Reação em cadeia da polimerase digital de microgotículas para detecção precisa de mutações de câncer de pulmão de células não pequenas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar de forma sensível e específica mutações EGFR T790M usando reação em cadeia da polimerase digital de gotículas (ddPCR), que também pode ser estendida para identificar rapidamente outras mutações tumorais, como G719S, L858R, L861Q e S768I.

Resumo

Em escala global, o câncer de pulmão continua a ser o principal contribuinte para as mortes relacionadas ao câncer, com sua prevalência perdendo apenas para a do câncer renal. O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) constitui aproximadamente 80-85% de todos os casos de câncer de pulmão relatados. A mutação T790M no gene EGFR é um determinante primário amplamente reconhecido da resistência adquirida aos inibidores da tirosina quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR-TKIs). A presença dessa condição foi observada em aproximadamente 50-60% das pessoas com doença progressiva. Portanto, a implementação de uma abordagem rápida e altamente responsiva para detectar mutações T790M no gene EGFR é essencial para a identificação rápida do câncer de pulmão de células não pequenas. No presente estudo, a ddPCR foi usada para detectar a mutação T790M com um limite de detecção de 10 cópias/μL, que é 10 vezes maior que a sensibilidade da qPCR (1 × 10² cópias/μL). Para as 15 amostras simuladas, a ddPCR foi capaz de detectar a presença de mutações T790M no gene EGFR, que foram observadas em níveis reduzidos quando analisadas por qPCR. A detecção de mutações T790M dentro do gene EGFR por um método de detecção rápida está sendo investigada para determinar sua adequação.

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo e é a segunda malignidade mais prevalente em geral. O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) representa uma maioria significativa, aproximadamente 80% a 85%, de todos os casos de câncer de pulmão relatados 1,2,3,4. Para pacientes diagnosticados com NSCLC avançado com mutações no EGFR, a abordagem terapêutica estabelecida envolve a aplicação de inibidores da tirosina quinase (TKIs) do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) de primeira, segunda ou terceira ^{geração5,6,7}. No entanto, a maioria dos pacientes tratados com EGFR-TKIs de primeira ou segunda geração acaba desenvolvendo resistência adquirida à medicação. Essa resistência é frequentemente atribuída à presença da mutação T790M no gene EGFR, que é encontrada em cerca de 50-60% dos pacientes com progressão da doença 8,9,10,11,12.

Tradicionalmente, anormalidades genéticas no DNA tumoral de amostras de tecido são identificadas usando técnicas como hibridização in situ fluorescente (FISH) ou sequenciamento de próxima geração (NGS) ^{13 , 14} . No entanto, as biópsias de tecido podem ser desafiadoras devido à inacessibilidade do tumor, má saúde do paciente ou conteúdo insuficiente de células tumorais 15,16,17. Como alternativa, as biópsias líquidas, particularmente de plasma, oferecem uma maneira menos invasiva de identificar mutações condutoras, detectando DNA tumoral circulante (ctDNA). As células tumorais liberam DNA na corrente sanguínea, líquido pleural, saliva ou fezes, fornecendo uma fonte valiosa para análise genética ^18,19. O perfil genético do ctDNA geralmente reflete a composição genética do tumor, oferecendo uma visão abrangente da heterogeneidade do tumor - um fator crucial para o diagnóstico preciso e o tratamento personalizado do câncer^20,21.

Entre as várias técnicas para identificar mutações EGFR no sangue periférico, incluindo sequenciamento, reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), PCR digital, cromatografia líquida de alta eficiência desnaturante (DHPLC), sistema de mutação refratária de amplificação (ARMS) e PCR enriquecido com mutante (ME-PCR), a PCR digital de microgotículas (ddPCR) surgiu como uma ferramenta altamente eficaz para a detecção de mutações no ctDNA^22,23. Sua sensibilidade superior, precisão e capacidade de detectar mutações de baixa abundância com alta precisão o diferenciam. Ao contrário da PCR tradicional, a ddPCR divide as amostras em milhares de gotículas, permitindo a quantificação absoluta das sequências de DNA alvo sem curvas padrão. Isso o torna excepcionalmente adequado para detectar mutações raras como a mutação T790M no EGFR. Apesar das vantagens do ddPCR, sua ampla aplicação clínica tem sido limitada por desafios na preparação de amostras, otimização do sistema e análise comparativa de desempenho com técnicas estabelecidas como qPCR. Existe uma lacuna crítica na otimização dos protocolos de ddPCR para detecção de mutação do ctDNA, particularmente em relação à sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade essenciais para a adoção clínica.

Neste estudo, levantamos a hipótese de que o ddPCR oferece sensibilidade e confiabilidade superiores para detectar a mutação EGFR T790M no ctDNA em comparação com os métodos tradicionais de qPCR. Nós nos concentramos em otimizar o processo de extração de ácido nucleico para aumentar a eficiência, seguido pela otimização de ddPCR para detecção de mutação. Além disso, comparamos o desempenho de ddPCR e qPCR em termos de sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade usando amostras simuladas. Ao avaliar sistematicamente o potencial do ddPCR, pretendemos estabelecê-lo como uma alternativa viável e superior ao qPCR para detecção de mutação EGFR em biópsias líquidas.

Protocolo

Este estudo não envolveu participantes humanos, tecidos humanos ou experimentos com animais vivos; portanto, nenhuma aprovação ética formal foi necessária. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais. O plasmídeo mutante T790M foi sintetizado comercialmente. O sangue de porco usado para simular amostras clínicas foi obtido de um fornecedor certificado de acordo com os regulamentos de bem-estar animal, sem envolvimento de animais vivos. Todos os outros reagentes, incluindo esferas magnéticas, primers, sondas e enzimas de PCR, foram adquiridos comercialmente e usados conforme as instruções dos fabricantes.

Extração de ácido nucleico
A extração de ácido nucleico foi realizada usando um kit de extração de esferas magnéticas e um instrumento extrator de ácido nucleico totalmente automático. O procedimento padrão envolveu a adição de 200 μL de amostra e 20 μL de proteinase K à coluna 1 ou 7 da placa de poço profundo pré-embalada. Em seguida, 15 μL de esferas magnéticas fornecidas com o kit foram adicionadas à coluna 2 ou 8. O programa de extração foi iniciado no instrumento, com a luva magnética colocada em seu local designado. Após a extração, o líquido da coluna 6 ou 12 foi transferido para um novo tubo livre de nuclease de 1,5 mL e armazenado a -20 °C.

Para otimizar a extração de ácidos nucléicos alvo de baixa concentração, foram realizados experimentos de otimização. Os parâmetros de extração recomendados foram: temperatura de lise 70 °C, tempo de lise 10 min, 1 min para cada uma das três soluções de lavagem, 2 min de secagem e 3 min de eluição a 56 °C. Os parâmetros mais influentes foram sistematicamente otimizados: temperatura de lise (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C e 78 °C), tempo de lise (1, 3, 5, 7 e 9 min) e tamanho do cordão magnético (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm e 1000 nm). Essas otimizações foram realizadas usando o plasmídeo mutante T790M a 1 ×^{10 5} cópias/μL. Os grânulos magnéticos de 100 nm foram fornecidos com o kit de extração, enquanto outros tamanhos de partículas foram obtidos de uma empresa de biotecnologia. A eficiência de cada condição de extração foi avaliada por meio da análise das curvas de amplificação de qPCR e dos valores de Ct das amostras extraídas. A análise estatística desses resultados foi realizada por meio de software estatístico.

DNA de plasmídeo padrão
O plasmídeo mutante T790M do gene EGFR foi sintetizado de forma personalizada por uma empresa de biotecnologia. Quatro microgramas do pó de plasmídeo seco foram ressuspensos em 100 μL de 1x TE Buffer. A concentração plasmidial foi determinada usando um espectrofotômetro. O número de cópias por microlitro foi calculado usando a fórmula: Número de cópias/μL = [(6,02 × 10²³) × (concentração de DNA (ng/μL) × ^10-9)] / (comprimento do DNA em pares de bases × 660). A concentração do fragmento sintetizado foi de 1,26 ×^10,9 cópias/μL. Este plasmídeo estoque foi então diluído 126 vezes para obter uma concentração de trabalho de 1 × 10⁸ cópias/μL.

Projeto e síntese de primers
Os primers e uma sonda TaqMan para a mutação EGFR T790M foram projetados usando o Primer 6 com base nos princípios de design de primer padrão. Primer a montante: 5 ′ -CCTCACCTCCACCGTGC-3 ′; Primer a jusante²⁴: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Sonda: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Todos os primers e sondas foram sintetizados por um serviço comercial de síntese de oligonucleotídeos.

Estabelecimento e otimização do sistema de detecção quantitativa de fluorescência ddPCR e TaqMan
Um estoque de plasmídeo T790M de 1 × 10⁸ cópias/μL foi diluído para 1 × 10⁶ cópias/μL usando 1× TE Buffer para uso em experimentos de otimização do sistema ddPCR e qPCR.

Otimização do sistema ddPCR: O sistema ddPCR foi otimizado com base nas recomendações do fabricante da enzima. O sistema inicial recomendado incluía: 7,5 μL de mistura de PCR 4x, 1,2-3 μL de primer a montante (10 μM), 1,2-3 μL de primer a jusante (10 μM), 0,3-1,8 μL de sonda (10 μM), 1-15 μL de molde de DNA e água livre de nuclease até um volume final de 30 μL. O ciclo de amplificação recomendado envolveu 10 minutos iniciais a 95 °C, seguidos por 40 ciclos de 30 s a 94 °C e 60 s a 55-65 °C. A temperatura de recozimento (55-61,8 °C), a concentração do primer (1-3 μL), a concentração da sonda (0,75-1,75 μL) e a concentração do molde (3-15 μL) foram sistematicamente otimizadas. Os resultados da otimização foram analisados estatisticamente usando software estatístico.

Otimização do sistema qPCR: O sistema qPCR foi otimizado de acordo com as recomendações do fabricante da enzima. O sistema inicial sugerido incluía: 5 μL de Taq polimerase, 0,45 μL de 250 mM de MgCl2, 0,5-2,5 μL de primer direto (10 μM), 0,5-2,5 μL de primer reverso (10 μM), 0,5-2,5 μL de sonda (10 μM), 5 μL de amostra de DNA e água livre de nuclease até um volume final de 25 μL. O programa de amplificação recomendado foi de 5 min a 95°C; seguido por 45 ciclos de 15 s a 95 °C e 30 s a 56-64 °C, com coleta de fluorescência a 56-64 °C. A temperatura de recozimento (56-64 °C), a concentração do primer (1-3 μL), a concentração da sonda (0,5-2,5 μL) e a concentração do molde (1-5 μL) foram otimizadas. A análise estatística desses resultados foi realizada por meio de software estatístico.

Teste de sensibilidade de PCR quantitativo de fluorescência ddPCR e Taqman
Para avaliar a sensibilidade de ddPCR versus qPCR, o plasmídeo 1 ×^{10 8} cópias/μL T790M foi diluído em série 10 vezes usando 1x TE Buffer para criar um gradiente de concentração variando de 10⁶ a 10¹ cópias/μL. Para a ddPCR, sete soluções de reação foram preparadas de acordo com o sistema otimizado de ddPCR, uma para cada concentração, incluindo um controle negativo. As amostras foram carregadas em um chip gerador de microgotículas e processadas com um instrumento de geração de gotículas para gerar microgotículas. Essas gotículas foram então amplificadas usando um termociclador de PCR e posteriormente analisadas por um instrumento digital de detecção de PCR. Concomitantemente, sete soluções de reação foram preparadas com base no sistema otimizado de qPCR, com modelos idênticos. Estes foram executados em um instrumento de PCR em tempo real para avaliar as respectivas sensibilidades das duas abordagens (n = 3).

Testes de repetibilidade ddPCR
Para avaliar a repetibilidade, o DNA do plasmídeo T790M padrão a 1 × 10⁸ cópias/μL foi diluído para gerar padrões de concentração alta (1 × 10⁶ cópias/μL), média (1 × 10⁴ cópias/μL) e baixa (1 × 10² cópias/μL). Seis soluções de reação foram preparadas de acordo com o sistema otimizado de ddPCR. As amostras foram carregadas em um chip gerador de microgotículas e processadas com um instrumento de geração de gotículas para formar microgotículas. As microgotículas foram então amplificadas usando um termociclador e analisadas por um instrumento digital de detecção de PCR. Um controle negativo foi incluído. O experimento foi realizado em triplicata. A reprodutibilidade foi avaliada comparando os perfis de amplificação e calculando os valores do coeficiente de variação (CV) das três repetições experimentais.

Teste de amostra analógica
A fim de testar a confiabilidade dos sistemas ddPCR e qPCR da mutação T790M, usamos sangue de porco misturado aleatoriamente com altas e baixas concentrações de plasmídeos padrão de mutação T790M, respectivamente, e sangue de porco sem plasmídeos padrão mistos foi usado como amostras negativas, e 15 amostras simuladas foram preparadas aleatoriamente e ácido nucléico foi extraído das amostras simuladas, e detectado pelos métodos ddPCR e qPCR, respectivamente.

Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em pelo menos três repetições técnicas. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). As análises estatísticas foram realizadas por meio do software GraphPad Prism 10. As diferenças entre os grupos foram analisadas usando o teste t de Student ou análise de variância (ANOVA) de uma via, conforme apropriado. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Otimização da extração de ácidos nucleicos
O fluxo de trabalho baseado em ddPCR para detectar a mutação EGFR T790M está resumido esquematicamente na Figura 1. Primeiro, determinamos a temperatura ideal de lise. Conforme mostrado na Figura 2A, uma temperatura de clivagem de 66 ° C produziu o menor valor médio de Ct, indicando a clivagem mais eficiente. Portanto, 66 ° C foi selecionado para experimentos subsequentes. Em seguida, otimizamos o te...

Discussão

O câncer de pulmão, como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, sempre foi um ponto focal na pesquisa médica. Neste estudo, exploramos vários aspectos críticos do câncer de pulmão, com o objetivo de fornecer informações mais profundas sobre seu diagnóstico, tratamento e prognóstico. A pedra angular do diagnóstico e tratamento precisos do câncer de pulmão é o teste genético preciso. Conforme demonstrado por Zhao et ^al.25, o teste genéti...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 e vezes; Buffer TE	Sangon Biotech	B548144	Tampão Tris-EDTA usado para diluição de DNA
4&vezes; Mistura enzimática Unimix-U	TargetingOne Bio	UNIMIXU-4X	ddPCR mistura enzimática
A300 Fast Thermal Cycler	LongGene	A300	PCR amplificação
Analisador de biochip	SEED Bio	DigitalPCR-Biochip	Sistema de detecção para PCR digital
Instrumento de preparação de amostras de marcador de gota	Xinyi Biotechnology	PCR Platform TD-2	Preparação de microgotículas
Kit de extração de ácido nucleico de esferas magnéticas	Tecnologia LemnisCare MXP-1005		Extração de ácido nucleico
Microgotlet gerador de chip	TargetingOne Biotech	MG-Chip-01	Usado para gerar microgotículas para ddPCR
NanoDrop	Allsheng	NC-500	Medição da concentração de ácido nucleico após extração de amostra
NanoDrop ND-500 espectrofotômetro	Allsheng Instrumentos	ND-500	Espectrofotômetro para quantificação de DNA
Instrumento de PCR A300 Termociclador rápido	LongGene	A300	Termociclador para amplificação de PCR
Primers e sonda TaqMan	Sangon Biotech	Primers sintetizados sob medida	e sonda TaqMan para detecção T790M
qPCR instrumento Gentier mini	Tecnologia	Tianlong Gentier mini	PCR em tempo real
plasmídeo de mutação do instrumento T790M	Biologia Tsingke	T790M	e teste de limite de detecção