Artigo de método

Aprimorando a tecnologia de vesículas extracelulares com receptor de antígeno quimérico (CAR-EV): o futuro da terapia do câncer

DOI:

10.3791/68726

⸱

19 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

Neste artigo

Resumo

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A aplicação terapêutica de vesículas extracelulares (EVs) tem o potencial de revolucionar o tratamento do câncer e a administração de medicamentos. Os EVs derivados de células do receptor quimérico de antígeno (CAR) (CAR-EVs) isolados por cromatografia de troca iônica exibem maior capacidade de carga, aumentando significativamente sua eficácia funcional. Este estudo caracteriza ainda mais os CAR-EVs para elucidar sua atividade biológica e potencial terapêutico.

Resumo

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As terapias com células CAR avançaram significativamente no tratamento personalizado para várias neoplasias hematológicas. Atualmente, sete produtos de células CAR- são aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) e seis pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA) para o tratamento de linfoma, mieloma múltiplo e leucemia linfocítica crônica. Vários desafios e limitações permanecem, sendo a síndrome de liberação de citocinas (CRS) e a síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS) as mais significativas. Terapias livres de células, como CAR-EVs, oferecem vantagens substanciais sobre suas contrapartes celulares. Isso inclui infiltração tumoral aprimorada e o potencial de administração repetida, minimizando os riscos de CRS, ICANS e outros efeitos colaterais adversos. Além disso, a potência dos CAR-EVs pode ser ajustada pela engenharia da inclusão de agentes citotóxicos e ácidos ribonucleicos modificadores de função (RNAs). Aqui, relatamos o desenvolvimento de uma plataforma CAR-EV escalável para a produção de CAR-EVs sintonizáveis. Esta plataforma inclui a engenharia e o pré-condicionamento de células produtoras de EV (por exemplo, células CAR-T e CAR-natural killer (CAR-NK)), isolamento e enriquecimento de CAR-EVs usando uma plataforma de cromatografia de troca iônica (IEX) de grau de Boas Práticas de Fabricação (GMP), análise de subpopulação EV de alto rendimento totalmente automatizada e in vitro avaliação da atividade citotóxica funcional do CAR-EV. A plataforma foi validada usando CAR-NK-EVs e CAR-T-EVs para linhagens de células tumorais hematológicas e sólidas. A plataforma CAR-EV representa uma abordagem promissora para o rápido desenvolvimento de CAR-EVs terapêuticos prontos para uso, adaptados a indicações específicas de doenças, com potencial para reduzir os efeitos colaterais adversos associados às terapias baseadas em células CAR.

Introdução

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As terapias baseadas em células CAR foram aprovadas para o tratamento de malignidades hematológicas, no entanto, persistem desafios e limitações significativos1. Notavelmente, os riscos da RSC e ICANS continuam sendo fatores críticos ao avaliar a adequação do paciente à terapia CAR, ressaltando a necessidade de avanços contínuos nas estratégias de tratamento2.

EVs derivados de células CAR (CAR-EVs) surgiram como uma opção terapêutica alogênica mais eficaz e potencialmente mais segura. Essas VE oferecem várias vantagens, incluindo imunogenicidade reduzida, menor risco de RSC, infiltração tumoral aprimorada, adequação para doses repetidas, potencial para terapias combinadas, bem como processos eficientes de produção e armazenamento3. EVs de origem biológica podem ser projetados para expressar moléculas direcionadas ao câncer que se ligam com alta afinidade a receptores de superfície específicos em células cancerígenas. Uma vez modificados, esses EVs projetados apresentam uma estratégia promissora para entregar carga terapêutica seletivamente, com o potencial de minimizar os efeitos fora do alvo. Derivados de células CAR, esses EVs armados exibem propriedades funcionais aprimoradas que permitem uma administração terapêutica mais precisa e potente. Suas características inerentes conferem múltiplas vantagens que, coletivamente, contribuem para melhorar a eficácia do tratamento.

Dois obstáculos principais para o uso eficaz de EVs na clínica são escala e eficácia. As metodologias aqui delineadas exibem escalabilidade inerente e são prontamente adaptáveis em um amplo espectro de paradigmas experimentais. Aumentar a produção de EV para fabricação de nível clínico é uma área de desenvolvimento ativo, mas requer otimização adicional para gerar quantidades suficientes de material de nível clínico4. É importante ressaltar que estudos recentes demonstraram abordagens promissoras para melhorar a eficácia das EVs, como pré-condicionar células-mãe com interleucinas (por exemplo, IL-7, IL-15, IL-21) e gerar EVs sob condições hipóxicas (1-2% O2) 5,6,7.

O objetivo deste estudo foi investigar o potencial terapêutico do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e do receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) CAR EVs in vitro, usando células de câncer de mama MCF-7 e células de leucemia mielóide K562. Os EVs foram isolados e enriquecidos a partir de meios condicionados por células CAR (CM) via IEX, caracterizados usando rastreamento de nanopartículas e análise de Western blot e submetidos a ensaios funcionais. Os CAR EVs contendo carga citotóxica endógena induziram efetivamente a morte celular in vitro. Os dados obtidos estabelecem a viabilidade da produção escalável de EV direcionada para aplicações terapêuticas.

Protocolo

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NOTA: Manuseie todas as células vivas dentro de um gabinete certificado de nível de biossegurança 2 (BSL-2) usando EPI apropriado (por exemplo, luvas, aventais de laboratório). Materiais de risco biológico, como pellets de células contendo células vivas, devem ser descontaminados usando uma solução final de hipoclorito de sódio a 10% (alvejante).

1. Cultura celular e coleta de CM

  1. Cultura de células CAR
    NOTA: Embora as células CAR transduzidas por lentivírus usadas neste estudo tenham sido terceirizadas, o protocolo permanece aplicável às células CAR-T / NK geradas internamente por meio de técnicas padrão de engenharia celular.
    1. Mantenha as células CAR NK / T em cultura livre de xeno (meio de crescimento suplementado com 100 UI / mL de IL-2) a uma densidade de 0,5-1 x 106 / mL, em uma câmara umidificada a 37 ° C (5% CO2, 21% O2). Monitore a cada 2-3 dias e limite a contagem de células a 3 vezes por semana devido a restrições de capacidade de passagem.
    2. Confirme a expressão de CAR por microscopia , garantindo que as células sejam fluorescentes (se devidamente marcadas). Células em aglomerados saudáveis são indicativas de uma cultura de células CAR robusta.
  2. Coleção CM
    1. Quando as culturas de células atingirem 80% de confluência, avalie a viabilidade celular e determine a densidade de células vivas por meio da análise automatizada de contagem de células Trypan blue.
    2. Centrifugue as células a 300 × g (temperatura ambiente) por 5 min para formar um pellet.
    3. Recolha cuidadosamente o sobrenadante e centrifugue a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C para clarificar.
    4. Armazene o CM clarificado a -80 °C até que esteja pronto para o enriquecimento EV.

2. Isolamento e enriquecimento de EV

NOTA: Os métodos a seguir descrevem duas abordagens para o enriquecimento de vesículas extracelulares (EV): o método IEX, desenvolvido para isolamento de EV para análise funcional in vitro , e o método de captura de pan-exossomos de alto rendimento, otimizado para estudos de caracterização a jusante.

  1. Enriquecimento de CAR EVs funcionais via IEX
    NOTA: Todas as especificações volumétricas são expressas em termos de volume da coluna (CV), refletindo a relação proporcional entre os volumes de reagente e o volume do leito de resina dentro da coluna cromatográfica.
    1. Leve a coluna IEX (consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes da coluna usada) à temperatura ambiente (RT), deixando-a repousar por 15 minutos antes do uso. Adicione 10 CV de tampão de regeneração, seguido de equilíbrio usando tampão de equilíbrio isotônico de 10 CV (a pH 7,4) (consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes dos tampões).
      NOTA: Não permita que a coluna fique seca por longos períodos. Mantenha sempre a coluna na vertical.
    2. Descongelar o CM e passar por um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 μm.
    3. Adicionar a amostra na coluna equilibrada (até 31,2 CV), seguida de 10 CV de tampão de lavagem isotónico (a pH 7,4). Adicione 2,5 CV de tampão de eluição hipertônico (consulte a Tabela de Materiais) e colete o fluxo, pois esta é a amostra de eluído EV.
    4. Realizar uma troca de tampão no eluído EV usando filtros centrífugos de ultrafiltração disponíveis comercialmente (corte de 30 kDa) e uma solução isotônica como diluente, garantindo um fator de diluição mínimo de 100x. O volume alvo após a troca de buffer pode ser determinado pelo usuário para se adequar aos seus parâmetros experimentais.
    5. Realize uma etapa final de filtração usando um filtro de 0,22 μm para esterilizar os EVs enriquecidos para ensaios funcionais in vitro .
    6. Determine a distribuição de tamanho, concentração e rendimento de CAR-EV usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)8,9.
  2. Isolamento EV pan-exossomo de alto rendimento (via sistema de purificação automatizado, realizado à temperatura ambiente (RT)), para caracterização de uma variedade limitada ou grande de amostras10,11.
    1. Prepare três placas de 96 poços profundos (DW) com 1 mL de 1x PBS por poço.
    2. Crie uma placa de 'eluição' adicionando 35 μL de tampão dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1% a cada poço.
    3. Prepare uma placa de 'ligação' contendo 1 mL da amostra de CM e 30 μL de esferas de captura de pan-exossomos EXO-NET por poço.
    4. Defina as seguintes configurações no sistema de isolamento automatizado:
      1. Etapa 1: Pegue a ponta: Certifique-se de que o protocolo de isolamento comece com o instrumento envolvendo um pente de ponta de 96 poços profundos para permitir a manipulação do cordão magnético durante todo o processo de isolamento.
      2. Passo 2: Certifique-se de que a amostra CM e os grânulos magnéticos sejam misturados em condições contínuas de baixa velocidade por 30 minutos para permitir a captura eficiente de EVs nas partículas magnéticas. Após a mistura, 5 ciclos de 30 s cada são incluídos para garantir a captura de esferas magnéticas.
      3. Etapa 3: Certifique-se de que cada uma das três etapas de lavagem use uma mistura suave de baixa velocidade de 30 s para remover contaminantes não especificamente ligados, preservando a integridade dos EVs ligados. Como anteriormente, a etapa termina com 5 ciclos de 30 s cada para capturar as esferas magnéticas.
      4. Etapa 4: Eluição de proteína EV (lise): Certifique-se de que os EVs ligados sejam lisados para recuperação de proteínas por meio de um processo de duas fases. Uma mistura inicial por 30 s (mistura de fundo) é realizada antes de uma incubação por 7 min e 30 s em estado pausado, com a posição da ponta mantida acima do poço. Decorrido o tempo, há um segundo 30 s mixando e pausando por mais 7 min e 30 s. Finalmente, 5 ciclos de 30 s cada são incorporados.
      5. Passo 5: Neste ponto, certifique-se de que o teor de proteína esteja no tampão, enquanto as contas estão presas à ponta. Após a etapa de eluição, o pente de ponta usado é descartado, completando o protocolo.
        NOTA: As esferas de captura de pan-exossomo EXO-NET contêm 0,05% (p / p) de solução conservante. Embora não seja classificado como perigoso de acordo com os regulamentos da Administração de Segurança e Saúde Ocupacional (OSHA), equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados devem ser usados durante o manuseio, especialmente no contexto de biofluidos.

3. Caracterização de EVs via western blotting

NOTA: CAR-EVs foram caracterizados por Western blot (Granzyme B e Calnexin), em comparação com células como controle.

  1. Prepare lisados celulares adicionando 10 μL de tampão 1x ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (com inibidores de protease) por 1 × 106 células. Incube no gelo por 30 min e, em seguida, centrifugue a 14.000 × g (4 ° C) por 15 min para remover os detritos celulares. Os EVs podem ser lisados usando o mesmo buffer ou 1% SDS.
  2. Quantifique a quantidade de proteína usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (ou um nanoespectrofotômetro adequado).
  3. Monte um gel de poliacrilamida SDS a 4-12% em um aparelho de eletroforese seguindo o protocolo do fabricante. Prepare lisados de proteínas usando o tampão de Laemmli.
    NOTA: Os sistemas de gel podem variar de acordo com a marca
  4. Carregue 5 μg de amostra em cada poço e execute géis a 200 V por 20 min.
  5. Realize uma transferência ocidental usando membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF), bloqueando os borrões com albumina de soro bovino (BSA) a 5% em 1x solução salina tamponada com Tris com Tween 20 a 0,1% (1x TBST) a partir de então.
  6. Incubar os borrões em anticorpo monoclonal primário (Granzima B e Calnexin, diluição de 1 em 500 em uma solução de 5% de BSA em 1x TBST), estagnado (sem agitação) e durante a noite a 4 ° C.
  7. No dia seguinte, lave os borrões 3x por 5 min cada com 10-15 mL de 1x TBST antes de incubar em anticorpo secundário (dependente da espécie, diluição de 1 em 1.000 em uma solução de 5% BSA em 1x TBST por 1 h em RT). Detecte bandas usando quimioluminescência aprimorada (ECL), com imagens capturadas por meio de uma câmera digital de dispositivo acoplado carregado (CCD).

4. Ensaio funcional (via MTS)

NOTA: A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio in vitro MTS [(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio], onde as células reduzem o composto de tetrazólio em um produto de formazano colorido solúvel, mensurável a 490 nm de absorbância. As células de câncer de mama MCF-7 e K-562 foram tratadas por até 3 dias em três experimentos independentes com concentrações crescentes (0-500.000 partículas/célula) de CAR-EVs.

  1. Semeie 5.000 células receptoras por poço (50 μL/poço) em uma placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Reserve uma coluna para o meio em branco (para subtração do fundo do reagente MTS). Evite poços de borda, enchendo-os com 200 μL de água estéril.
    NOTA: As células aderentes devem ser plaqueadas com um dia de antecedência para garantir a fixação celular à superfície da placa antes do tratamento.
  2. Adicione EVs em quantidades crescentes (por exemplo, 2,5 x 105 e 4,5 x 105, ou 0,5, 0,75 e 1 milhão de EVs por célula). Inclua controles: 'Sem EV', 1x PBS 'EV buffer' e um controle positivo de morte celular (por exemplo, um inibidor de molécula pequena específico do alvo ou 0,1% de TX-100).
  3. Incubar as células em uma câmara umidificada a 37 ° C (5% CO2, 21% O2) por 2-3 dias.
  4. No ponto de tempo de tratamento designado, examine as células por microscopia . Adicionar o reagente MTS (20 μL por cada cultura de 100 μL por alvéolo). Incubar entre 1-4 h, medindo a absorbância usando um leitor de placas a 490 nm, de hora em hora.
  5. Subtraia a leitura de absorbância do meio em branco para análise de dados. Calcule estatísticas usando o teste t de Student para comparações de dois grupos ou ANOVA de uma via com comparações múltiplas para três ou mais grupos.

Resultados

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Um fluxo de trabalho típico de cultura de células CAR T/NK, seguido de isolamento de EV, caracterização e utilização de EVs em um ensaio funcional é ilustrado na Figura 1. O CM da cultura de células CAR T / NK é coletado, antes do enriquecimento de EV e caracterização a jusante (incluindo análise de rastreamento de nanopartículas) e atividade funcional avaliada por meio de um ensaio MTS de placa de vários poços (Figura 1).

As células CAR marcadas com GFP podem ser visualizadas por microscopia para confirmar a expressão da construção CAR em cultura. A microscopia deve ser realizada como uma etapa de rotina antes e durante a coleta do MC para garantir eficiência de transdução suficiente. É importante sobrepor canais de campo claro e GFP, para capturar a autofluorescência potencial ao avaliar a eficiência. É importante notar que as células T possuem uma tendência a se aglomerar naturalmente (observada de forma semelhante nas células NK; dados não mostrados), e a fluorescência pode ser claramente observada quando as células exibem um fenótipo agrupado (Figura 2).

Após o enriquecimento de EV, os EVs podem ser caracterizados via NTA e western immunoblotting. Usando NTA, a análise do rendimento de partículas pode confirmar um aumento da concentração nos EVs isolados, em comparação com o CM ( Figura 3A ). Os dados de Western blot confirmam ainda a expressão do marcador citolítico granzima B em células CAR e EVs, e a ausência de calnexina neste último, o que confirma a ausência de material celular nas preparações. HEK293T células são incluídas como um controle negativo para CAR (Figura 3B).

A análise da funcionalidade EV foi realizada via ensaio MTS para determinar a viabilidade / capacidade de proliferação celular. O efeito dos CAR-EVs direcionados a EGFR e HER2 no câncer de mama MCF-7 e na viabilidade e crescimento de células de câncer de sangue K562 é determinado pela medição do reagente MTS colorimétrico a uma absorbância de 490 nm (após a remoção do sinal de fundo). Neste exemplo, o EGFR direcionado a CAR-EVs reduziu a viabilidade das células MCF-7 e K562 em 70% e 40%, respectivamente. HER-2 visando CAR-EVs reduziu MCF-7 em ~ 10% (conforme determinado por meio do teste t de Student). Considerando o layout experimental, o emprego de um teste não paramétrico (por exemplo, Mann-Whitney U) pode oferecer insights mais robustos em estudos subsequentes (Figura 4).

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Figura 1: Geração, enriquecimento, caracterização de EV e leitura funcional do CAR-EV. Diagrama esquemático que descreve um fluxo de trabalho típico de geração, produção e caracterização de EV de amostras enriquecidas de CAR-EV antes da análise da funcionalidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Análise de microscopia representativa por confirmação da expressão de GFP em células CAR-T direcionadas a HER2. As imagens foram capturadas por microscopia de fluorescência, usando uma objetiva de 20x. A barra de escala branca representa um comprimento de 50 μm. As células T têm uma tendência natural de crescer em aglomerados antes do descolamento em células únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Caracterização de células CAR e EVs. (A) Análise de partículas de nano-rastreamento de CAR-T CM e EVs enriquecidos. A concentração de partículas de EVs foi 1,6-2,1 vezes maior que a de CM, enquanto a concentração de proteína foi reduzida em >80%. Diferenças estatisticamente significativas foram testadas com ANOVA one-way e teste de comparações múltiplas de Tukey; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) A análise de Western blot de células T transduzidas e CAR-EVs enriquecidas confirmou a presença de granzima B citolítica em células CAR e EVs, enquanto uma ausência foi observada em HEK293T células não-CAR. A calnexina não foi detectada no CAR-EV, indicando baixa contaminação por partículas do retículo endoplasmático. Carga de proteína por pista = 5 μg. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Efeito dos CAR-EVs na viabilidade da célula-alvo (células de câncer de mama MCF-7 e linha celular de leucemia mielóide crônica K562). As células-alvo foram tratadas com uma dose única de 4,5 x 105 e 2,5 x 105 EVs/célula (EGFR ou HER2 CARs, respectivamente) ou controle (tampão EV) por até 3 dias. (A) Células CAR-EVs direcionadas ao EGFR. (B) CAR-EVs direcionados ao HER2. Uma diminuição na leitura de absorbância (indicativa da eficácia do tratamento) foi observada em ambas as linhagens celulares. Os dados representam a absorbância média ± DP (n = 3), analisada por meio de um teste t de Student não pareado bicaudal, com valores de p indicando significância estatística; ** p≤ 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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A combinação da eficácia comprovada da terapia CAR com as vantagens promissoras da terapia baseada em vesículas extracelulares (EV) pode melhorar a eficácia dos tratamentos oncológicos, conforme demonstrado em estudos direcionados aos cânceres de mama e pulmão12,13. A abordagem terapêutica CAR-EV aborda as limitações atuais da terapia CAR, como desafios de entrega e toxicidade associada, ao mesmo tempo em que aproveita a biocompatibilidade e os recursos de direcionamento dos EVs. A integração dessas modalidades pode facilitar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o câncer, ampliando as oportunidades para a aplicação de EVs em um ambiente clínico. Além disso, a engenharia e o enriquecimento de EVs funcionais fornecem um método mais seguro (via encapsulamento de carga citolítica) e mais preciso (ou seja, a adição de domínios de direcionamento) para fornecer carga terapêutica, especialmente para locais desafiadores, como o núcleo do tumor, medula óssea e áreas protegidas por barreiras como a barreira hematoencefálica ou hematotesticular14 , 15 , 16. Apesar do método bem estabelecido de enriquecimento de EV usando ultracentrifugação, várias limitações permanecem. Restrições notáveis incluem: escalabilidade, co-isolamento de impurezas e rendimento pós-produção limitado17. Há uma clara necessidade de processos aprimorados para gerar EVs terapêuticos em escala.

Este estudo de prova de conceito demonstra que o IEX é um método escalável e eficaz para produzir, isolar e enriquecer CAR-EVs funcionais, usando CM clarificado de células que expressam CAR como entrada. O IEX permite o processamento de alto rendimento e suporta pesquisa e produção em escala cGMP, permitindo o controle de qualidade em todo o fluxo de trabalho - desde a geração de EV até o teste do medicamento final18,19. Embora a caracterização de EV seja essencial para confirmar a função, o rendimento pode variar significativamente devido a diferenças no volume da amostra, concentração de entrada e propriedades específicas de EV, como carga superficial e propriedades de ligação. Dados internos usando células MCF-7 mostram um rendimento médio de pré-purificação de ~ 2,85 × 108 partículas/mL, com concentrações de pós-purificação normalmente variando de 3 × 1011 a 1 × 1012 partículas/mL. Esses níveis podem ser ajustados modificando o volume de ressuspensão durante a troca de buffer para atender às necessidades a jusante. Dada essa variabilidade, os usuários são fortemente encorajados a otimizar o protocolo com CM relevante para sua configuração experimental, para garantir rendimentos reprodutíveis e robustos.

Várias etapas do protocolo são críticas para a produção bem-sucedida de CAR-EVs, com ênfase particular nas fases de carregamento e eluição da amostra. Essas etapas influenciam diretamente na eficiência da captura de VE pela coluna e, consequentemente, no rendimento geral. A etapa de troca de tampão é crucial, pois a remoção incompleta do excesso de solutos pode comprometer a estabilidade do EV, levando à degradação ao longo do tempo. Os EVs podem então ser caracterizados usando métodos como NTA ou perfil proteômico. Se os CAR-EVs forem destinados a ensaios funcionais, como estudos de captação celular ou intervenções terapêuticas, a esterilidade é de extrema importância. Uma etapa final de esterilização "terminal" (0,22 μm) é essencial para evitar a contaminação microbiana, que pode confundir os resultados experimentais ou representar riscos de biossegurança. Dados esses fatores, os usuários são fortemente aconselhados a ter cuidado especial durante essas etapas para manter a reprodutibilidade e a integridade funcional da preparação final do EV.

Várias modificações de protocolo podem ser necessárias para resolver problemas comuns encontrados durante a produção do CAR-EV. O baixo rendimento é mais comumente causado pelo carregamento abaixo do ideal de CM, excedendo ou ficando aquém da capacidade de ligação da coluna. Para determinar o volume de entrada ideal, é aconselhável realizar um estudo de titulação de CM, aumentando gradualmente a carga para identificar o ponto de recuperação máxima do EV. O entupimento do filtro, normalmente observado durante a etapa final de filtração estéril, geralmente resulta da concentração e viscosidade excessivas da amostra, o que pode promover a agregação de EV. Nesses casos, recomenda-se a diluição da preparação final do EV. Se a diluição não for viável, a filtração estéril pode ser realizada antes da troca do tampão; no entanto, essa abordagem exige que todas as etapas subsequentes sejam conduzidas sob condições assépticas estritas para manter a esterilidade.

O desenvolvimento de EVs como terapêutica contra o câncer requer processos de produção reprodutíveis e validação robusta de sua eficácia contra linhagens de células cancerígenas alvo. Uma limitação comum do IEX no enriquecimento de EV é o co-isolamento de partículas não EV - um desafio identificável por meio da análise a jusante de marcadores específicos de EV e redutível por meio de otimização adicional de CM. A caracterização da liberação de controle de EVs deve incluir: NTA para determinar o número e o tamanho das partículas e a concentração de EV pós-enriquecimento; análise genética e transcrita da expressão do construto CAR; determinação da expressão celular e da proteína EV do CAR, biomarcadores canônicos de EV e marcadores citolíticos (por exemplo, granzima B e perforina); e efeitos dentro e fora do alvo. A incorporação de técnicas adicionais, como a microscopia eletrônica de transmissão (MET), fornecerá validação morfológica para complementar a caracterização baseada em tamanho, apoiando uma análise mais abrangente. Para manter o controle de qualidade, os produtos EV devem passar por testes de contaminação por micoplasma e endotoxina para verificar a esterilidade e a adequação para a produção clínica. O emprego de formulações adequadas para armazenamento de longo prazo de CAR-EVs funcionais pode oferecer oportunidades para aumentar sua estabilidade, incluindo a manutenção da qualidade, quantidade e eficácia terapêutica. A avaliação consistente do desempenho funcional é essencial para garantir a integridade do produto. Notavelmente, o ensaio MTS utilizado neste estudo oferece uma avaliação indireta da citotoxicidade por meio da medição da atividade metabólica. Estudos futuros se beneficiariam da integração de ensaios padronizados de citotoxicidade, como liberação de lactato desidrogenase (LDH), coloração de anexina V / PI ou perfil de ativação de caspase, para delinear os efeitos citotóxicos com mais precisão. Além disso, a incorporação de comparadores de células CAR (não incorporados no estudo atual devido a limitações de fornecimento) isoladamente ou em combinação com CAR-EVs, e incluindo o tratamento paralelo de linhas de células não cancerígenas de controle, pode aprofundar o valor interpretativo dos achados.

Este estudo destaca o uso potencial de EGFR / HER2 CAR EVs como uma estratégia terapêutica viável para cânceres específicos. O aumento da eficácia dos CAR EVs pode ser alcançado por meio de doses múltiplas ou pré-ativação de células T parentais para aumentar a citotoxicidade. Além disso, avanços em abordagens emergentes, como cargas de siRNA, e melhorias na capacidade de ligação EGFR / HER2 apresentam oportunidades para refinar o design dessas plataformas terapêuticas20,21. A aplicação promissora de receptores duplos de antígenos quiméricos (CARs duplos) na terapia celular oferece uma oportunidade adicional de avanço. Estender o uso de dual-CARs pela utilização de suas contrapartes EV na terapêutica pode ser um passo fundamental para ampliar seu escopo terapêutico e aprimorar as modalidades de tratamento22,23. O monitoramento em tempo real da citotoxicidade de células cancerígenas acionadas por CAR EV (por exemplo, ativação de caspase 3/7, leitura de impedância) fornece informações valiosas para determinar os regimes de dosagem ideais, facilitando a tradução simplificada para futuras aplicações in vivo.

Divulgações

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Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L e Rice G são funcionários da INOVIQ Ltd.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a Siena Barton, Hiba Rashid, Sara Nikseresht, Shayalini Wignarajah e Abel Sujeev por suas contribuições ao laboratório. Os autores agradecem a todos os colaboradores internos e externos, sendo este estudo apoiado e financiado pela INOVIQ Ltd.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4Gibco10010049Enriquecimento de EV
Dodecil sulfato de sódio a 1% (SDS)SigmaL3771-100GDissolva 1g de pó de SDS em 10 mL de água ultrapura
1x solução salina tamponada tris com Tween-20 (TBST)Produtos Químicos TermocientíficosJ77500. K2Dilua com água ultrapura para fazer uma solução 1x (alternativamente, prepare uma solução de polissorbato-20/Tween-20 a 0,1% em solução salina tamponada com 1x tris)
Microplaca de poliestireno de fundo plano transparente de 96 poços tratada com TC, estérilCorning3595in vitro ensaio funcional
Géis de proteína Bolt Bis-Tris Plus Mini, 4-12%, 1,0 mm, formato WedgeWellInvitrogenCaracterização de célula/EV
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA9647-100GCaracterização de célula/EV
Anticorpo CalnexinaSinalização Celular2433SCaracterização de célula/EV
Células CAR-NK/TProMab BiotecnologiasVariaO domínio de ligação ao ligante extracelular CAR depende do alvo preferido nas células receptoras
CellTiter 96 AQuo ensaio de proliferação celular em uma solução (MTS)PromegaG3580in vitro ensaio funcional
cOmplete, Mini, Coquetel de Inibidor de Protease sem EDTARoche11836170001Lise celular
Reagente de detecção de Western blotting ECLAmershamRPN2232Caracterização de célula/EV
Tampão de eluiçãoINOVIQEnriquecimento/isolamento EV
Amortecedor de equilíbrioINOVIQEnriquecimento/isolamento EV
Coluna EXO-ACE IEXINOVIQEnriquecimento/isolamento EV para ensaio funcional a jusante
Patent ID AU2024901931
Contas de captura de pan-exossomos EXO-NETINOVIQIsolamento de EV para caracterização downstream
Patente nº WO/2014/011673
Anticorpo Granzyme BSinalização Celular4275Caracterização de célula/EV
IL-2 Is Humana, grau premiumMiltenyi Biotec130-097-744Cultura de células T/NK sem xeno
Pilhas de transferência iBlot 2, PVDFInvitrogenCaracterização de célula/EV
ImmunoCult-XF (cGMP)Tecnologias de células-tronco100-0956Cultura de células T/NK sem xeno
K-562ATCCCCL-243in vitro ensaio funcional
MCF-7ATCCHTB-22in vitro ensaio funcional
Unidade de filtro de seringa Millex-GP, 0.22 µ mMerck MilliporeSLGPR33RSFiltragem terminal
Buffer de regeneraçãoINOVIQEnriquecimento/isolamento EV
Tampão RIPA (10X)Tecnologia de sinalização celular9806Lise celular
Solução de azul de tripano, 0,4%Gibco15250061Avaliação da viabilidade e densidade celular
Tampão de lavagemINOVIQEnriquecimento/isolamento EV
Equipamento
Contador de células automatizadoInvitrogenCondessa II FLAvaliação da viabilidade e densidade celular
Instrumento de extração automatizado de bancadaInvitrogenSistema KingFisher ApexSistema de purificação automatizado de alto rendimento
Veja o link para detalhes do protocolo: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Microscópio de fluorescênciaZeissObservador Axio 7Cultura de células
Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)Particle Metrix GmbHZetaview PMX-130Análise de partículas
Leitor de placasBMG LabtechSPECTROstar Nanoin vitro ensaio funcional
Centrífuga de bancada refrigeradaBeckman CoulterAvanti J-15RCultura de células e Processamento de enriquecimento EV
Mini tanque de gel SDS-PAGEInvitrogenRolamento A25977Caracterização de célula/EV
Sistema de transferência de Western blotInvitrogeniBlot 2Caracterização de célula/EV

Referências

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