pontos ilustrando a expressão de genes marcadores únicos em diferentes aglomerados de células. (D) Níveis de expressão de TRBC1, IGLL1, CD1E e CD3D em todas as células. (E) Análise de enriquecimento das vias GO e KEGG de genes diferencialmente expressos (DEGs) no cluster Jurkat. (F) Padrões de expressão de NEDD4 e MSMP em todas as células. (G) Gráfico de vulcão mostrando DEGs entre os clusters PC3 e LNCaP. Os pontos vermelhos representam genes regulados positivamente em PC3; os pontos azuis representam aqueles regulados positivamente em LNCaP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mistura mestreReagenteDiluição finalTipo de buffer
0,5% F-68F-680.50%Água tratada DEPC
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8,0)10 mMÁgua tratada DEPC
EDTA1 mM
Interpolação-200.01%
20× TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7,5)200 mMÁgua tratada DEPC
EDTA20 mM
TE-SDSTris-HCl (pH=8,0)10 mMÁgua tratada DEPC
EDTA1 mM
SDS0.50%

Tabela 1: Composição da mistura de reagentes para preparação de sequenciamento de CTC única. São mostradas partes dos reagentes necessários para o scRNA-seq, que podem ser preparadas antes da operação do chip para garantir um processo rápido e suave.

Figura suplementar 1: Design para o chip HB. (A) Diagrama esquemático da estrutura microfluídica de duas camadas. Superior: Camada superior com a estrutura em espinha de peixe. Uma inserção ampliada mostra a geometria detalhada da espinha de peixe, que é orientada em um ângulo de 45° em relação à parede do canal, com uma largura de ranhura de 100 μm e um passo de 200 μm. Inferior: Camada inferior composta por uma matriz de pilares de suporte (28 colunas × 7 linhas), numerada de #1 a #28 ao longo da direção do fluxo. (B) Vista lateral do chip espinha de peixe. Os sulcos em espinha de peixe têm uma largura de 100 μm. As alturas das estruturas em espinha de peixe e dos pilares de suporte são de 50 μm. (C) Vista superior do chip em espinha de peixe. Cada pilar de suporte mede 500 μm de largura e 1150 μm de comprimento, com uma folga de 550 μm entre os pilares adjacentes. (D) Fotografia do chip HB fabricado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Imagem representativa mostrando células tumorais e células sanguíneas coradas com fluorescência presentes no fluido residual coletado da saída do chip de isolamento CTC. As células LNCaP foram coradas com Hoechst e Calcein AM, enquanto as células sanguíneas foram coradas apenas com Hoechst. Barra de escala 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar: Sequências de oligonucleotídeos usadas na transcrição reversa e preparação da biblioteca Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

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As CTCs servem como biomarcadores valiosos para o diagnóstico do câncer, orientação do tratamento e estudos sobre iniciação, progressão e metástase do tumor25. No entanto, os métodos de isolamento CTC existentes não conseguem alcançar alta eficiência e alto rendimento26. Além disso, a baixa eficiência de liberação das CTCs geralmente resulta em baixa pureza e alto dano celular, limitando sua compatibilidade com análises a jusante27. Aqui, propusemos um protocolo integrado para classificação de CTC de alto rendimento e sequenciamento de CTC único, consistindo em três procedimentos principais: captura de CTC, purificação e scRNA-seq.

Essa plataforma baseada em microfluídica oferece flexibilidade e escalabilidade. O número de canais paralelos nos chips HB, bem como os poços de captura no chip de código de barras, podem ser ajustados de acordo com diferentes requisitos de amostra, atendendo assim às demandas de alto rendimento. No chip de captura CTC, os IMBs podem ser otimizados de acordo com o tipo específico de câncer. Por exemplo, em amostras de pacientes com câncer de próstata, os IMBs podem ser funcionalizados com um coquetel de anticorpos EpCAM e PSMA para aumentar a eficiência da captura. Além disso, confiar apenas na captura baseada em EpCAM pode resultar na perda de CTCs mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal (EMT). Para resolver esse problema, anticorpos adicionais contra a proteína de choque térmico 70 (HSP-70) ou a vimentina da superfície celular (CSV) podem ser incorporados para capturar CTCs em diferentes estágios de EMT.

Como os chips HB para captura e purificação de CTC são baseados em microfluídica, o manuseio cuidadoso é essencial durante os experimentos. Antes de introduzir reagentes na entrada do cavaco, todas as bolhas de ar devem ser removidas e tanto a entrada quanto a saída podem ser vedadas para eliminar o ar preso. Além disso, os reagentes devem ser introduzidos rapidamente (dentro de 1-2 s), pois bolhas de ar presas podem obstruir a passagem de IMBs e células, reduzindo significativamente a eficiência e a pureza da captura. Além disso, como mencionado anteriormente, a distribuição uniforme de IMBs é crítica para a captura bem-sucedida de CTC. Depois de carregar os IMBs, o chip deve ser colocado verticalmente no ímã e fixado na posição por pelo menos cinco minutos para evitar que mudanças no campo magnético interrompam a distribuição do IMB. Notavelmente, a taxa de fluxo de carregamento de células especificada no protocolo deve ser otimizada com base em diferentes tipos de amostra. Por exemplo, amostras de leucopak exibem níveis elevados de concentração e viscosidade de leucócitos. Se a taxa de fluxo for muito rápida, pode dificultar interações eficientes entre CTCs e IMBs, impedindo a captura magnética acumulada e, assim, reduzindo a pureza da CTC. Para avaliar o desempenho de nossa plataforma de isolamento e purificação de CTC no processamento de amostras de sangue clínicas, coletamos PB de vários doadores saudáveis e colocamos um pequeno número de células LNCaP (aproximadamente 50-100 células por mL) nas amostras. Notavelmente, embora a plataforma tenha exibido alta eficiência de captura e pureza para células tumorais em amostras de PB, seu desempenho foi ligeiramente inferior ao observado nas amostras de células baseadas em PBS (Figura 2D, Figura 2E e Figura 2G). Especulamos que essa discrepância se deva à maior viscosidade do sangue e à presença de glóbulos vermelhos e plaquetas abundantes em comparação com o PBS. Portanto, ao manusear amostras de sangue clínicas, as etapas de pré-tratamento, como lise de glóbulos vermelhos ou extração de PBMC, podem ser consideradas para melhorar o desempenho.

Semelhante aos chips HB, o chip de código de barras de célula única baseado em microfluídica requer manuseio cuidadoso para evitar a formação de bolhas de ar. Dada a variedade de reagentes envolvidos, alguns reagentes podem ser pré-preparados antes de iniciar as operações do chip (Tabela 1). Ao carregar células e grânulos, é necessário um controle cuidadoso da velocidade de injeção para garantir uma distribuição uniforme, pois as células têm uma densidade mais baixa, enquanto os grânulos com código de barras são mais densos. Normalmente, a suspensão celular deve ser adicionada lentamente ao longo de 3 ~ 5 s, seguida pela adição rápida da suspensão do cordão dentro de 1 ~ 2 s. Depois de carregar as células e os grânulos, execute duas rodadas de aspiração e dispensação e, em seguida, coloque o chip em um agitador para concluir o processo de captura cumulativa. Esta etapa é fundamental para melhorar a taxa de ocupação e a taxa de emparelhamento. Durante a lise celular, um método de vedação de óleo é usado para isolar as superfícies dos micropoços, evitando a contaminação cruzada entre os poços. Notavelmente, o óleo mineral deve ser adicionado imediatamente após a lise sem demora. Após a lise, a recuperação do cordão com código de barras é realizada movendo lentamente o ímã da entrada para a saída para garantir uma alta taxa de recuperação do grânulo. Se necessário, esta etapa pode ser repetida várias vezes. Finalmente, as esferas magnéticas recuperadas no tubo da centrífuga passam por RT, síntese de segunda fita, amplificação de PCR e construção de biblioteca, seguidas de sequenciamento de próxima geração (NGS).

Esta plataforma microfluídica integrada possui um potencial significativo para aplicações clínicas. Ao aumentar a eficiência e o rendimento do isolamento da CTC, aumenta a detecção de CTC em estágios de baixa carga tumoral, permitindo o estabelecimento de um modelo de classificação que vincula a contagem de CTC ao estadiamento do tumor. Esse avanço fornece uma nova abordagem para diagnóstico de câncer, monitoramento de tratamento, avaliação de prognóstico e previsão de recorrência. Além disso, a análise transcriptômica de célula única de CTCs permite a identificação de características moleculares importantes, incluindo vias gênicas essenciais, redes de interação e genes biomarcadores. Esta análise fornece informações sobre os fatores críticos que impulsionam a metástase precoce do câncer e revela os mecanismos moleculares subjacentes à formação de lesões metastáticas, oferecendo potenciais alvos terapêuticos para pacientes com câncer recorrente ou metastático. Além disso, esta plataforma é altamente escalável. Ele pode ser adaptado para atender a requisitos analíticos específicos e expandido para suportar análises multiômicas, incluindo transcriptômica e genômica.

Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant Nos. 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Mercaptopropil) trimetoxisilano Sigma Aldrich175617-100GSolução MPTS
20 e vezes; SSC BufferSangon BiotechB548109-0200
5 e vezes; RT BufferSangon BiotechB610020-0500
Anticorpo monoclonal Biotinilado CD45eBiociência13-0459-82Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Anticorpo monoclonal EpCAM biotiniladoeBiociência13-9326-82Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Albumina sérica bovina (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Chip de cartucho DECODERBiossistemas Dinâmicos2203106Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Kits de reagentes de cartucho DECODERBiossistemas Dinâmicos2203206Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Água Tratada DEPCSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Contém: NaCl 136,89mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,10 mM; KH2PO4 1,47 mM. pH=7,2-7,4 
DTTTermo CientíficaR0861Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MBs, 1 e mu; m
EDTASangon BiotechB540625-05000,5 M, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012 vezes; Mistura de Reação PCR
Precipitação de cloreto de lítio soln.InvitrogenAM94800.2 & micro; M filtrado
N-γ-éster maleimidobutiril-oxisuccinimidaTermo Científica22309Solução GMBS
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1 e vezes; Kit de Ensaio HS dsDNATermo CientíficaP33231
Solução SDSSangon BiotechB648118-010010% SDS
StreptavidinaSigma Aldrich189730Armazenamento em 2° De C a 8°°; C 
Fotorresiste SU-8MicroquímicaSU-8 3050
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7,5)LEAGENENR00721 mol/L, pH=7,5, sem RNase
Tris-HCl (pH 8.0)LEAGENENR00731 mol/L, pH=8,0, livre de RNASE
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina VazymeTD502Kit de preparação de biblioteca de DNA
Pré-adolescente-20Sangon BiotechA600560-0500
Contas Limpas de DNA VAHTSVazymeN411Esferas magnéticas de Imobilização Reversível em Fase Sólida (SPRI) para purificação de DNA

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