Artigo de método

Uso da microperfusão cerebral de fluxo aberto para a coleta longitudinal de fluido intersticial em um modelo animal de glioblastoma

DOI:

10.3791/68748

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23 de dezembro de 2025

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1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Neste artigo

Resumo

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In vivo, as comunicações intercelulares que sustentam muitas doenças do sistema nervoso central, como o glioblastoma (GBM), são notoriamente difíceis de medir e caracterizar. Aqui, descrevemos procedimentos de microperfusão cerebral de fluxo aberto (cOFM) que podem ser empregados para amostrar componentes de fluido intersticial em um modelo animal longitudinal da GBM.

Resumo

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Doenças do sistema nervoso central (SNC) se manifestam por meio de uma rede complexa e dinâmica de comunicação intercelular. O glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais comum e agressivo, é emblemático dessa complexidade, com sua rápida progressão e prognóstico desanimador medidos em meses, e não em anos. A biologia do GBM é impulsionada por intrincadas trocas de moléculas de sinalização entre células neoplásicas e estromalas, sustentando a progressão agressiva da doença. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado de microperfusão cerebral de fluxo aberto (cOFM) em modelos camundongos GBM, permitindo monitoramento longitudinal em tempo real da dinâmica do microambiente tumoral dentro do fluido intersticial (ISF). Nossa abordagem descreve a implantação de suportes duradouros na cabeça da cânula guia, seu uso para entravimento intracerebral de glioma diretamente através do guia e a coleta de amostras de cOFM de alta fidelidade para análises metabolômicas e proteômicas de LC-MS. Crucialmente, o cOFM supera as limitações de tamanho molecular da microdiálise tradicional. Além do GBM, a metodologia cOFM promete insights transformadores sobre um espectro de distúrbios do SNC, incluindo condições neurodegenerativas, epiléticas e neuropsiquiátricas, por meio de sua capacidade de fornecer biomarcadores etiológicos e responsivos ao tratamento dentro de seus respectivos modelos animais.

Introdução

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Investigar doenças do sistema nervoso central (SNC) é notoriamente desafiador devido à sinalização intercelular complexa e multimodal mediada pelo fluido intersticial (ISF)1,2,3,4. Essa complexidade é particularmente pronunciada em tumores cerebrais, como o glioblastoma (GBM), onde sinais intercelulares são transmitidos entre células neoplásicas e estromais 5,6,7,8,9. Em muitos casos, a troca aberrante de biomoléculas diversas, incluindo metabólitos e mensageiros proteicos, contribui para a etiologia subjacente das patologias do SNC. Esse desafio investigativo é agravado, especialmente na GBM, pelo fato de que a composição molecular da ISF é temporalmente dinâmica e evolui ao longo da progressão da doença, bem como em resposta a tratamentosintervencionistas 10,11.

Métodos tradicionais de investigação pré-clínica de GBM incluem estudos in vitro e modelos animais com desfecho único. A natureza dessas abordagens limita sua aplicabilidade clínica mais ampla devido à sua incapacidade de capturar tanto as características do microambiente tumoral quanto as alterações temporais longitudinais. Avanços feitos no início dos anos 1980 superaram essas limitações contextuais com o desenvolvimento da microdiálise intracerebral (cMD)12,13,14,15. Desde sua criação há 45 anos, a cMD se estabeleceu como o método padrão para amostragem longitudinal de fluido intersticial (ISF) no cérebrovivo 16. Isso é realizado por meio da difusão livre e convecção de solutos ISF de alta concentração através de uma membrana semipermeável em um fluido cefalorraquidiano (aCSF)17, tipicamente artificial e de baixa concentração de solutos, perfusado continuamente e de baixa concentração de solutos. Essas membranas semipermeáveis são compostas por vários polímeros biocompatíveis com cortes comuns de tamanho de poros de peso molecular que variam de 20 kDa a 3MDa 18. Esse procedimento minimamente invasivo permite a coleta longitudinal in situ de uma diversidade de analitos, que vão desde pequenas moléculas, como metabólitos ou neurotransmissores, até proteínas grandes, como anticorpos. No entanto, a porosidade estrutural das membranas de cMD, aliada à natureza adsorvente de seus polímeros composicionais, pode impactar significativamente a recuperação relativa de analitos com características bioquímicas ou dimensionais particulares, como lipídios ou anticorpos, respectivamente19,20.

Avanços para superar essa limitação das membranas de cMD começaram no início da década de 2010 com o desenvolvimento da microperfusão cerebral de fluxo aberto (cOFM)21. Funcionando sob princípios gerais semelhantes aos do cMD, o cOFM remove limitações bioquímicas impostas por membranas semipermeáveis ao substituí-las por uma sonda de rede plástica com aberturas macroscópicas de baixa adsorção de aproximadamente 100 μm tamanho20. Diversos relatos demonstraram a utilidade aprimorada do cOFM sobre o cMD por meio da coleta de componentes detectáveis do ISF, incluindo hormônios peptídicos, nanocorpos/anticorpos, pequenas terapias lipofílicas e lipossomos PEGilados 19,22,23,24,25. Relatórios anteriores que examinaram a reação fisiológica do tecido à implantação da sonda guia cOFM mostram que a integridade da barreira hematoencefálica é restabelecida aos 15 dias após a implantação, e que nenhuma cicatriz glial é formada até 30 dias apósa implantação 26. Devido à substituição das membranas de microdiálise por aberturas macroscópicas, os pesquisadores também demonstraram a capacidade inovadora das sondas guia cOFM para facilitar a injeção de células de glioma xenoenxertadas nos cérebros de ratos imunodeficientes, de modo que o enfratimento e crescimento tumoral atraumáticos ocorram diretamente ao redor da área de amostragem27 do cOFM.

Considerações no uso da cOFM no estudo das patologias do SNC ainda devem reconhecer suas limitações metodológicas. Devido à sua dependência da difusão passiva e convecção dos analitos ISF em um perfusado em fluxo, essas limitações giram em torno da concentração do analito e do volumeamostral 18. Os componentes amostrados do ISF serão diluídos dentro do perfusado de cOFM coletado em comparação com os níveis endógenos, levando a muitas investigações para comparar razões relativas de analitos entre condiçõesexperimentais 28. As vazões típicas variam de 0,1 μL/min a 1,0 μL/min, equivalentes a apenas 6 μL/h a 60 μL/h. Ao considerar os tempos de liberação do espaço morto dos tubos, também se deve considerar a duração total da amostragem. Isso é particularmente importante ao realizar coletas de cOFM em animais anestesiados, onde preocupações com o bem-estar animal devem ser cuidadosamente tratadas. Uma descrição mais detalhada dessas e de outras considerações está disponível em um relatório anterior de métodos da equipe de desenvolvimento docOFM 29.

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo atualizado para o uso da amostragem longitudinal de cOFM no estudo de doenças neurológicas, com foco na GBM. O protocolo inclui etapas para implantação de cânula guiada por cOFM, injeção de células tumorais e entravimento através do guia cOFM, bem como duas configurações de amostragem de cOFM em animais acordados e em movimento livre. Apresentamos dados representativos demonstrando efeitos do tratamento nos componentes metabolômicos e proteômicos do ISF medidos por cOFM, o impacto da configuração amostral nas concentrações de analitos e a eficácia da implantação de células tumorais guiadas por cOFM.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais dentro deste protocolo são aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Northwestern University (ID do protocolo: IS00021383) e seguem as Diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH). Esse protocolo foi desenvolvido para uso em camundongos C57BL/6J, tanto machos quanto fêmeas, com idade mínima de 8 a 10 semanas. A linhagem celular de glioma murino usada neste protocolo, CT2A, foi fornecida pelo Laboratório Seyfried da Universidade de Boston e foi cultivada e preparada após condições de cultura de tecido estéreis.

1. Planejamento e preparação cirúrgica

  1. Informações animais: Para experimentos com cOFM, use camundongos com no mínimo 8-10 semanas de idade para permitir o crescimento e desenvolvimento completos. Implantes cranianos em posição fixa podem se deslocar ou prejudicar o crescimento adequado no crânio e/ou cérebro ainda em desenvolvimento.
  2. Seleção de coordenadas cirúrgicas: Use um atlas cerebral animal para localizar as coordenadas ortogonais da região de interesse em relação ao Bregma. Por exemplo, implantações de células de glioma são tipicamente realizadas no estriado para melhor replicar os microambientes nativos do GBM e maximizar a eficácia do desenvolvimento tumoral subsequente. As coordenadas de implantação do guia de cOFM usadas neste protocolo são mediolaterais (ML) = 2,5 mm, anteroposterior (AP) = 0 mm e dorsoventral (DV) = 3,5 mm.
    NOTA: As coordenadas estereotáxicas podem variar entre linhagens e idades de camundongo. Por favor, utilize coordenadas atlas específicas por espécie e cepa para garantir a colocação desejada do guia cOFM.
  3. Seleção de configurações apropriadas de componentes cOFM: Ordenar componentes para configurações apropriadas de cOFM em comprimentos totais específicos variando de 2 mm a 22 mm, com comprimentos de superfície aberta de 1 mm a 2 mm.
    NOTA: Animais podem desalojar cabeceiras cOFM implantadas de forma inadequada enquanto realizam comportamentos de tosa. Para minimizar a alavanca mecânica sobre a montagem da cabeça durante esta atividade, recomendamos o uso de guias não maiores que 2 a 3 mm acima da distância de coordenadas DV pretendida.
  4. Planejamento dos prazos dos procedimentos cirúrgicos e de amostragem para objetivos experimentais: Dependendo da doença de interesse e das características do modelo, planeje cuidadosamente o tempo e a ordem dos procedimentos relacionados à cOFM para investigar de forma ideal a biologia subjacente em questão.
    1. Se investigar diferenças de composição ISF entre microambientes saudáveis de cérebro e tumor, realize procedimentos de amostragem de cOFM antes e após a implantação do tumor no mesmo animal.
    2. Se investigar os efeitos de intervenções clínicas em patologias do SNC, realize procedimentos de amostragem de cOFM antes e após a administração em coortes animais paralelas que recebam tratamento controle ou experimental.

2. cirurgia de colocação guiada cOFM

  1. Monte ferramentas cirúrgicas para cOFM, guie a cirurgia de colocação ( Tabela de Materiais) e esterilize por autoclave, se necessário.
  2. Preparação para o escritório cirúrgico:
    1. Desinfete o gabinete de biossegurança: Realize procedimentos cirúrgicos dentro de um gabinete de biossegurança devidamente desinfetado. Ative o fluxo de ar do armário de biossegurança e limpe as superfícies internas com um desinfetante e método de limpeza aprovados institucionalmente. Forre a superfície inferior do armário com cortinas estéreis.
    2. Prepare instrumentos estereotáxicos: Limpe a estrutura estereotáxica com um desinfetante e coloque-a no armário de bio-segurança. Da mesma forma, limpe e desinfete a furadeira estereotáxica e o suporte do guia e coloque-os no armário de bio-segurança.
    3. Bolsa térmica na fase cirúrgica: Use uma bolsa térmica na fase cirúrgica estereotáxica para fornecer calor suplementar enquanto o animal está anestesiado. Limpe e desinfete a superfície da almofada térmica e coloque-a sobre a estrutura estereotáxica onde o animal estará posicionado. Ligue a bolsa térmica em fogo baixo e coloque 1 ou 2 cortinas estéreis por cima.
    4. Coloque instrumentos e equipamentos cirúrgicos adicionais: Coloque asepticamente equipamentos esterilizados adicionais no gabinete de biossegurança.
    5. Configuração da gaiola de recuperação: Coloque uma gaiola de recuperação limpa sobre uma almofada térmica ajustada na temperatura mais baixa possível. Cada animal precisará ser colocado em uma gaiola individual de recuperação até que esteja totalmente recuperado, portanto, o número total de gaiolas de recuperação dependerá do desempenho e do tempo de recuperação da cirurgia.
  3. Preparações pré-cirúrgicas para animais (resumidas na Figura 1A):
    1. Anestesia: Administrar compostos e doses anestésicos aprovados institucionalmente para alcançar a profundidade adequada do anestésico, utilizando o teste do reflexo de pinçar da pata, além de profundidade/frequência respiratória para garantir anestesia suficiente. Por exemplo, a injeção intraperitoneal de coquetel cetamina-xilazina (100 mg/kg - 10 mg/kg, em soro) é suficiente para alcançar a profundidade anestésica adequada para camundongos C57BL/6J.
    2. Analgesia: Administrar compostos analgésicos aprovados institucionalmente para auxiliar no manejo da dor peri e pós-operatória. Por exemplo, a injeção subcutânea de meloxicam (20 mg/kg, em soro) é adequada para o manejo da dor perioperatória.
    3. Depilação (barbear, creme depilatório): Remova pelos do local cirúrgico pretendido no topo do crânio usando um barbeador elétrico e/ou creme depilatório. Se usar creme depilatório, certifique-se de que não fique muito tempo na pele para evitar irritação.
    4. Pomada oftálmica: Use um aplicador estéril com ponta de algodão para aplicar suavemente pomada oftálmica em ambos os olhos, prevenindo o ressecamento da córnea durante a cirurgia.
    5. Colocação do animal no quadro estereotáxico: Coloque corretamente o animal no quadro estereotáxico, inserindo incisivos no bloco de mordida, inserindo barras auriculares firmemente, mas suavemente, nos canais auditivos e prendendo o pinço do nariz sobre o osso nasal do animal ( Figura 1B). Se posicionado corretamente, o crânio do animal deve ser firmemente fixado sem qualquer movimento.
    6. Preparações assépticas do local cirúrgico: Limpe a pele ao redor da área cirúrgica com três cotonetes alternadas de álcool (etil- ou isopropílico) e iodo de povidona para desinfetar assépticamente a área para a incisão.
  4. Preparação da incisão e da superfície do crânio:
    NOTA: Todos os passos a seguir devem ser realizados da forma mais asséptica possível. Para isso, o cirurgião veterinário principal deve usar luvas cirúrgicas estéreis em vez de luvas de laboratório padrão antes de continuar para a incisão.
    1. Local e comprimento da incisão: Use um bisturi estéril para fazer uma incisão sagital na linha média ao longo da superfície do crânio, começando entre os olhos e estendendo-se caudalmente por 8-10 mm ( Figura 1C).
    2. Retração da pele: Use pinças estéreis, aplicadores com ponta de algodão e/ou uma lâmina de bisturi para retrair lateralmente a pele da incisão média. Certifique-se de que tanto Bregma quanto Lambda estejam visíveis e estenda a incisão, caso contrário.
    3. Incisão do periósteo: Use um bisturi estéril para fazer uma incisão no periósteo e retraa lateralmente o tecido com pinças.
    4. Swab de peróxido de hidrogênio: Limpe a superfície do crânio com peróxido de hidrogênio diluído 1%-3% aplicado com um aplicador estéril com ponta de algodão ( Figura 1D). Isso também auxilia na identificação de Bregma e Lambda por meio das suturas craniana sagital, coronal e lambdóide.
    5. Adesivo dentário auto-gravável: Use uma seringa de insulina de 0,3 mL a 1,0 mL para aplicar uniformemente 20-40 μL de adesivo dentário auto-gravante na superfície do crânio ( Figura 1D). Aplique uma luz de cura dental para ajudar na gravação. Uma vez curado, use aplicadores estéreis com ponta de algodão e soro fisiológico para remover o excesso de adesivo.
      ATENÇÃO: Adesivos dentários auto-graváveis, como o Bond Force, são substâncias potencialmente perigosas: perigo inflamável (GHS02: H225), risco à saúde (GHS07 e GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) e perigo ambiental (GHS09: H412). Por favor, siga as diretrizes locais e institucionais para o descarte adequado de resíduos perigosos.
  5. Localização e perfuração de furos de rebarba:
    1. Insira uma broca esterilizada de 0,7 mm na microfuradeira e instale a furadeira na armação estereotáxica com o suporte apropriado.
    2. Localize o Bregma na interseção dos pontos sagital e coronal e use micromanipuladores estereotáxicos para posicionar a broca ali.
    3. Reposicione a broca para a coordenada guia cOFM (ML = 2,5, AP = 0,0), engate a broca a 15.000 rpm e perfure cuidadosamente um furo de rebarba ajustando o mostrador do micromanipulador DV (Figura 1E). Observe frequentemente a espessura do crânio durante a perfuração para evitar danos ao cérebro subjacente. Use soro fisiológico durante a perfuração para remover os resíduos ósseos e reduzir o calor entre a broca e o crânio.
    4. Repita o procedimento de perfuração para cada coordenada do parafuso de ancoragem (Figura 1E). As localizações recomendadas para parafusos de ancoragem são ML = 2,5, AP = -2,5, ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. Após os furos das rebarbas, desligue a microfuradeira e o suporte da furadeira da estrutura estereotáxica.
    6. Use uma agulha de 30 G para perfurar suavemente a dura-mátera sob o orifício da rebarba guia do cOFM.
  6. Instale parafusos de ancoragem usando um par de pinças estéreis e uma chave de fenda estéril do tamanho adequado (Figura 1F). Dependendo do passo da rosca do parafuso, a ancoragem é suficiente quando o parafuso é inserido com um ou dois comprimentos de rosca de profundidade. Tome cuidado para não cravar os parafusos das âncoras muito fundo para evitar danos ao córtex.
  7. Instale o guia cOFM e o conjunto de dummy cOFM no suporte do guia e no suporte do suporte no quadro estereotáxico. Posicione a ponta guia cOFM acima do furo da rebarba (ML = 2,5 mm, AP = 0,0mm) a uma altura DV igual à do Bregma, e desça lentamente a guia cOFM pelo furo da rebarba até a profundidade pré-determinada apropriada a uma taxa de 1 mm/min ( Figura 1F). Por exemplo, a profundidade de colocação do guia cOFM com implantação subsequente de células tumorais é DV = -3,5 mm.
  8. Aplique agente de cimento na superfície do crânio, garantindo que cubra as áreas sob e ao redor dos parafusos guia e ancoragem do cOFM em uma camada fina e uniforme. Use uma luz de cura dental para endurecer cada camada de agente cimentante antes de aplicar as camadas seguintes ( Figura 1G). Continue aplicando o agente de cimento até que a superfície do crânio entre cada componente seja coberta, os parafusos de ancoragem estejam completamente cobertos e a área sob a guia cOFM até e ao redor do sulco seja coberta. Tome cuidado para não colocar o agente de cimento sobre ou perto da cunha de travamento.
    ATENÇÃO: Agentes cimentantes, como o Tetric EvoFlow, são substâncias potencialmente perigosas: risco à saúde (GHS07: H317, H319, H335, H360). Por favor, siga as diretrizes locais e institucionais para o descarte adequado de resíduos perigosos.
  9. Desconecte o suporte do guia do guia cOFM e levante lentamente o suporte com o botão de ajuste DV do micromanipulador. Remova o micromanipulador do quadro estereotáxico.
  10. Desprenda o animal da estrutura estereotáxica primeiro afrouxando e removendo as barras auriculares, afrouxando e retraindo a grampa do nariz, e então levantando os incisivos do animal do bloqueio de mordida.
  11. A pele do ponto fechada acima do agente cimentante dentário, garantindo que o corpo guia do cOFM permaneça exposto. Suturas 4-0 absorvíveis, como ácido poliglicólico (PGA) ou poliglactina (Vicryl), são recomendadas (Figura 1H).
  12. Aplique pomada antibiótica tripla na área da pele adjacente à incisão original.
  13. Recuperação e apoio animal:
    1. Transfira o animal para uma gaiola isolada de recuperação (um animal por gaiola) e forneça calor suplementar de uma almofada térmica em baixa temperatura.
    2. Opcional: Forneça ao animal um agente de reversão anestésica para acelerar a recuperação. Por exemplo, injeções subcutâneas de atipamezol (1 mg/kg, em soro fisiológico) aceleram os tempos de recuperação anestésica de aproximadamente 1 hora para aproximadamente 20 minutos.
    3. Forneça observação e suporte contínuos até que o animal recupere suficientemente a consciência e a reclinação esternal. Não deixe os animais desacompanhados até que estejam totalmente recuperados da cirurgia e da anestesia.
    4. Uma vez que o animal se recupere totalmente, ele pode ser devolvido a gaiolas de moradia coletiva com outros animais.
    5. Um dia após a cirurgia, forneça suporte adicional de analgésicos administrando um analgésico aprovado institucionalmente, como meloxicam (veja passo 2.3.2).
  14. Permita um tempo de recuperação de 14 dias após a cirurgia de implantação cOFM para permitir a cicatrização completa da barreira hematoencefálica antes de realizar quaisquer procedimentos adicionais nos animais.

3. Implantação de células de tumor intracraniano por guia cOFM

  1. Cultura celular e preparação:
    1. Cultive e expanda as células de acordo com protocolos específicos de cada tipo celular. Por exemplo, células sincênicas de glioma de camundongo, como CT2A, podem ser cultivadas em panelas de 10 cm ou frascos T-75 contendo DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de suplementos de penicilina/estreptomicina.
    2. Prepare as células cultivadas para implantação de acordo com protocolos específicos de cada tipo celular.
      1. Por exemplo, com células de glioma CT2A sinteicas, remova o meio de crescimento, lave brevemente com PBS e incube as células por 5 minutos em 0,05% de tripsina (com 0,53 mM de EDTA) a 37 °C.
      2. Neutralize a tripsina com volume igual de DMEM contendo 1% de FBS, transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C para as células de pellet.
      3. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS (ou soro fisiológico). Determine o número total de células por mL com um hemocitometro manual ou automático. Centrifuge novamente a suspensão da célula a 300 x g por 5 minutos a 4 °C, remova o sobrenadante e ressuspenda em um volume apropriado de PBS (ou soro) para alcançar 50.000 células por μL. Coloque a suspensão das células no gelo até estar pronto para implantação (passo 3.5.2).
  2. Monte ferramentas cirúrgicas para a cirurgia de implantação de células de tumor intracraniano (Tabela de Materiais) e esterilize por autoclave, se necessário.
  3. Preparação para espaços cirúrgicos
    1. Desinfetar gabinete de biossegurança: Veja o passo 2.2.1.
    2. Prepare instrumentos estereotáxicos: Limpe a estrutura estereotáxica com desinfetantes e coloque-a no armário de bio-segurança. Da mesma forma, limpe e desinfete o suporte da seringa montado no estereotático e prenda-o à armação estereotáxica.
    3. Execute os passos 2.2.3.-2.2.5. para os restantes passos preparatórios.
  4. Preparações pré-cirúrgicas para animais:
    1. Execute os passos 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4. e 2.3.5. para preparação animal.
  5. Implantação de células tumorais:
    1. Montagem da seringa e do insert de infusão (resumida na Figura 2)
      1. Deixe os conectores de tubo flangeado de molho em etanol a 70% por pelo menos 5 minutos.
      2. Insira a ponta de uma seringa de vidro estanque esterilizada de 10 μL ou 25 μL em uma das extremidades de um conector de tubo flangeado.
      3. Coloque a entrada de um inserto de infusão cOFM na outra extremidade do conector do tubo.
      4. Fixe o conjunto do inserto da seringa e infusão no suporte da seringa montado estereotáticamente.
    2. Carregue o conjunto do insert da seringa-infusão com um volume apropriado de suspensão celular. Por exemplo, carregue 3 μL de suspensão celular a 50.000 células por μL, totalizando 150.000 células por animal.
    3. Substituindo o inserto de ficção pelo inserto de infusão:
      1. Use pinças para remover a cunha de travamento do guia cOFM e do conjunto do dummy, depois levante suavemente o boneco cOFM do guia.
      2. Use os botões de ajuste ML e AP no micromanipulador para manobrar o conjunto da seringa-inserto de infusão acima da guia cOFM. Use o botão de ajuste DV para abaixar cuidadosamente o inserto de infusão no guia cOFM e fixá-lo na posição reinserindo firmemente a cunha de travamento com pinças.
    4. Injete 3 μL de suspensão celular da seringa a uma taxa de 1 μL/min. Observe cuidadosamente a área ao redor do guia cOFM e do inserto de infusão para garantir que nenhuma suspensão de célula saia do conjunto. Após a injeção de todo o volume, aguarde mais 1 minuto para que a pressão intracraniana se estabilize.
    5. Substitua o inserto de infusão por um inserto de ficção.
      1. Use pinças para remover a cunha de travamento do guia cOFM e do conjunto do inserto, depois ajuste suavemente o botão de ajuste DV do micromanipulador para levantar o inserto de infusão cOFM do guia.
      2. Coloque o boneco cOFM no guia e prenda-o na posição reinserindo a cunha de travamento com pinças.
  6. Desprenda o animal da estrutura estereotáxica primeiro afrouxando e removendo as barras auriculares, afrouxando e retraindo a grampa do nariz, e então levantando os incisivos do animal do bloqueio de mordida.
  7. Recuperação e apoio animal:
    1. Transfira o animal para uma gaiola isolada de recuperação (um animal por gaiola) e forneça calor suplementar de uma almofada térmica em baixa temperatura.
    2. Opcional: Forneça ao animal um agente de reversão anestésica (como atipamezol) para acelerar a duração da recuperação, veja o passo 2.13.2.
    3. Forneça observação e suporte contínuos até que o animal recupere suficientemente a consciência e a reclinação esternal. Não deixe os animais desacompanhados até que estejam totalmente recuperados da cirurgia e da anestesia.
    4. Uma vez que o animal se recupera totalmente, ele pode ser devolvido às gaiolas de moradia comunitária com a companhia de outros animais.
    5. No dia seguinte à cirurgia, forneça suporte adicional de analgésicos administrando um analgésico aprovado institucionalmente, como meloxicam (veja passo 2.3.2).
      NOTA: Se for utilizada linhagens celulares luciferase-positivas, a imagem bioluminescente (BLI) pode ser realizada de 1 a 2 semanas após a implantação celular para verificar o sucesso do enfrate tumoral. Embora características físicas como pelo animal ou presença na cabeça possam dificultar a luminescência detectada, elas ainda podem ser usadas para fazer aproximações aproximadas aproximadas da presença ou ausência tumoral. Alternativamente, a ressonância magnética pode ser realizada se os parafusos de ancoragem usados na colocação da guia cOFM não forem ferromagnéticos e compatíveis com ressonância magnética.

4. amostragem cOFM do líquido intersticial cerebral

NOTA: Dada sua dependência da difusão passiva de analito, as amostras de cOFM contêm concentrações diluídas de analito em comparação com o ambiente endógeno ISF. Por isso, vários métodos já foram propostos anteriormente para calibrar as medições amostrais de modo a refletir melhor as concentrações in situ 18. Esta seção descreve duas modalidades de amostragem diferentes. Passo 4.1. descreve o modo de configuração recomendado pelo fabricante (daqui em diante, referido como fracionado) que oferece maior sensibilidade temporal, mas às custas da concentração do analito. Passo 4.2. detalha um modo alternativo de configuração que desenvolvemos (daqui em diante referido como recirculado) que pode alcançar maior concentração de analito à custa de uma resolução temporal diminuída.

  1. Amostragem fracionada de cOFM (resumida na Figura 3A):
    1. Deixe os conectores de tubos flangeados de molho em etanol a 70% por pelo menos 5 minutos para facilitar a fixação em tubos e inserts de amostragem.
    2. Carregue o saco de perfusado com aCSF suficiente. Por exemplo, 680 μL é minimamente suficiente tanto para um flush de linha de 20 minutos a 10 μL/min quanto para uma amostragem de 8 horas a 1 μL/min. No entanto, recomenda-se um volume mínimo de 2 mL para evitar o colapso e o mau funcionamento do saco de perfuso.
    3. Preencha as linhas de tubo de empurrar e puxar com um volume apropriado de aCSF usando seringas de vidro herméticas. Por exemplo, o Tubo Universal de Empurra-Puxar Low-Bind tem um diâmetro interno de 0,25 mm e comprimentos individuais de tubo de 100 cm. Isso equivale a aproximadamente 1 μL por 2 cm, e portanto aproximadamente 55 μL no tubo de empurrar e 100 μL no tubo de puxação.
    4. Instale corretamente a seção peristáltica do tubo na cabeça da bomba de microperfusão, conforme mostrado na Figura 3A.
      NOTA: Consulte o manual de instruções do BASi para instruções adicionais, se necessário.
    5. Conecte o saco de perfuso à seção de empurrar do tubo usando o conector Luer lock (Figura 3A, componente i).
    6. Conecte o inserto de amostragem às linhas de tubo usando conectores de tubo flangeado. A entrada do insert de amostragem (comprimento maior do eixo) deve ser fixada na extremidade de saída do tubo de empurramento, oposta à linha do tubo do saco de perfusado (Figura 3A, canto superior esquerdo). A saída do insert de amostragem (eixo mais curto) deve ser fixada à extremidade de entrada do tubo de puxação, paralela à linha do tubo do saco de perfusado (Figura 3A, canto superior direito). Coloque o inserto de amostragem conectado em um tubo estéril de microcentrífuga contendo 750 μL de aCSF em preparação para a lavagem do sistema.
    7. Conecte a agulha do coletor de frações com um conector de tubo flangeado à linha de saída do tubo de puxão (extremidade oposta à saída do inserto de amostragem).
    8. Realize uma lavagem do sistema de tubos por 20 minutos a 10 μL/min para remover quaisquer bolhas de gás presas dentro do sistema de tubos.
    9. Configuração do coletor de frações:
      1. Rotule e pese os tubos de coleta de frações, anotando cada peso para comparação e validação subsequente do volume da amostra coletada. Coloque tubos nas ranhuras correspondentes do carrossel coletor de frações.
      2. Ligue o coletor de frações e configure as configurações para os valores desejados. Exemplos de configurações incluem # de amostras, tempo de amostragem (m), atraso (horas), resfriamento do refrigerador e modo _cannula.
        NOTA: O descarte do volume de fluido em espaço morto no tubo de tração que nunca entrou em contato com ISF ortotópico é aproximado por i) comprimento e volume do tubo (aproximadamente 2 cm/μL para OFM-PP2-100-LB), ii) vazão e iii) atraso (horas). Esses parâmetros devem ser cuidadosamente considerados ao montar o sistema de coleta para garantir a coleta adequada das frações.
  2. Amostragem recirculada de cOFM (resumida na Figura 3B):
    1. Deixe os conectores de tubos flangeados de molho em 70% de etanol para facilitar a fixação em tubos e inserções de amostragem.
    2. Preencha a linha do tubo de puxar com o volume apropriado de aCSF usando seringas de vidro herméticas.
    3. Instale corretamente a seção peristáltica do tubo na cabeça da bomba de microperfusão.
    4. Conecte o inserto de amostragem às linhas de tubo usando conectores de tubo flangeado. A entrada do inserto de amostragem (comprimento maior do eixo) deve ser fixada à extremidade de saída do tubo de puxação. A saída do insert de amostragem (eixo mais curto) deve ser fixada à extremidade de entrada do tubo de puxão. Coloque o inserto de amostragem conectado em um tubo estéril de microcentrífuga contendo 750 μL de aCSF em preparação para a lavagem do sistema.
    5. Realize uma lavagem do sistema de tubos por 20 minutos a 10 μL/min para remover quaisquer bolhas de gás presas dentro do sistema de tubos.
  3. Configuração do sistema de gaiola giratória:
    NOTA: Sistemas de gaiolas animais rotativas, como o Sistema Raturn, facilitam a amostragem de cOFM de animais acordados ao evitar o hiperenrolamento e o emaranhado dos tubos de empurrar e puxar. Isso também pode ajudar na automação da amostragem de cOFM, eliminando a necessidade de desembaraçar manualmente tubos durante sessões de coleta de cOFM despertas.
    1. Coloque a cama limpa da gaiola uniformemente pelo piso giratório e equipe a gaiola com fontes de comida e água facilmente acessíveis.
    2. Ligue o controlador de rotação da gaiola e teste sua atividade girando a amarra suspensa. A gaiola deve girar em relação à direção rotacional transmitida ao cabo. Configure o controlador de rotação em modo de espera até que o animal esteja preso ao cabo.
  4. Conectando o animal ao sistema cOFM:
    NOTA: A conexão e o descolamento dos animais ao sistema cOFM são mais facilmente realizados enquanto o animal está sob anestesia temporária de isoflurano. Se realizado corretamente, esse processo leva no máximo 5 minutos por animal; No entanto, o uso de pomada oftálmica é altamente recomendado.
    1. Anestesia animal: Coloque o animal na câmara de indução da anestesia isoflurana. Comece a anestesia com fluxo de oxigênio a 2 L/min e isoflurano ajustado para 3%. Observe o animal até que ele atinja um nível adequado de anestesia (imóvel, com uma frequência respiratória de aproximadamente 1 respiração/s). Transfira o animal da câmara de indução para a máscara anestésica ajustada a 2 L/min de fluxo de oxigênio e 3% de isoflurano.
    2. Revestimento animal: Coloque o animal em uma jaqueta do tamanho apropriado, passando completamente os membros anteriores pelas cavas e prendendo a jaqueta firmemente ao longo das costas do animal (mostrado na Figura 3C).
    3. Substituindo o inserto de dummy pelo de amostra: Use uma pinça para remover a cunha de travamento do conjunto do guia e do dummy e levante cuidadosamente o boneco para fora do guia. Instale a amostragem com cuidado, insira-a no guia e depois reinsira a cunha de travamento.
    4. Retire o animal da anestesia e coloque-o no sistema de gaiola giratória. Prenda o laço da gaiola ao casaco do animal e ative o sistema de gaiola giratória.
  5. Realizando amostragem cOFM:
    1. Ajuste as bombas de microperfusão para 5 μL/min e realize uma lavagem de 2 minutos para remover quaisquer microbolhas que possam ter resultado da instalação do inserto de amostragem cOFM.
    2. Altere as configurações da bomba de microperfusão para a vazão desejada corretamente para o modo de bombagem (por exemplo, 1 μL/min).
    3. Ative o modo bomba. Se for realizada amostragem fracionada de cOFM, ative o coletor de frações.
    4. Durante as etapas iniciais da amostragem de cOFM, faça observações detalhadas do tubo de empurrar e puxar para garantir a ausência de bolhas de gás, pois isso prejudicará o funcionamento adequado da máquina e a coleta da amostra, podendo potencialmente colocar o animal em perigo. Se bolhas de gás forem observadas, pare os componentes do sistema, desprenda o animal do sistema cOFM e remova as bolhas de gás por meio de aCSF através do tubo.
    5. Durante toda a duração do processo de amostragem de cOFM, faça observações adicionais frequentes do tubo de cOFM e do comportamento animal. Se o comportamento animal indicar mudanças repentinas na saúde, pare imediatamente os componentes do sistema e trate da preocupação com a saúde animal. Consulte a equipe veterinária institucional, se necessário.
  6. Desligar um animal do sistema cOFM:
    1. Desative o sistema de gaiola rotativa e desconecte o laço da jaqueta do animal.
    2. Transfira o animal para a câmara de indução de anestesia isoflurana, com o inserto de amostragem e o tubo cOFM ainda acoplados. Comece a anestesia com fluxo de oxigênio a 2 L/min e isoflurano ajustado para 3%. Observe o animal até que ele atinja um nível adequado de anestesia (imóvel, com uma frequência respiratória de aproximadamente 1 respiração/s). Transfira o animal da câmara de indução para a máscara anestésica ajustada a 2 L/min de fluxo de oxigênio e 3% de isoflurano.
    3. Substitua o inserto de amostragem por um inserto fictício: Use um par de pinças para remover a cunha de travamento do conjunto do guia e do inserto de amostragem, e levante cuidadosamente o inserto de amostragem do guia. Instale cuidadosamente o inserto de dummy de volta no guia, depois reinsira a cunha de travamento.
    4. Desjaqueta: Descolhe os fechos da parte de trás da jaqueta do animal e remova suavemente a jaqueta do animal.
    5. Recuperação e observação do animal: Retire o animal da anestesia com isoflurano e coloque-o em uma gaiola limpa de recuperação, proporcionando observação contínua até que o animal recupere totalmente a consciência e a reposição esternal. Coloque novamente em uma gaiola doméstica assim que o animal estiver totalmente recuperado.
  7. Coleta e armazenamento de amostras:
    1. Amostragem fracionada:
      1. Remova os tubos de coleta de frações do coletor de frações e coloque sobre gelo para transporte de curto prazo.
      2. Pese cada tubo de coleta e compare com o peso pré-coleta para verificar o volume da amostra.
      3. Prossiga para análises posteriores de amostras de cOFM ou coloque-as em um freezer a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
    2. Amostragem recirculada:
      1. Deixando o tubo de puxação conectado à saída do inserto de amostragem cOFM (eixo mais curto), desprenda-se do restante do sistema e coloque o tubo e o inserto de amostragem em um novo tubo de microcentrífuga limpo.
      2. Conecte uma agulha estéril de 18G a uma seringa estéril de 1 mL a 5 mL e enche com ar.
      3. Insira cuidadosamente a agulha no conector flangeado do tubo na extremidade de entrada do tubo de puxação.
      4. Garantindo que o inserto de amostragem de cOFM permaneça no tubo da microcentrífuga, pressione o êmbolo da seringa para ejetar o volume recirculado da amostra de cOFM do tubo de puxação com ar. Certifique-se de que toda a amostra de cOFM seja ejetada do tubo de puxada e para dentro do tubo da microcentrífuga, destacando a seringa e reabastecendo com ar se necessário.
      5. Coloque a amostra recirculada de cOFM no gelo para transporte de curto prazo.
      6. Prossiga para análises posteriores ou coloque-as em um freezer a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
  8. Armazenar suprimentos de cOFM se repetir a amostragem de cOFM no mesmo animal:
    NOTA: O reuso de descartáveis cOFM, como inserções de amostragem e tubos de entrada/saída, não é recomendado pelo fabricante.
    1. Lave o tubo push-pull cOFM com aproximadamente 500 μL de aCSF estéril ou soro fisiológico a uma taxa não superior a 10 μL/min. Em seguida, faça uma lavagem semelhante de 1-2 mL de 70% de etanol. Por fim, use uma seringa de 5 ou 10 mL equipada com uma agulha de 18G e um conector de tubo flangeado para lavar o tubo com ar.
    2. Lave os tubos de entrada e saída do inserto de amostragem cOFM com 50 μL de aCSF estéril ou soro fisiológico usando uma seringa de vidro estanque equipada com um conector de tubo flangeado. Em seguida, adicione 50 μL de 70% de etanol. Desconecte o inserto de amostragem de cOFM do conector do tubo e armazene-o em um frasco cheio de etanol a 70% até estar pronto para reutilização.

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Resultados

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Diversas medidas avaliativas para determinar o sucesso experimental podem ocorrer em estágios experimentais intermediários ou de ponto, dependendo da natureza específica da patologia subjacente e do modelo animal investigativo. Para exames na biologia do GBM, a imagem bioluminescente (BLI) pode ser usada como medida avaliativa intermediária para a eficácia do enxerramento celular tumoral mediado por guia de cOFM (Figura 4A). No entanto, isso é usado para ava...

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Discussão

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Os procedimentos de cOFM descritos neste protocolo têm potencial para revolucionar o estudo das doenças do SNC por sua capacidade de amostrar longitudinalmente componentes endógenos do ISF do tecido patológico. No entanto, o sucesso investigativo do emprego dessa metodologia depende do desempenho adequado de várias etapas críticas. Dessas, a colocação correta e segura da cânula guia cOFM é uma das mais importantes. Procedimentos cirúrgicos inadequados ou estratégias de fixação podem resu...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado pela bolsa 1R01NS096376 do National Institute of Neurological Disorders and Stroke 1R01NS096376, 1R01NS112856 e P50CA221747 SPORE for Translational Approaches to Brain Cancer (A.U.A.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Broca de 0,7 mmFerramentas Científicas Finas19008-07Perfuração de furos de rebarba
Seringa de 1 a 5 mLBD#309646Retreival de amostra de perfusado recirculado
Agulha de 18 gBD#305195Retreival de amostra de perfusado recirculado
Agulha 30GBD Ultra-Fine328438Dura-máter perfurante
Suturas vicryl 4-0Dynarex9130Fechamento cirúrgico seria
Lenços alcoólicosFisherBrand22-363-750Desinfecção cutânea no local cirúrgico
Parafusos de ancoragemBASiMD-1310Posicionamento da cabeça do cOFM
Líquido cefalorraquidiano artificial (LCR)BASi (Joanneum)MD-2400ISF de amostragem
inserção fictícia cOFMBASi (Joanneum)cOFM-D- #Posicionamento da cabeça do cOFM
Guia cOFMBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #Posicionamento da cabeça do cOFM
Suporte de guia cOFMBASi (Joanneum)OFM-STM-1Posicionamento da cabeça do cOFM
Inserto de infusão cOFMBASi (Joanneum)cOFM-I- #Injeção celular
Cunha de travamento cOFMBASi (Joanneum)cOFM-LOCKPosicionamento da cabeça do cOFM
Inserto de amostragem cOFMBASi (Joanneum)cOFM-S-XISF de amostragem
Aplicadores com ponta de algodãoFisherBrane22363160Absorção de fluido, aplicação de peróxido de hidrogênio
Linha celular de glioma de camundongos CT2ASeyfried Lab - Universidade de BostonNACélulas tumorais enxertadas
Agente cimentante dentalIvoClar595953USPosicionamento da cabeça do cOFM
Luz de cura dentalHenry Schein5700253Posicionamento da cabeça do cOFM
Creme depilatórioVeet3116875Depilação do local cirúrgico
Máquina de barbear elétricaWahl Clipper Corp. 8841Depilação do local cirúrgico
Pinça de ponta finaFerramentas Científicas Finas5SFIncisão, posicionamento do parafuso de ancoragem
Conectores de tubos flangeadosBASi (Joanneum)MD-1510Injeção celular
Frascos de coleta de fraçõesBASi (Joanneum)MF-5281Armazenamento fracionado de amostras
Seringa de vidro hermética (25 & mu; L)Hamilton80465Injeção celular
Peróxido de hidrogênio (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32Limpeza da superfície do crânio
Seringas de insulina (0,3 a 1,0 mL) com agulhas de 31GBD Ultra-Fine328438Administração de anestésicos e analgésicos
Tubos microcentrífugasBasix02-682-002Retreival de amostra de perfusado recirculado
Microdrill e suporte estereotáxicoAparato de Harvard75-1874Perfuração de furos de rebarba
Jaqueta de ratoLomirMJ 02Conexão animal com o sistema de gaiolas rotativas
Tubo de baixa ligação OFMBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBISF de amostragem
OFM-Bomba - Bomba de microperfusãoBASi (Joanneum)MPP102-PCISF de amostragem
Pomada OftálmicaDechra211-38Lubrificação ocular perissugrícola
Agulha de amostragem de metal passivadaBASi (Joanneum)MW-2310Armazenamento fracionado de amostras
Bolsa de perfusadoBASi (Joanneum)OFM-BAGISF de amostragem
Solução fisiológica salinaMedicina de UTI & nbsp;0990-7983-03Limpeza da superfície do crânio, auxílio na perfuração de furos de rebarba
Swabs de povidona-iodoPDI HealthcareSKU B40600Desinfecção cutânea no local cirúrgico
Suporte para sondaStoelting51633
Coletor de frações refrigeradoBASi (Joanneum)MD-1201Armazenamento fracionado de amostras
Sistema de gaiola rotativaBASi (Joanneum)AMD-R RaturnAlojamento automatizado para amostragem cOFM acordada
Lâminas e cabos de bisturiFisher Scientific & nbsp;22079693Incisão
Chave de fendaPosicionamento da cabeça do cOFM
Adesivo dental auto-gravante TokuyamaPriming da superfície do crânio para agente cimentante
Tampa de silicone para frascos de coletaBASi (Joanneum)MF-5283Armazenamento fracionado de amostras
Quadro estereotácticoStoelting51725

Referências

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