Artigo de método

Um protocolo simples para o isolamento e cultura de hepatócitos de camundongos MASLD

DOI:

10.3791/68782

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18 de julho de 2025

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1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

Neste artigo

Resumo

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Este estudo estabelece um protocolo padronizado para isolar hepatócitos primários de camundongos com doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD), permitindo investigações relevantes da doença de esteatose e disfunção metabólica sem carga lipídica artificial. O método produz hepatócitos de alto rendimento e alta viabilidade, adequados para estudos mecanísticos e terapêuticos.

Resumo

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A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD), caracterizada pelo acúmulo patológico de lipídios (esteatose) nos hepatócitos, representa uma carga significativa e crescente para a saúde global. As culturas primárias de hepatócitos de camundongos servem como modelos ex vivo indispensáveis para elucidar a patogênese da MASLD e as intervenções terapêuticas. No entanto, o isolamento confiável de hepatócitos de alta qualidade de fígados esteatóticos permanece tecnicamente desafiador. Aqui, apresentamos um protocolo simples para o isolamento eficiente de hepatócitos primários de camundongos MASLD usando a técnica de perfusão de colagenase. Este protocolo gera hepatócitos exibindo esteatose inerente sem a necessidade de indução artificial via suplementação de palmitato e ácido oleico, preservando assim um fenótipo fisiologicamente mais relevante. O protocolo produz hepatócitos altamente viáveis e de alta pureza e é universalmente aplicável para isolar grandes quantidades de hepatócitos de camundongos MASLD. Além disso, é adequado para avaliação farmacológica ou estudos de intervenção genética. Em resumo, fornecemos um protocolo reprodutível para isolar hepatócitos de alto rendimento, alta pureza e altamente viáveis para estudos biológicos celulares a jusante para facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos e medicamentos para MASLD.

Introdução

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A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) é caracterizada pelo acúmulo patológico de lipídios nos hepatócitos e representa o distúrbio hepático crônico mais prevalente globalmente1. Estima-se que o MASLD afete 38% da população adulta mundial e se tornou uma ameaça significativa à saúde humana2. Os mecanismos da MASLD não foram totalmente elucidados e as opções de tratamento são muito limitadas. A descoberta de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de agentes direcionados para MASLD tornaram-se uma necessidade clínica crítica. Os hepatócitos, como o tipo de célula predominante que compõe o fígado, são o principal local do metabolismo hepático da glicose-lipídios-drogas. Os hepatócitos primários retêm uma função mais completa dos hepatócitos do que as linhagens celulares de hepatócitos e são uma ferramenta útil para estudar os mecanismos das doenças hepáticas e o desenvolvimento de medicamentos3. O isolamento e a cultura de hepatócitos primários de camundongos com fígado gorduroso é uma técnica fundamental para o estudo da fisiopatologia hepática, incluindo metabolismo lipídico, resistência à insulina e respostas inflamatórias. Um protocolo prévio estabelecido para o isolamento de hepatócitos de modelos murinos de doença hepática gordurosa empregou centrifugação gradiente para permitir especificamente a separação de populações de hepatócitos normais e acumuladores de lipídios. Esses hepatócitos isolados carregados de lipídios constituem, portanto, um sistema modelo in vitro crítico para investigar a patobiologia da doença hepática gordurosa3. O objetivo principal dessa abordagem é obter de forma fácil e econômica hepatócitos altamente viáveis e de alto rendimento que retenham características fenotípicas específicas da doença e, portanto, sejam capazes de mimetizar MASLD in vitro.

O procedimento geral para isolamento de hepatócitos em camundongos consiste em um processo de duas etapas que começa com a lavagem do sangue do fígado com uma solução de perfusão isotônica, como a solução salina balanceada de Hank (HBSS) e, em seguida, digerindo o fígado usando uma solução de digestão contendo colagenase. Avanços recentes na perfusão hepática e nas técnicas de digestão enzimática melhoraram o rendimento e a viabilidade dos hepatócitos primários em camundongos fêmeas4. Melhorias nos métodos tradicionais de perfusão de colagenase em duas etapas, como otimizar a composição do tampão e reduzir os tempos de digestão, têm sido críticas na adaptação de protocolos experimentais a amostras de fígado gorduroso. Os hepatócitos primários servem como modelos indispensáveis para elucidar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes ao MASLD e suas complicações cardiometabólicas, particularmente por meio de seu papel na mediação do crosstalk coração-fígado e das interações do eixo fígado-vascular por meio de mediadores endoteliais e fatores angiogênicos 5,6. Essas células fornecem informações críticas sobre as redes de comunicação de múltiplos órgãos que impulsionam a progressão da doença, conforme evidenciado por associações clínicas entre MASLD, doença renal crônica e doença cardíaca isquêmica7, ao mesmo tempo em que oferecem uma plataforma fisiologicamente relevante para o desenvolvimento de terapias direcionadas que abordam as manifestações hepáticas e cardiovasculares da síndrome metabólica. A pesquisa in vitro atual de MASLD depende predominantemente de hepatócitos normais estimulados por ácido palmítico / oleico (PA / OA) ou linhagens celulares de hepatócitos humanos (por exemplo, HepG2 e Huh7), que replicam inadequadamente as características fisiopatológicas dos hepatócitos esteatóticos em condições doentes, limitando sua relevância translacional para o estudo das interações coração-fígado-vascular. Essa abordagem não consegue capturar a disfunção metabólica crônica, o microambiente inflamatório e a interferência interorgânica específica da doença característica da progressão do MASLD.

Este protocolo pode ser usado para isolar hepatócitos de camundongos MASLD, sem a necessidade de adicionar artificialmente tratamentos com ácido palmítico e oleico. Em conclusão, apresentamos um método simples e reprodutível para a obtenção de hepatócitos de alto rendimento com excelente viabilidade, adequado para pesquisas em biologia celular a jusante para apoiar a descoberta de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de medicamentos para MASLD.

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Protocolo

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Todas as etapas experimentais foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Ciência e Tecnologia da China. Camundongos C57BL / 6J machos foram alimentados com uma dieta rica em gordura (HFD, # 12492, Research Diet) por mais de 12 semanas neste estudo.

1. Preparação de uma placa ou placa de cultura revestida de colagénio

  1. Adicionar 15 mL de EtOH a 100% de EtOH a 35 ml de H2O (ddH2O). Prepare uma solução de colágeno tipo I 50 μg / mL em EtOH a 30%. Filtro com uma ponta de filtro estéril de 0,22 μm.
  2. Cubra uma placa ou placa de cultura de células com 30 μL de solução de colágeno por cm2. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
  3. Remova o excesso de líquido com uma pipeta e seque a placa ou prato de cultura. Irradie os pratos revestidos com luz ultravioleta por 0,5 h para esterilização. Conservar a 4 °C durante menos de 1 mês.
    NOTA: O comprimento de onda da lâmpada UV é de 254 nm e a intensidade UV não é inferior a 400 mw/m2. A distância da fonte da lâmpada UV dos pratos revestidos de colágeno é de 1 m.

2. Preparação da solução de perfusão

  1. Poucos dias antes de isolar os hepatócitos, preparar os reagentes de isolamento de hepatócitos e os meios de cultura especificados no quadro 1. Filtrar as soluções de perfusão A e B com uma ponta de filtro estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C durante menos de 1 mês. Preparar um banho-maria e regular a temperatura para 37 °C.
  2. Pré-aqueça as soluções de perfusão A e B em banho-maria a 37 °C. Adicionar 40 mg de colagenase tipo IV a 80 mL de solução de perfusão B antes da cirurgia.
  3. Bombeie EtOH a 75% a uma taxa de 4 mL / min por 5 min usando uma bomba peristáltica em RT. Mude a tubulação da bomba de EtOH a 75% para solução de perfusão pré-aquecida A.
    NOTA: Monte a unidade de enchimento de circulação aquecida de acordo com a configuração ilustrada na Figura 1A.

3. Procedimento cirúrgico

  1. Anestesie o mouse usando um método aprovado. Injete pentobarbital sódico (50 mg / kg) por via intraperitoneal. Verifique a perda do reflexo de giro antes de prosseguir.
  2. Prenda os membros superiores e inferiores do mouse em uma placa de dissecação. Esterilize a área cirúrgica com álcool 75%.
  3. Corte as membranas abdominais interna e externa usando instrumentos de dissecação. Gire os órgãos viscerais para o lado esquerdo do camundongo com um cotonete para expor a veia cava inferior (VCI) e a veia porta hepática (PV).
  4. Pressione a veia cava inferior com um cotonete para protuberância. Insira uma agulha de demora de 22 G paralela à veia cava inferior.
  5. Retire a parte de ferro da agulha de demora. Deixe o cateter na veia cava inferior. Conecte a agulha a uma linha de perfusão com uma ponta de filtro de 0,22 μm.
    NOTA: Uma agulha de demora consiste em uma parte de agulha de ferro e uma parte de cateter de plástico. Garanta a inserção precisa na veia cava inferior e espere até que a agulha de demora se encha de sangue. Livre-se de todas as bolhas de ar da agulha interna. Conclua todo o procedimento rapidamente para evitar trombose.
  6. Defina a taxa de perfusão para 5 mL / min de fluido de perfusão A. Comece a perfusão e observe o fígado até que pareça inchado. Corte a veia porta imediatamente.
  7. Massageie suavemente o fígado usando um cotonete para garantir uma lavagem completa do sangue. Continue a perfusão até que o fígado fique amarelo terroso.
  8. Mude para o fluido de perfusão B contendo 0.05% de colagenase tipo IV. Continue a perfusão até que o fígado esteja totalmente digerido.
    NOTA: Leva pelo menos 10 minutos por camundongo para que o fígado seja digerido. Um volume de 80 mL de solução de perfusão B contendo colagenase é suficiente para um camundongo digerir seu fígado. O tecido hepático sofre digestão enzimática completa até atingir o amolecimento máximo, com o parênquima capsular atingindo um estado de extrema fragilidade suscetível a ruptura mecânica.
  9. Remova o fígado do abdômen do camundongo. Coloque o fígado em um prato de 10 cm contendo DMEM.
  10. Prossiga em um gabinete de biossegurança. Desfie o fígado em pó usando uma pinça (o fígado bem digerido libera hepatócitos facilmente).
  11. Filtrar a suspensão através de um filtro de malha de 70 μm para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml. Ajuste o volume para 45 mL (por mouse) com meio DMEM.
  12. Centrifugue a 50 × g por 4 min. Despeje o sobrenadante completamente.
  13. Ressuspenda o pellet com meio DMEM até um volume final de 25 mL (por mouse). Centrifugue novamente a 50 × g por 2 min.
  14. Despeje o sobrenadante completamente. Ressuspenda o pellet em 25 mL de meio de cultura suplementado com 10% de FBS.
  15. Misture bem a suspensão. Pinte as células com azul de tripano para contar. Prossiga para inocular para cultura imediatamente.
    NOTA: Coloque 2 mL de meio contendo 2 × 105 células por poço em placas de 6 poços revestidas de colágeno. Substituir o meio DMEM após 2 h de inoculação celular.

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Resultados

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O protocolo atual foi implementado em camundongos C57BL / 6J machos alimentados com HFD por mais de 12 semanas. Os hepatócitos primários isolados foram examinados quanto à morfologia e função. Obtivemos um rendimento médio de 2 × 107 células por isolamento de aproximadamente 40 g de fígado de camundongo. A viabilidade celular foi determinada entre 85% -86% pela coloração com calceína AM de células vivas. O rendimento de cada isolamento de camundongo obeso induzido por dieta (DI...

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Discussão

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O isolamento de hepatócitos viáveis de camundongos envolve um procedimento crítico de duas etapas, começando com perfusão vascular completa usando solução isotônica para remover componentes sanguíneos, seguido por digestão enzimática controlada com solução de colagenase ativa 9,10. O isolamento bem-sucedido depende da manutenção de condições fisiológicas ideais durante todo o processo, particularmente temperatura (37 °C) e pH (7,...

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Divulgações

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Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelos autores.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [nº 82373967].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga estéreis de 50 mLNest602052
anticorpo anti-HNF4αImunocorpoanti-IgG Immunoway YM8517
Proteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
CentrífugaTérmica Sorvall ST16R
Colágeno Tipo I Corning354236
colagenase, tipo 4Sangon BiotechA004186-0001
Agulha de retençãoBRAUN4254074B
Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
EtanolMerck (SigmaAldrich)493511
Soro Fetal BovinoSigmaF2442
GlicoseMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 · 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
Filtro de agulha 0.22µ MMillex-GPSLGV033RB
Nile RedInvitrogenN1142
Penicilina/estreptomicina (100X)Gibco15140122
Adenovírus recombinanteObio Technology Corp., ltd. Adenovírus recombinantes que codificam IER2 de camundongo marcado com bandeira (Ad-Ier2, NM_010499.4) e adenovírus de controle (Ad-NC) foram construídos pela Obio Technology Corp., ltd.
Pentobarbital de sódioMerck (SigmaAldrich)P3761
Filtros de células estéreis, 100 μ mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
Bomba peristáltica de fluxo variávelLongerBT100-1F

Referências

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