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Artigo de método

Geração de Organoides Cardíacos Humanos a partir de Células-Tronco Embrionárias via Indução Gradual do Mesoderma e Auto-organização 3D

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DOI:

10.3791/68738

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7 de outubro de 2025

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método passo a passo para gerar organoides cardíacos humanos funcionais a partir de células-tronco embrionárias humanas (hESCs). Inclui etapas de descongelamento, diferenciação e maturação celular, fornecendo uma plataforma robusta para o desenvolvimento cardíaco e modelagem de doenças.

Resumo

Os organoides cardíacos derivados de células-tronco embrionárias humanas (hESC) são estruturas tridimensionais (3D) multicelulares que recapitulam aspectos-chave do desenvolvimento e função inicial do coração humano. Esses organoides auto-organizados exibem contratilidade espontânea, expressão de marcadores de cardiomiócitos e arquitetura semelhante a um tecido que lembra o miocárdio nativo. Aqui, apresentamos um protocolo robusto e reprodutível para gerar organoides cardíacos a partir da linhagem H9 hESC por meio da diferenciação de linhagem stepwise. A indução do mesoderma é iniciada pelo tratamento de esferoides por 36-40 h com ativina A (50 ng / mL), proteína morfogenética óssea 4 (BMP4, 10 ng / mL), fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2, 30 ng / mL), laduviglusibe (CHIR99021, 3 μM) e um inibidor de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) (LY294002, 5 μM). A especificação da linhagem cardíaca é subsequentemente direcionada pela exposição diária por quatro dias a BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), um inibidor da via Wnt (XAV-939, 5 μM) e ácido retinóico (0,5 μM). A diferenciação e maturação dos cardiomiócitos são promovidas a partir do dia 5.5 usando BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL) e insulina (10 μg/mL). A validação funcional é obtida por meio de imagens de lapso de tempo e análise de imunofluorescência, confirmando a geração de cardiomiócitos contráteis marcados pela expressão de troponina T cardíaca (cTnT). Além disso, a imunomarcação 3D revela a presença de α-SMA e CDH5, indicando o surgimento de populações de células musculares lisas e endoteliais. Esses organoides cardíacos demonstram consistentemente contrações rítmicas; no entanto, a validação eletrofisiológica direta do acoplamento eletromecânico não foi realizada. As limitações conhecidas incluem a incapacidade de passagem de organoides e potencial necrose central durante culturas estendidas. Em resumo, este modelo fornece uma plataforma escalável e fisiologicamente relevante para estudar a cardiogênese humana, respostas a medicamentos e doenças cardíacas congênitas.

Introdução

A doença cardiovascular continua sendo a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, ressaltando a necessidade urgente de modelos in vitro confiáveis que recapitulem o desenvolvimento e a função cardíaca humana 1,2. As culturas tradicionais de monocamada bidimensional (2D) de cardiomiócitos, embora valiosas, não conseguem reproduzir a complexidade espacial, as interações multicelulares e a integração eletromecânica do coração humano nativo 3,4. Organoides cardíacos 3D derivados de células-tronco pluripotentes surgiram como plataformas poderosas que abordam essas limitações, fornecendo estruturas multicelulares auto-organizadas que imitam a morfogênese cardíaca precoce e a maturação funcional in vitro5.

As hESCs, como a linha H9, possuem a capacidade intrínseca de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas, incluindo cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos cardíacos6. Sob condições de cultura controladas, as hESCs podem ser guiadas através dos estágios sequenciais de indução do mesoderma, especificação do mesoderma cardíaco e diferenciação de cardiomiócitos 5,7. Este processo gradual pode ser regulado usando moléculas de sinalização e inibidores específicos, incluindo Activin A, BMP4, FGF2, inibidores de PI3K, CHIR99021, inibidores de Wnt e ácido retinóico 5,8. Ao imitar de perto o ambiente de sinalização in vivo do desenvolvimento cardíaco embrionário, essas pistas promovem cardiogênese in vitro eficiente e reprodutível 5,7.

Ao contrário de muitos sistemas organoides que requerem incorporação em componentes da matriz extracelular (MEC), como o Matrigel, os organoides cardíacos podem se auto-montar em condições de baixa adesão sem suporte de matriz 5,9. A agregação de hESCs diferenciadoras em suspensão produz estruturas 3D esféricas que exibem batimentos espontâneos na primeira semana de diferenciação10. Esses organoides contêm populações de células cardíacas funcionalmente relevantes e demonstram características características, como organização sarcomérica, transientes de cálcio e contrações rítmicas11,12, oferecendo um modelo fisiologicamente relevante do tecido cardíaco humano inicial.

A capacidade de gerar organoides cardíacos derivados de hESC oferece oportunidades interessantes para biologia do desenvolvimento, modelagem de doenças, triagem de drogas e testes de cardiotoxicidade 13,14. Além disso, a integração com tecnologias de edição de genoma e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) específicas do paciente permite a modelagem personalizada de doenças e a exploração terapêutica de distúrbios cardíacos hereditários.

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado e passo a passo para a geração de organoides cardíacos a partir de células-tronco embrionárias humanas, destacando os principais estágios de diferenciação, condições de cultura e técnicas de validação. Essa plataforma fornece um sistema robusto e escalável para recapitular o desenvolvimento cardíaco humano e estabelecer uma base para futuras pesquisas translacionais.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo células-tronco embrionárias humanas (H9) foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética Biomédica da Southwest Medical University, aprovação 20241023-031. Todos os trabalhos de cultura de tecidos detalhados abaixo devem ser feitos em uma capela de fluxo laminar de Classe II. Certifique-se sempre de que o meio e os reagentes estejam em temperatura ambiente, equilibrados naturalmente antes do uso. Não use banho-maria para aquecer o meio.

1. Descongelamento e cultura de rotina de HESCs (H9)

  1. Revestimento de vitronectina de placas de cultura
    1. Descongele o estoque de vitronectina no gelo e dilua até uma concentração de trabalho de 10 μg / mL usando meio E8 frio.
    2. Adicione 1 mL por poço da solução diluída de vitronectina a uma placa de 6 poços. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C, CO5% 2 durante 1-4 h antes da utilização.
    3. Antes de semear as células, aspire o excesso de Vitronectina e não enxágue.
      NOTA: A incubação na incubadora de cultura de células melhora a uniformidade do revestimento e aumenta a fixação celular, especialmente importante para hESCs sensíveis. Não deixe a solução de revestimento secar. Este protocolo usa placas revestidas com vitronectina apenas durante os estágios de descongelamento e expansão de hESC para fornecer um substituto de ECM definido e ligado à superfície. Os organoides cardíacos são posteriormente formados por autoagregação em condições de suspensão de baixa adesão, sem a necessidade de MEC.
  2. Descongelamento de HESCs criopreservados (H9)
    1. Com pelo menos 30-60 minutos de antecedência, permita que todos os meios e reagentes necessários (por exemplo, meio E8, E8 + inibidor de ROCK, PBS) se equilibrem naturalmente à temperatura ambiente.
    2. Recupere uma criogenia de células-tronco embrionárias humanas H9 do armazenamento de nitrogênio líquido usando equipamento de proteção individual apropriado. Mergulhar imediatamente o criogénio num banho-maria a 37 °C. Agite suavemente o frasco para injetáveis e monitorize de perto.
    3. Assim que um pequeno cristal de gelo permanecer (~ 90% descongelado, ~ 1-2 min), transfira imediatamente o frasco para um gabinete de biossegurança. Desinfete a parte externa do criogenio com etanol 75% antes de abrir.
    4. Transfira lentamente o conteúdo do criogenial gota a gota para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio E8 em temperatura ambiente suplementado com 10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK). Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de diâmetro largo.
    5. Centrifugue a 200 × g por 5 min em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 2 mL de meio E8 + Y-27632.
    6. Plaquear as células em uma placa de 6 poços revestida com vitronectina (preparada com antecedência) na densidade de semeadura desejada (normalmente 150.000-200.000 células/poço). Agite suavemente a placa para distribuir as células uniformemente e transfira para uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5%.
      NOTA: O uso do inibidor de ROCK (Y-27632) é fundamental durante as primeiras 24 horas após o descongelamento para prevenir anoikis e apoiar a sobrevivência.
  3. Manutenção de rotina e passagem
    1. Troque o meio diariamente usando 2 mL de meio E8 fresco por poço.
    2. Monitorar diariamente em microscópio de contraste de fase; células de passagem quando atingem ~ 70-80% de confluência, normalmente a cada 3-4 dias.
      1. Para passagem: Aspirar o meio e enxaguar suavemente com 1 mL de DPBS.
      2. Adicione 0,5 mL de reagente de dissociação de células-tronco e incube em temperatura ambiente por 3-5 min. Bata suavemente no prato para desalojar as colônias.
      3. Colete a suspensão celular e replaquete em uma proporção de divisão de 1:3-1:4 em alvéolos recém-revestidos com vitronectina em meio E8 contendo 10 μM de Y-27632. Após 24 h, substitua o meio por E8 sem ROCKi.
        NOTA: Para uma recuperação ideal e subsequente eficiência de diferenciação, os HESCs devem ser passados como pequenos aglomerados de 2 a 10 células.
        O uso de pontas de furo largo é recomendado para minimizar a tensão de cisalhamento. Uma ponta de pipeta de 5 mL ou uma pipeta sorológica de 10 mL pode ser usada para misturar.

2. Diferenciação de HESCs (H9) em linhagem cardíaca

  1. Indução da diferenciação mesodérmica (Dia 0-1.5)
    NOTA: Evite diferenciar diretamente HESCs recém-descongelados (H9) em organoides cardíacos. É crucial que as células sejam primeiro passadas e mantidas por pelo menos uma passagem antes de iniciar a diferenciação para garantir a viabilidade celular ideal e a diferenciação saudável. A diferenciação de células imediatamente após o descongelamento pode resultar em resultados ruins devido ao comprometimento da saúde celular.
    1. Semeadura pré-indução: Quando as hPSCs atingirem aproximadamente 70% de confluência, dissocie suavemente as células em pequenos aglomerados usando um reagente de dissociação apropriado. Ressuspenda os aglomerados em 2 mL de meio E8 suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632).
    2. Agregação: Semeie 200 μL da suspensão celular (normalmente 12.000-15.000 células) em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa de 96 poços e, em seguida, centrifugue a placa a 200 × g por 3 min em temperatura ambiente para facilitar a agregação celular no fundo de cada poço.
    3. Incubação: Coloque a placa em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5% e cultive por 24 h para permitir a formação de corpos embrióides (EBs) compactos e uniformes.
    4. Prepare o meio de cultura basal (BC-M) combinando 50% de IMDM, 50% de mistura de nutrientes F12, 15 μg/mL de insulina-transferrina-selênio (ITS-G), 450 μM de monotioglicerol e 5 mg/mL de albumina sérica bovina fração V.
    5. Prepare o MD-M suplementando BC-M com Activin A (50 ng / mL), BMP4 (10 ng / mL), CHIR99021 (3 μM), FGF2 (30 ng / mL) e LY294002 (5 μM).
    6. Indução mesodérmica: Após 24 h de agregação, induzir EBs por 36 h com MD-M.
      NOTA: Para garantir a eficiência de indução e consistência dos organoides cardíacos, limitamos estritamente o uso de hESCs H9 a três passagens após o descongelamento. Essa estratégia é fundamental para manter a alta eficiência de diferenciação e a confiabilidade experimental geral.
      O manuseio suave durante a troca do meio é fundamental para preservar a integridade dos agregados formados. Evite interromper a morfologia esférica dos EBs.
  2. Indução da diferenciação mesodérmica cardíaca (dias 1,5-5,5)
    NOTA: O inibidor de sinalização Wnt (XAV-939) é fundamental para suprimir os sinais mesodérmicos posteriores e promover a especificação da linhagem cardíaca. O ácido retinóico desempenha um papel sensível à dose na padronização anteroposterior; a AR excessiva pode levar à especificação do intestino anterior.
    1. Suplemente BC-M (composição detalhada na Etapa 2.1) com BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), Ácido Retinóico (0,5 μM) e XAV-939 (5 μM) para preparar o Meio de Diferenciação Mesodérmica Cardíaca (CMD-M).
    2. Após 36-40 h de indução mesodérmica, aspire cuidadosamente o MD-M e substitua por CMD-M por 4 dias com troca de meio todos os dias.
      NOTA: Manuseie os agregados com cuidado durante as mudanças de meio para evitar interrupções mecânicas ou apoptose induzida por tensão.
      Durante este período, os esferóides tornam-se mais compactos e organizados. Os primeiros sinais de comprometimento da linhagem cardíaca podem ser observados à microscopia de campo claro no dia 5.
  3. Especificação do organoide cardíaco (dias 5,5-7,5)
    1. Suplemente BC-M (composição detalhada na Etapa 2.1) com BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL) e insulina (10 mg/mL) para preparar o meio de especificação de organoide cardíaco (COS-M).
    2. No dia 5.5, aspire suavemente o CMD-M e substitua por COS-M por 2 dias com troca média todos os dias.
      NOTA: BMP4 e FGF2 promovem sinergicamente a expansão do progenitor cardíaco e suprimem destinos não cardíacos neste estágio. A insulina suporta a atividade metabólica e o desenvolvimento estrutural da diferenciação de cardiomiócitos.
  4. Maturação do organoide cardíaco
    NOTA: Evite a dissociação total ou pipetagem de esferóides durante a transferência. Os cardiomiócitos são altamente sensíveis ao estresse de cisalhamento.
    1. Suplemento BC-M (composição detalhada na Etapa 2.1) com insulina (10 mg / mL) para preparar o Meio de Maturação Organoide Cardíaco (COM-M).
    2. A partir do dia 7.5, faça a transição para COM-M. Realize mudanças médias diariamente para manter os níveis de nutrientes e remover resíduos metabólicos, minimizando o estresse.
    3. Do dia 8 ao dia 12, procure batimentos espontâneos de organoides cardíacos, que normalmente se tornam evidentes sob um microscópio óptico.
    4. No dia 12+, confirme se o ritmo contrátil é regular e sustentado.
      NOTA: A taxa de batimento e a morfologia podem ser quantificadas usando ferramentas de microscopia de lapso de tempo e análise de imagem.
      A análise eletrofisiológica (por exemplo, imagem de cálcio ou MEA) pode ser realizada a partir do dia 12 para avaliar a maturidade funcional.

3. Preparação para criopreservação

  1. Transfira cuidadosamente os organoides cardíacos da placa de cultura usando uma pipeta de calibre largo para evitar estresse mecânico. Coloque-os em um tubo cônico de 15 mL e deixe os organoides assentarem naturalmente por gravidade por 3-5 min sem centrifugação.
  2. Preparar o meio de criopreservação (Cryo-CM) com os seguintes componentes (concentrações finais): 80% CM-M, 10% FBS, 10% DMSO.
  3. Ressuspenda suavemente os organoides cardíacos em 500 μL de Cryo-CM por criogenial.
  4. Coloque os criogeniais em um recipiente de congelamento à base de isopropanol. Conservar a -80 °C durante 12-24 h para garantir um arrefecimento gradual a ~1 °C/min.
  5. Após o congelamento durante a noite, transfira os frascos para o armazenamento de nitrogênio líquido para preservação a longo prazo.
    NOTA: Criopreservamos os organoides cardíacos a uma densidade de aproximadamente 20-30 organoides maduros por criogenial, suspensos em 1 mL de meio de criopreservação.

4. Recuperação e descongelamento de organoides cardíacos

  1. Para recuperar organoides, descongele rapidamente os frascos em banho-maria, transfira os organoides cardíacos para o meio CM-M, centrifugue suavemente para remover o DMSO e ressuspenda os organoides em CM-M fresco.
    NOTA: O batimento pós-descongelamento normalmente é retomado dentro de 24-48 h, dependendo da maturidade dos organoides e da qualidade do manuseio.

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Resultados

A diferenciação bem-sucedida de hESCs H9 em organoides cardíacos começa com o renascimento robusto e a manutenção de células-tronco pluripotentes. Após o descongelamento, as hESCs demonstram alta viabilidade e aderência quando plaqueadas em placas revestidas com vitronectina em meio E8 suplementado com um inibidor de ROCK. Dentro de 24-48 h, colônias compactas com bordas definidas e altas proporções núcleo-citoplasma podem ser observadas, indicando recuperação da morfologia indiferenciada típica (Fig...

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Discussão

A geração bem-sucedida de organoides cardíacos a partir de hESCs H9 depende da regulação temporal e espacial precisa das principais vias de sinalização para imitar o desenvolvimento cardíaco inicial. Este protocolo recapitula os estágios críticos da indução do mesoderma, especificação da linhagem cardíaca e auto-organização em estruturas contráteis 3D em um sistema quimicamente definido. O método fornece uma plataforma robusta e reprodutível para modelar o desenvolvimento do coração huma...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos a Junfeng Ji (Escola de Ciências Médicas Básicas, Universidade de Zhejiang, China) e Tao Luo (Escola de Ciências Médicas Básicas, Universidade de Zhejiang, China) por gentilmente fornecerem hESCs (H9). Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Concessão nº U23A20398 para CZ), Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (Concessão nº 2022YFS0578 e 2022YFS0614 para CZ), Fundação de Start-up de Pesquisa da Southwest Medical University (Concessão nº 00040155 para CZ), Fundação de Start-up de Pesquisa da Southwest Medical University (Concessão nº 00170071 para BW), Os Programas de Cooperação Estratégica em Ciência e Tecnologia do Governo Popular Municipal de Luzhou e da Universidade Médica do Sudoeste (Concessão nº 2024LZXNYDJ088 para BW), o Projeto de Cooperação Estratégica em Ciência e Tecnologia da Universidade Médica do Sudoeste (Concessão nº 2024PZXNYD01 para BW) e a Fundação da Universidade Médica do Sudoeste (Concessão nº 2024ZKZ014 para BW).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,02% EDTABeyotimeC0198
6 poços pratoCORNING3516
7,5% de albumina de soro bovinoACMECAC11954
Placa de fixação ultrabaixa de 96 poçosCORNING7007
Alexa Fluor 488 Burro Anti-Rato IgGYeasen34106ES60
Alexa Fluor 555 Cabra anti-coelhoInvitrogenA-21428
Cloridrato CHIR-99021YeasenRolamento 52965ES10
DMSO SolarbioD8370
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS)YeasenNº 60152ES76
FBSGibco10099141C
Proteína FGF2 Humana RecombinanteTargetMolTMPY-00749-50 μ g 
Mistura de nutrientes F-12 da Ham'sTecnologias de Vida11765054
hPSC-CDM (meio Essential 8)Cauliscell400105
Proteína recombinante BMP-4 humanaGibcoPHC9534
IMDM, suplemento GlutaMAXTecnologias de Vida31980030
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS-G)Gibco41400045
LY294002SelleckS1105-50mg
MonotioglicerolSigma-AldrichM6145
Mouse anti-αSMAAbmartMN50104
ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPIInvitrogenPág. 36966
Coelho anti-CDH5AbmartTA6265
Coelho anti-cTNTInvitrogen701620
Proteína BMP-4 humana recombinanteYeasen92053ES20
Insulina Humana Recombinante YeasenRolamento 40112ES25
Proteína Recombinante Humana / Camundongo / Rato Activina AYeasenRolamento 91702ES10
ReLeSRCélula-tronco100-0483
Ácido retinóicoSigma-AldrichR2625
VitronectinaGibcoRolamento A14700
XAV-939SelleckS1180
Y-27632 2HCl (inibidor de ROCK)SelleckS1049

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Células-tronco Embrionárias HumanasAuto-organização 3DDiferenciação de CardiomiócitosEspecificação de LinhagemAnálise de ImunofluorescênciaImagem de lapso de tempoTroponina T CardíacaCélulas de Músculo Liso
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