Metabolômica espacial multimodal com imagens de espectrometria de massa guiadas por microscópio infravermelho médio

Resumo

Apresentamos um fluxo de trabalho metabolômico espacial multimodal que integra imagens de espectrometria de massa (MSI) e imagens de infravermelho médio (MIR) na mesma seção de tecido para análise metabólica e bioquímica espacialmente resolvida.

Resumo

A metabolômica espacial é um campo em rápida evolução para mapear a distribuição de metabólitos dentro de tecidos, órgãos e até células individuais. Essa abordagem fornece informações metabólicas contextuais, que são críticas para a compreensão da heterogeneidade bioquímica dos sistemas biológicos. A imagem de infravermelho médio (MIR) e a imagem de espectrometria de massa (MSI) surgiram como abordagens poderosas para metabolômica espacial, cada uma oferecendo vantagens únicas e complementares. Neste estudo, apresentamos um fluxo de trabalho para a realização de imagens MIR e MSI DE IONIZAÇÃO POR DESSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ (MALDI-MSI) na mesma seção de tecido, abrangendo procedimentos experimentais, co-registro de imagem, integração de dados e análise de bioinformática. A imagem MIR é empregada como a modalidade a montante, permitindo a análise bioquímica não destrutiva dos tecidos. Posteriormente, uma matriz é depositada no tecido para MALDI-MSI, guiada pelas informações espaciais obtidas a partir da imagem MIR. As imagens são integradas após o co-registro, permitindo a análise metabolômica espacial multimodal usando ferramentas avançadas de bioinformática, como o Seurat. A integração de imagens MIR e MSI representa um avanço transformador na metabolômica espacial, oferecendo oportunidades sem precedentes para explorar a complexidade espacial e química dos processos metabólicos na saúde e na doença. Essa abordagem multimodal tem um potencial significativo para impulsionar inovações na descoberta de biomarcadores, diagnóstico de doenças e desenvolvimento terapêutico.

Introdução

A metabolômica espacial envolve o mapeamento de metabólitos dentro de seu contexto de tecido nativo, integrando imagens de espectrometria de massa (MSI) ou outras técnicas espacialmente resolvidas, com análise metabólica, oferecendo insights sobre o metabolismo em resolução subtecidual, celular ou subcelular 1,2,3,4,5,6,7,8 . Entre essas modalidades de imagem, a microscopia de infravermelho médio (MIR) está ganhando cada vez mais atenção por sua capacidade de mapear quimicamente biomoléculas com base no contraste vibracional molecular 4,7,9,10,11,12. A natureza não destrutiva, sem rótulos, de alta velocidade e econômica 4,7,9,10,11,12 torna a imagem MIR particularmente adequada para integração com MSI, formando uma abordagem multimodal promissora para análise espacial abrangente.

A ionização por dessorção a laser assistida por matriz MSI (MALDI-MSI) é uma das técnicas mais utilizadas em metabolômica espacial (Figura 1A)¹³. Permite a detecção de uma ampla gama de metabólitos, incluindo lipídios, aminoácidos, açúcares, nucleotídeos e metabólitos secundários, com alta sensibilidade¹. Avanços na seleção de matrizes (por exemplo, ácido 2,5-dihidroxibenzóico [DHB], 9-aminoacridina [9AA] ou dicloridrato de N- (1-naftil) etilenodiamina [NEDC]) e técnicas de ionização (por exemplo, métodos pós-ionização) expandiram ainda mais a cobertura de detecção, particularmente para espécies de baixa abundância e pouco ionizáveis¹⁴. Os sistemas MALDI-MSI modernos suportam velocidades de imagem que normalmente variam de 5 a 50 pixels por segundo, dependendo da resolução espacial e do tipo de analisador de massa usado (por exemplo, tempo de voo [TOF], Orbitrap ou ressonância ciclotron de íons com transformada de Fourier [FT-IRC]). Notavelmente, os instrumentos MALDI-TOF de alta velocidade alcançaram taxas superiores a 100 pixels por segundo, permitindo imagens de grande área em poucas horas¹⁵. A resolução espacial do MALDI-MSI geralmente fica entre 5 a 50 μm, suficiente para resolver estruturas celulares e mesmo subcelulares^16,17. No entanto, uma resolução espacial mais alta normalmente vem ao custo de tempos de aquisição mais longos, relação sinal-ruído reduzida e maiores demandas computacionais durante o processamento de dados.

Ao contrário da MSI, a imagem MIR é uma abordagem óptica de campo amplo⁴, tornando-a inerentemente não destrutiva e de alto rendimento. Avanços recentes em lasers quânticos em cascata de alta potência (QCLs) permitem uma nova estrutura conhecida como imagem infravermelha de frequência discreta (DFIR), que aumenta significativamente a velocidade da imagem até a taxa de vídeo (Figura 1B) ^{12 , 18} . Além disso, as fontes de QCL tornaram os detectores de microbolômetro não resfriados viáveis para imagens MIR, permitindo o uso de detectores de matriz de plano focal (FPA) maiores¹². Como resultado, uma imagem MIR de frequência única em uma área de 1 cm² pode ser adquirida com resolução celular (~ 5 μm) em apenas alguns segundos. A imagem MIR pode operar nos modos sem rótulo e rotulado. Em estudos anteriores ^4,19,20, pequenas sondas vibracionais ativas em infravermelho foram introduzidas para monitorar a cinética de várias atividades metabólicas in situ. Essas sondas permitem o rastreamento em tempo real das vias metabólicas, relatando transformações químicas globais por meio de bandas espectrais MIR exclusivas⁴. Assim, a imagem MIR fornece perfil bioquímico estático e monitoramento metabólico dinâmico com alta resolução espacial e velocidade de aquisição rápida.

Neste manuscrito, apresentamos um fluxo de trabalho abrangente para realizar metabolômica espacial MALDI-MSI guiada por MIR, demonstrando a viabilidade de adquirir ambas as modalidades do mesmo espécime (Figura 2, Figura 3). Ao integrar a imagem MIR com a MSI, estabelecemos uma abordagem multimodal que aproveita os pontos fortes complementares de cada técnica. A imagem MIR oferece mapeamento bioquímico rápido e sem marcação de toda a lâmina na resolução celular, servindo como um guia valioso para a seleção da região de interesse (ROI) na aquisição subsequente do MSI. Essa estratégia permite um fluxo de trabalho MSI mais direcionado e eficiente, reduzindo o tempo e o custo de aquisição, ao mesmo tempo em que aprimora a interpretabilidade e a relevância biológica dos dados metabolômicos espaciais. Por sua vez, o MSI fornece anotações moleculares altamente detalhadas das imagens hiperespectrais do MIR, permitindo uma compreensão mais profunda da bioquímica do tecido. No geral, essa abordagem integrada tem grande potencial para o avanço da descoberta de biomarcadores, diagnóstico de doenças e desenvolvimento terapêutico.

Protocolo

O protocolo foi conduzido de acordo com o protocolo experimental animal (DSF-2024-004) aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Recursos de Animais de Laboratório da Universidade de Fudan.

NOTA: Este estudo fornece um fluxo de trabalho para realizar imagens MIR e MALDI-MSI na mesma seção de tecido. Essa abordagem integrada abrange procedimentos experimentais, co-registro de imagens, fusão de dados e análise de bioinformática a jusante (Figura 1C). A imagem MIR é utilizada como a modalidade a montante, permitindo o mapeamento bioquímico não destrutivo e sem marcação do tecido. Guiada pelas informações espaciais da imagem MIR, uma matriz é posteriormente aplicada para aquisição de MALDI-MSI. Após o co-registro preciso, os conjuntos de dados são integrados para co-análise multivariada (Figura 4), permitindo uma metabolômica espacial abrangente por meio de ferramentas computacionais avançadas.

1. Preparação da amostra

1. Preparação de amostras de tecido
   1. Coleta de tecido de camundongo
      1. Camundongos C57BL/6J domésticos (20 semanas de idade, 40 g) sob condições específicas livres de patógenos (SPF), mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 horas e com acesso ad libitum a alimentos e água para garantir a saúde ideal antes do experimento.
      2. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dose de 50 mg / kg de peso corporal para garantir uma anestesia profunda. Monitore o animal e confirme a ausência de reflexos pediosos e corneanos antes de prosseguir com a perfusão.
      3. Perfunda aproximadamente 20-30 mL de PBS frio contendo heparina (5 UI / mL) através do ventrículo esquerdo a uma pressão controlada de 150 mmHg por 6 minutos para liberar o sangue e exsanguinar o órgão antes da remoção.
      4. Resfrie imediatamente todos os tecidos coletados com nitrogênio líquido e armazene-os a -80 ° C para análise posterior.
         NOTA: O congelamento rápido é essencial para evitar a formação de cristais de gelo, que podem distorcer a morfologia do tecido.
   2. Inclusão de tecidos e crioseccionamento
      1. Defina o micrótomo para -20 °C e descontamine a câmara e a lâmina com etanol (EtOH) para eliminar o meio de incorporação residual. Permita que as lâminas CaF₂ , o envelope de lâminas, o suporte de amostra e a amostra de tecido se equilibrem dentro do criostato.
      2. Apare o tecido em aproximadamente 5 mm × 5 mm × 3 mm. Incorpore-o em gelatina a 10% dentro de um criomold padrão a -20 °C, garantindo a orientação adequada para o seccionamento. Congele a amostra embebida em gelo seco e armazene a -80 °C até a criossecção.
      3. Extraia o tecido de seu molde, apare o excesso de material para otimizar o corte e fixe-o no suporte da amostra usando água ultrapura para garantir uma adesão estável.
      4. Corte seções de 10 μm de espessura e imobilize as seções em substratos de CaF₂ pré-revestidos e armazene-as a -80 °C.
      5. Coloque as seções de tecido montadas em um liofilizador a vácuo antes da imagem infravermelha média. Ajuste a pressão da câmara para 0.1 mPa e a temperatura para -100 °C. Seque as amostras por 30 min.
2. Preparação de amostras de células
   1. Semeie 1,25 × 10⁵ células HeLa em substratos circulares de CaF₂ de 13 mm de diâmetro colocados em placas de cultura padrão. Use o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar as células em condições de cultura padrão (37 °C, 5% CO₂) durante 24 h.
   2. Após 24 h, remova cuidadosamente o meio e fixe as células incubando-as em paraformaldeído (PFA) a 4% dissolvido em tampão PBS por 20 min à temperatura ambiente (RT).
   3. Enxágue as células fixas três vezes com tampão HBSS e, em seguida, lave-as mais três vezes com ddH₂O.
   4. Seque completamente os substratos de CaF₂ ao ar em RT antes de prosseguir para a imagem MIR.

2. Aquisição de imagem multimodal

1. Aquisição de imagem MIR de laser em cascata quântica (QCL)
   1. Realize a microscopia de imagem QCL MIR usando um microscópio QCL-MIR equipado com um microbolômetro refrigerado a líquido não-N₂ 520 × detector de matriz de plano focal (FPA) e tecnologia de redução de coerência espacial.
   2. Selecione a faixa espectral de 950 ^cm-1 a 1800 ^cm-1.
   3. Use uma objetiva de 4× com uma abertura numérica (NA) de 0,6, resultando em um tamanho nominal de pixel de 4,25 μm.
   4. Colete um espectro de fundo em um substrato limpo de CaF₂ com resolução espectral de 4 ^cm-1 .
   5. Selecione a área de aquisição com base na morfologia do tecido e colete dados espectrais com uma resolução espectral de 4 ^cm-1. Nesta resolução espectral, a velocidade de aquisição da imagem é de aproximadamente 0,3 mm²/s.
      NOTA: Todas as medições são realizadas no modo de transmissão usando lâminas CaF₂ , com ajuste de foco manual.
2. Aquisição de imagens por espectrometria de massa
   1. Aplicação matricial
      1. Use as seções de tecido pós-MIR para MALDI-MSI, aplique marcadores fiduciais ao redor do tecido usando uma caneta Tippex e capture uma imagem óptica pré-MSI com um scanner de mesa para registro de imagem.
      2. Prepare a matriz NEDC a 7 mg / mL em metanol / acetonitrila / água deionizada (V / V / V = 75: 25: 5) e, em seguida, filtre através de uma membrana de 0,2 μm para remover as partículas.
      3. Carregue as lâminas de tecido marcadas em um pulverizador de matriz automatizado. Dispense a matriz NEDC na amostra usando os parâmetros predefinidos.
   2. Medição MALDI-MSI
      1. Deposite 0,2 μL de suspensão de fósforo vermelho na lâmina de CaF₂ para servir como um padrão de calibração de massa externa.
      2. Prenda a corrediça revestida com matriz no adaptador de corrediça, garantindo um contato elétrico ideal com o suporte. Carregue a placa em um sistema MALDI-MSI.
      3. Alinhe a imagem óptica da lâmina com as coordenadas do motor XY do estágio MALDI usando marcadores fiduciais. Defina ROIs para análise de tecido e inclua uma área "somente matriz" como controle negativo.
      4. Configure o instrumento no modo de íons negativos com um tamanho de pixel de 20 × 20 μm², cobrindo uma faixa m/z de 50-1000. Execute a calibração de massa usando o ponto de fósforo vermelho antes de iniciar a aquisição de dados. Realize a aquisição de dados usando uma plataforma comercial de análise de dados.

3. Pré-processamento e análise de dados de imagem

NOTA: Os códigos personalizados do MATLAB são carregados como Arquivo Suplementar 1.

1. Pré-processamento e análise de dados QCL-MIR
   1. Pré-processamento de dados
      1. Exporte dados hiperespectrais em um formato apropriado para análise posterior.
      2. Execute o pré-processamento de dados usando CytoSpec e MATLAB, seguindo estas etapas 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Importe os dados espectrais MIR para o CytoSpec v2.00.07 para pré-processamento.
      4. Avalie a qualidade espectral usando o módulo de testes de qualidade integrado no CytoSpec. Selecione o critério 2 (espessura da amostra) para avaliar a consistência da amostra. Defina a faixa de integração espectral para 950-1800 ^cm-1. Defina os limiares de absorbância entre 50 e 1000 unidades para excluir espectros de regiões excessivamente finas ou espessas.
      5. Reduza o ruído usando a filtragem baseada em PCA no CytoSpec. Retenha os primeiros 10 componentes principais (PCs) para eliminar o ruído de alta frequência, preservando a variação bioquímica chave.
      6. Exporte os dados espectrais pré-processados do CytoSpec no formato .mat para análise posterior no MATLAB.
      7. Execute a correção da linha de base no MATLAB usando um algoritmo de correção de elástico na faixa espectral de 950-1800 ^cm-1 para eliminar o desvio da linha de base e melhorar a precisão espectral.
      8. Aplique a normalização espectral usando a escala mín-máx na mesma faixa espectral para padronizar as intensidades em todos os espectros e garantir a comparabilidade em todo o conjunto de dados.
   2. Análise de dados
      1. Identifique características associadas à proteína em 1.550 ^cm-1 e 1.650 ^cm-1, correspondendo às bandas de amida II e amida I, respectivamente. Identifique características associadas a lipídios a 1.740 ^cm-1, representando a vibração de alongamento éster C = O.
      2. Calcule a razão de intensidade da banda de amida I (1650 ^cm-1) para o trecho éster C = O (1740 ^cm-1) e gere mapas de proporção para visualizar a distribuição espacial de lipídios para proteínas.
      3. Análise de cluster não supervisionada: Realize análise de agrupamento hierárquico (HCA) em dados hiperespectrais usando distância euclidiana e ligação de Ward para classificar regiões com base na similaridade espectral. Gere mapas de cluster para identificar regiões bioquimicamente distintas e revelar diferenças estruturais ou patológicas.
2. Pré-processamento e análise de dados MSI
   1. Importe os dados brutos do MSI para uma plataforma de análise de dados comerciais.
   2. Realize o pico de picking com intensidade relativa > 0,01%.
   3. Exclua os picos derivados da matriz da lista de picos experimentais, comparando-os com o espectro obtido de uma região de controle somente da matriz. Remova quaisquer picos que apareçam no espectro de controle e tenham uma relação sinal-ruído (SNR) menor que 3.
   4. Normalize o conjunto de dados para Root Mean Square (RMS) para levar em conta a variabilidade na intensidade do sinal de íons entre pixels e amostras.
   5. Refine a identificação de metabólitos filtrando recursos com base em sua distribuição tecidual, combine com entradas no Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB) e concorde com os valores teóricos de m/z.
   6. Selecione metabólitos relevantes com base em objetivos experimentais e contexto tecidual.
   7. Exporte as intensidades das feições selecionadas para todos os pixels como um arquivo CSV.
   8. Aplicar técnicas de redução de dimensionalidade (por exemplo, PCA, t-SNE ou UMAP) para reduzir a complexidade dos dados e identificar clusters de pixels com assinaturas metabólicas semelhantes usando ferramentas de bioinformática como Seurat e Banksy, facilitando a visualização da heterogeneidade metabólica espacial.

4. Co-registro e co-análise de imagens multimodais

1. Selecione a imagem MIR adquirida a 1650 ^cm-1 como referência espacial para co-registro. Este número de onda específico destaca a banda da proteína amida I, oferecendo forte contraste tecidual.
2. Normalize os valores de intensidade das imagens MIR e MSI para melhorar a comparabilidade visual. Aplique técnicas de aprimoramento de contraste, como equalização de histograma usando a função histeq no MATLAB, para redistribuir as intensidades da imagem e melhorar a visibilidade de recursos estruturais críticos para a seleção de pontos de referência.
3. Carregue as imagens MIR e MSI no MATLAB usando a função cpselect da caixa de ferramentas de processamento de imagem. Esta função abre uma interface interativa para a seleção de pontos de referência.
4. Anote manualmente de cinco a dez pontos de controle anatomicamente relevantes e bem distribuídos nas imagens MIR e MSI usando a função cpselect . Esses pontos de referência devem corresponder a características morfológicas distintas, como limites de tecido.
   NOTA: Distribua os pontos de controle uniformemente pelo campo da imagem para minimizar a distorção localizada.
5. Exporte e registre as coordenadas dos pontos de controle anotados de ambas as imagens. Armazene-os como duas matrizes correspondentes para computação de transformação (por exemplo, movingPoints e fixedPoints).
6. Calcule uma matriz de transformação afim usando a função MATLAB fitgeotrans no modo Afim . Essa transformação é responsável por dimensionamento, rotação, translação e cisalhamento.
7. Aplique a transformação computada à imagem MSI usando a função imwarp no MATLAB. Esta etapa gera uma imagem MSI registrada espacialmente que é geometricamente alinhada ao quadro de referência MIR.
8. Inspecione visualmente o alinhamento usando a função imshowpair no modo de mesclagem para sobrepor as imagens MSI e MIR e confirmar o registro correto dos recursos estruturais.
9. Converta a imagem MSI registrada e a imagem MIR de referência em máscaras binárias usando a função imbinarize no MATLAB.
10. Calcule o Coeficiente de Similaridade de Dados (DSC) para quantificar a sobreposição espacial entre as duas máscaras binárias. O DSC é definido como: DSC = 2 × (Área de Sobreposição)/(Área Total de Ambas as Máscaras). Um valor de DSC próximo a 1,0 indica alta sobreposição espacial e precisão de registro.
    NOTA: Se necessário, refine o registro ajustando o número ou o posicionamento dos pontos de controle e repetindo o processo de transformação. Considere métodos de registro não rígidos se os desalinhamentos locais persistirem.
11. Salve a imagem registrada, os parâmetros de transformação e as coordenadas de referência para análise de imagem multimodal downstream, como correlação espacial de recursos bioquímicos e estruturais.

Resultados

Para validar a estratégia de metabolômica espacial multimodal descrita acima, nós a implementamos em um modelo de câncer de camundongo. As células tumorais foram geneticamente modificadas para expressar a proteína fluorescente verde (GFP), permitindo a localização precisa da região do tumor por meio de imagens de fluorescência. A Figura 2A mostra os resultados da imagem QCL-MIR sem marcação com uma cobertura espectral de 950-1800 ^cm-1, conhecida como "região da impressão digital"....

Discussão

Aqui, apresentamos uma estratégia de metabolômica espacial multimodal que integra imagens MSI e MIR para permitir perfis metabólicos molecularmente específicos de alto rendimento nas mesmas amostras. A imagem MIR permite o mapeamento químico não destrutivo e sem rótulos com base em vibrações moleculares, fornecendo informações detalhadas sobre grupos estruturais e funcionais. Em contraste, o MSI oferece alta sensibilidade e especificidade para identificação e quantificação de metabólitos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% Paraformaldeído, solução de fixação de tecido	Sangon Biotech
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	126615
camundongos C57BL/6JNifdc	Charles River	219
CaF2 slides	Crystran	CAFP25-1
Micrótomo criostato	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	Versão 2.10.01	Software para análise de dados MIR, incluindo correção de linha de base, normalização, geração de imagens e análise hiperespectral.
Amortecedor DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
Soro fetal bovino	Gibco	10270106
Liofilizadores	LABCONCO	FreeZone
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890	Tipo A, de pele suína
HBSS buffer	Sangon Biotech
DMEM com alto teor de glicose	ThermoFisher Scientific
Matlab	MathWorks	Software Matlab R2024a	para análise de dados MIR, incluindo correção de linha de base, normalização, geração de imagens e análise hiperespectral.
Sistema de imagem de espectrometria de massa por ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MSI)	Bruker Daltonics GmbH	timsTOF fleX MALDI-2
Metanol	Sinopharm Reagente Químico	10014108
mMass	Instituto de Entomologia, Centro de Biologia da Academia Tcheca de Ciências, República Tcheca	Versão 5.5.0	Softwares para análise de dados MSI. Importe os dados brutos do MSI para o SCILS Lab para pré-processamento. Execute o pico de picking em mMass com intensidade relativa > 0,01%.
Matriz de dicloridrato de N-(1-naftil) etilenodiamina (NEDC)	Sigma Aldrich	222488
Penicilina-estreptomicina	ThermoFisher Scientific
Microscopia de infravermelho médio (QCL-MIR) a laser em cascata quântica (QCL-MIR	) Bruker Optics GmbH	LUMOS II ILIM
Fósforo vermelho	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	Bruker Daltonics	SCiLS Lab 2024b	Softwares para análise de dados MSI. Importe os dados brutos do MSI para o SCILS Lab para pré-processamento. Execute o pico de picking em mMass com intensidade relativa > 0,01%.
Pulverizador	HTX Technologies	TM
Tripsina, 0.25% EDTA	ThermoFisher Scientific