Um modelo murino padronizado com um fluxo de trabalho de três pessoas para estudar rejeição celular aguda e mediada por anticorpos em xenotransplante

Resumo

Este estudo estabelece dois modelos padronizados de xenotransplante murino para replicar especificamente a rejeição celular aguda e a rejeição aguda mediada por anticorpos. Esses modelos servem como uma plataforma confiável para investigar mecanismos de rejeição imune de xenoenxertos, avaliar estratégias imunossupressoras e avançar na pesquisa pré-clínica em xenotransplante.

Resumo

Apesar dos avanços recentes na xenotransplantação, a rejeição aguda continua sendo uma grande barreira para sua aplicação clínica. A rejeição celular aguda (ACR) e a rejeição aguda mediada por anticorpos (RAM) são as principais respostas imunes que levam à falha precoce do enxerto em receptores de xenoenxertos. Embora grandes modelos animais, como primatas não humanos e porcos geneticamente modificados, tenham fornecido insights valiosos, seu uso é limitado por altos custos, restrições éticas e significativa variabilidade experimental. Modelos de pequenos animais oferecem uma alternativa prática e reprodutível para estudos mecanicistas de rejeição imunológica. Neste estudo, dois modelos padronizados de xenotransplante murino foram desenvolvidos para imitar especificamente a ACR e a AMR. Para garantir a reprodutibilidade e minimizar a variabilidade relacionada ao operador, foi implementado um protocolo cirúrgico estruturado para três pessoas com fluxo de trabalho em linha de montagem, permitindo a geração consistente de modelos com alta eficiência e qualidade. Os modelos resultantes não apenas replicam as principais características imunopatologicas da rejeição clínica de xenoenxertos, mas também oferecem uma plataforma robusta para investigar mecanismos imunológicos e avaliar estratégias imunossupressoras direcionadas. Esses modelos ajudarão a acelerar o desenvolvimento pré-clínico das terapias de xenotransplante.

Introdução

A xenotransplantação emergiu como uma das estratégias mais promissoras para enfrentar a escassez de órgãos doadores para transplante. Nos últimos anos, avanços rápidos em tecnologias de edição genética, estratégias de regulação imune e engenharia biomédica levaram a avanços significativos nesse^{campo 1}. Nos últimos três anos, várias equipes de pesquisa ao redor do mundo realizaram ensaios clínicos envolvendo xenotransplante em humanos, incluindo dois casos de transplante de coração de porco geneticamente modificado na Universidade de Maryland, um ensaio de transplante de rim de porco no Massachusetts General Hospital e um ensaio de transplante de timorinho na Universidade^{de Nova York} 2,3,4,5 . Apesar desses avanços sem precedentes, a rejeição imune continua sendo o principal desafio que limita a aplicação clínica da xenotransplantação. Mesmo com órgãos doadores geneticamente modificados altamente otimizados e regimes imunossupressores combinados, a rejeição continua sendo um grande obstáculo. Estudos atuais indicam que a rejeição aguda é um obstáculo crítico na xenotransplante, classificada principalmente em rejeição celular aguda (ACR) e rejeição aguda mediada por anticorpos (RAM). A ACR é mediada principalmente por células T, caracterizadas por uma infiltração extensa de células T no enxerto, levando a danos teciduais e comprometimento funcional. Seus mecanismos subjacentes envolvem apresentação de antígeno xenogênico, ativação de células T e liberação de citocinas^{inflamatórias 6,7}. Em contraste, a RAM é impulsionada por anticorpos específicos do doador já formados ou recém-gerados. Esses anticorpos se ligam às células endoteliais dentro do enxerto, desencadeando ativação do complemento e uma resposta imune robusta, resultando, em última análise, em lesão microvascular, trombose e falência^{do enxerto 8,9,10}. Portanto, uma compreensão mais profunda desses mecanismos de rejeição e o desenvolvimento de estratégias imunorreguladoras mais precisas são essenciais para avançar a xenotransplantação da pesquisa pré-clínica para a aplicação clínica de longo prazo.

Para enfrentar o desafio da rejeição aguda na xenotransplante, é essencial retornar à pesquisa fundamental e aos estudos pré-clínicos para elucidar os mecanismos imunológicos subjacentes. Modelos animais grandes, particularmente primatas não humanos (NHPs) e porcos geneticamente modificados, têm sido amplamente utilizados em pesquisas de xenotransplante devido às suas proximas semelhanças anatômicas e fisiológicas com os humanos. Esses modelos fornecem insights essenciais sobre mecanismos de rejeição imunológica e estratégias imunomoduladoras. No entanto, sua aplicação é significativamente limitada por altos custos, considerações éticas e complexidade do cuidado pós-operatório de longo prazo. Além disso, a variabilidade substancial nas respostas imunes entre os NHPs individuais afeta a reprodutibilidade dos resultados^{experimentais} 11,12,13. Embora modelos animais grandes continuem sendo indispensáveis para a tradução clínica, suas limitações em viabilidade experimental e consistência ressaltam a necessidade urgente de modelos pequenos animais mais custo-efetivos, escaláveis e mecanicamente relevantes.

Diante desses desafios, modelos animais pequenos ganharam importância crescente na pesquisa em xenotransplantes devido ao baixo custo, ciclos experimentais curtos e facilidade de aplicação em larga escala. Esses modelos não apenas fornecem uma plataforma essencial para investigar mecanismos de rejeição imunológica, mas também servem como uma ponte crítica entre estudos in vitro e experimentos com grandes animais, facilitando uma exploração mais precisa das estratégias imunorreguladoras. Neste estudo, foram estabelecidos dois modelos padronizados de xenotransplante murino que imitam especificamente ACR e AMR. Para garantir reprodutibilidade e consistência, foram implementados um protocolo cirúrgico padronizado para três pessoas e uma abordagem simplificada em linha de montagem para geração de modelos. Esse fluxo de trabalho padronizado minimiza a variabilidade dependente do operador, resultando em modelos de transplante cardíaco altamente uniformes. Esses aprimoramentos fornecem uma plataforma confiável para investigações mecanicistas e avaliação de novas estratégias imunossupressoras. Esse protocolo é particularmente adequado para pesquisadores que conduzem estudos com pequenos animais sobre mecanismos imunes de xenotransplante e para a avaliação de estratégias imunossupressoras. Oferece vantagens como baixo custo, alta reprodutibilidade e um fluxo de trabalho padronizado, fornecendo uma base experimental confiável para estudos futuros com grandes animais e pré-clínicos.

Protocolo

Esse protocolo pode ser realizado por um único operador ou por uma equipe de três pessoas, com cada membro responsável pela colheita do coração doador, preparação do receptor e anastomose cardíaca pelo doador, respectivamente. Todo o procedimento é concluído em 10 minutos, permitindo uma geração rápida, de alta produtividade e padronizada do modelo.

Os experimentos com animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Hospital Fuwai, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Aprovação nº 0108-1-70-ZX(X)-41). Todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com as regulamentações e diretrizes éticas de bem-estar animal para garantir a conformidade com os padrões relevantes. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação pré-operatória

1. Preparação do punho
   1. Use tubos de poliimida para fabricar as algemas para cirurgia de transplante. Para o braço arterial, selecione tubos de poliimida com diâmetro interno de 0,3–0,5 mm e corte-os em segmentos de 2 mm sob um estereoscópio (ampliação de 10× a 20×).
   2. Corte parcialmente a seção de grampo de cada segmento ao meio circunferencialmente para formar uma extensão semelhante a um cabo. Para o manguito venoso, selecione tubos de poliimida com diâmetro interno de 0,4–0,7 mm e corte-os em segmentos de 3 mm. Da mesma forma, corte parcialmente a seção da garra ao meio na circunferência para criar uma extensão semelhante a um cabo.
      NOTA: Deixe as mangas de molho em etanol a 75% por 30 minutos, depois enxágue bem com soro fisiológico normal.
2. Preparação para camundongos: Use ratos neonatais Sprague-Dawley (SD) de 10 a 12 dias como doadores, e camundongos C57BL/6 ou Balb/c de 7 a 8 semanas como receptores. Para garantir o cuidado adequado e minimizar o estresse, transporte ratos doadores neonatais junto com a mãe rato. Abrigue todos os animais em um ambiente específico livre de patógenos (SPF).

2. Colheita de corações por doadores

1. Fixação e anestesia
   1. Anestesiar ratos neonatais por meio de injeção intraperitoneal de 30 μL/g de tribromoetanol (Jitianbio, JT0781) (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
   2. Uma vez totalmente anestesiado, coloque o rato em posição supina e prenda-o sob um estereoscópio. Desinfete a área toracoabdominal usando algodão embebidos em povidona e iodo.
      NOTA: Manusear o tribromoetanol com luvas e proteção ocular em uma área ventilada; Evite contato com a pele e inalação.
2. Heparinização
   1. Desinfete a área toracoabdominal usando algodão embebidos em povidona e iodo. Mova suavemente os intestinos para o lado usando um cotonete para expor a veia cava inferior.
   2. Injete soro fisiológico heparinizado (0,2–0,5 mL) na veia cava inferior usando uma seringa de insulina, seguida de uma compressão suave do local da injeção com um algodão para evitar sangramento.
      NOTA: Use luvas e proteção ocular ao preparar ou injetar soro fisiológico heparinizado; Descarte seringas como resíduos cortantes. Prepare soro fisiológico heparinizado dissolvendo um frasco de heparina de sódio medicinal (125 mg) em 100 mL de soro fisiológico normal.
3. Parada cardíaca
   1. Incenda o diafragma, corte a parede torácica bilateralmente e retraia-a para expor totalmente o coração. Remova o timo. Corte a veia cava superior para aliviar a pressão e perfunde 1 mL de solução da Universidade de Wisconsin (UW) na aorta para induzir uma parada cardíaca.
   2. Continue a perfusão até que o coração mude de vermelho para pálido. Simultaneamente, coloque uma gaze embebida em soro gelado sobre o coração para baixar sua temperatura e evitar a desidratação.
      NOTA: Corte gaze estéril em pedaços de 1 cm × 1 cm e pré-deixe-os de molho em soro gelado antes do uso.
4. Colheita do coração doador
   1. Liga a veia cava superior e inferior com uma sutura de seda 8–0, depois transecto-as. Corte a aorta no arco aórtico e corte a artéria pulmonar em sua bifurcação.
   2. Por fim, ligue todas as veias pulmonares com um 8-0 sutura de seda e excisa do coração doador. Armazene temporariamente o coração colhido em soro gelado para preservação.

3. Preparação para o destinatário

1. Anestesia
   1. Anestesie o camundongo receptor usando o mesmo método e coloque-o em posição supina para estabilização.
2. Desinfecção
   1. Remova os pelos da região do pescoço usando um creme depilatório, seguido de desinfecção da pele com povidona-iodo.
3. Incisão de pele
   1. Faça uma incisão longitudinal de 2 cm aproximadamente 1 cm à direita da linha média do pescoço usando tesoura oftálmica. Realize uma dissecação contundente para remover gradualmente a gordura subcutânea e as camadas musculares, e excise a glândula submandibular.
      NOTA: Ao excisar a glândula submandibular, os vasos sanguíneos basais devem ser ligados com um ponto de seda 8–0 ou cauterizados com uma caneta eletrocauterizada para evitar sangramento.
4. Preparação da veia jugular externa
   1. Após expor a veia jugular externa, cauterize individualmente os ramos usando uma caneta eletrocauterizada em modo de coagulação baixa (5–10 W). Segundo lugar 8-0 suturas de seda próximas à extremidade distal da veia para ligadura.
   2. Use tesouras microcirúrgicas para seccionar a veia jugular externa entre as duas ligaduras. Insira a veia jugular externa pelo manguito venoso, pressione o manguito até a base da veia e fixe-o com uma pinça vascular.
   3. Remova as ligaduras com tesouras microcirúrgicas e limpe o sangue residual dentro da veia usando soro fisiológico heparinizado. Everte a veia jugular externa sobre o braço com pinças microcirúrgicas e fixe com um 8-0 sutura de seda.
      NOTA: Opere a caneta eletrocauterizadora com cuidado e tome cuidado para evitar queimaduras. A veia jugular externa possui múltiplos afluentes que devem ser cuidadosamente isolados e selados para minimizar o sangramento.
5. Preparação da artéria carótida
   1. Realize dissecação obtusa posterior ao músculo esternocleidomastoide para localizar a bainha carotídea. Abra a bainha carotídea e separe cuidadosamente a artéria carótida comum da veia jugular interna e do nervo vago.
   2. Liga e transecto a artéria da mesma forma que a veia. Insira a extremidade inferior da artéria seccionada pelo manguito arterial, everte-a e prenda-a no lugar.
      NOTA: A artéria carótida, a veia jugular interna e o nervo vago estão encerrados dentro da bainha carótida. Ao abrir a bainha, deve-se tomar cuidado para evitar danificar o nervo vago. A artéria carótida tem um diâmetro menor que a veia jugular externa, mas é mais elástica, tornando a aversão mais desafiadora do que a da veia.

4. Anastomose cardíaca doadora

1. Anastomose da artéria aorta-carótida
   1. Após aparar o coração doador, coloque-o imediatamente no pescoço do camundongo receptor. Use um 8-0 Sutura de seda com um nó solto para criar um laço ao redor da aorta doadora.
   2. Coloque a aorta doadora sobre o manguito arterial na artéria carótida do receptor e a fixe com um 8-0 Ligadura de seda.
      NOTA: Ao fixar a aorta, o ponto deve ser amarrado acima da linha de ligadura da artéria carótida para evitar contato direto entre o local da ligadura e o sangue do receptor.
2. Anastomose da artéria pulmonar para a veia jugular externa
   1. Use um 8-0 Sutura de seda com nó solto para criar um laço ao redor da artéria pulmonar doadora. Coloque a artéria pulmonar sobre o manguito venoso na veia jugular externa do receptor e prenda-a com um 8-0 Ligadura de seda.
3. Retomada cardíaca
   1. Libere as pinças vasculares da artéria carótida e da veia jugular externa do receptor para restaurar o fluxo sanguíneo. Observe que o coração doador retoma contrações fortes e rapidamente fica vermelho em 10 segundos.
4. Fechamento da incisão
   1. Quando o coração doador recuperar um ritmo estável, ajuste sua posição e feche a incisão cutânea no pescoço do receptor com suturas 4-0. Desinfete o local cirúrgico com povidona-iodo.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Analgesia pós-operatória
   1. Aplique gel de lidocaína topicamente para alívio da dor após o fechamento da pele. Se o camundongo apresentar sinais significativos de dor, administre meloxicam (2 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
      NOTA: O meloxicam é dissolvido em 10% de DMSO e 90% de óleo de milho, e o volume de injeção é calculado com base na dose necessária.
2. Recuperação
   1. Coloque o rato em um tapete quente e macio, mantido entre 37–38 °C para preservar a temperatura corporal e monitore-o até que ele recupere a consciência. Quando estiver totalmente acordado, coloque o rato individualmente em uma gaiola com acesso adequado a comida e água.
3. Monitoramento
   1. Monitore o coração transplantado diariamente por meio de inspeção visual e palpação para avaliar seu batimento e a viabilidade geral do enxerto.
      NOTA: Realize todos os procedimentos utilizando EPI apropriados e siga as regulamentações institucionais de biossegurança e cuidado animal. Todos os resíduos químicos, perfusados e tecidos animais gerados durante o experimento devem ser coletados e descartados de acordo com as normas institucionais. Soluções contendo tribromoetanol ou heparina devem ser tratadas como resíduos químicos perigosos, enquanto tecidos animais e materiais derivados do sangue devem ser manuseados como resíduos biológicos e esterilizados por autoclave ou descartados por meio de instalações certificadas.

Resultados

A Figura 1 demonstra o fluxo de trabalho colaborativo padronizado de três pessoas para gerar um modelo de xenotransplante murino. Neste sistema, três operadores trabalham em paralelo, cada um realizando uma tarefa designada repetidamente: preparação do receptor, obtenção de coração por doador ou anastomose cardíaca por doador. Essa divisão do trabalho permite que um modelo completo de transplante seja finalizado a cada 10 minutos. Enquanto um único operador ...

Discussão

O xenotransplante murino é um procedimento altamente invasivo que exige alto nível de proficiência técnica e consistência por parte do operador. Durante a instalação do modelo, o operador tem impacto significativo nos resultados^{experimentais 14,15}. Em um fluxo de trabalho de uma única pessoa, a complexidade e o tempo de duração do procedimento resultam em um tempo aproximado de operação de 30 minutos por modelo, levando a baixa e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-CD3 antibody	Abcam	ab16669
Anti-CD68 antibody	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Depilatory cream	Veet	-
Electrocautery pen	Yuyan Instrument	-
Fluorescent secondary antibodies	Thermofisher	A-11008
HE staining kit	Beyotime	C0105S
Ice maker	Shjingmi	IMS-20
Insulin syringes	KDL	U-40
Lidocaine gel	Tide Pharm
Meloxicam	Sigma-Aldrich	444800
Microsurgical forceps	ZHENHAO	FS217
Microsurgical needle holders	BIOFIVEN	HH01231
Microsurgical scissors	ZHENHAO	FS237
Normal saline	Kelun Pharmaceutical	-
Polyimide tubing	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Diâmetro interno: 0,3-0,5 mm
Polyimide tubing	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Diâmetro interno: 0,4-0,7 mm
Povidone-iodine solution	INOHV	-
Sodium heparin	Qianhong bio-pharma	-
Stereomicroscope	Murzider	MSD204
Surgical sutures	Jinhuan Medical	8-0 and 4-0 silk sutures
Surgical warming pad	Hani Pet	-
Tribromoethanol	Jitianbio	JT0781
University of Wisconsin solution	Belzer	-
Vascular clamps	RWD Life	R31005-10