Protocolo atualizado para montagem e uso do arranjo de minibiorreatores (MBRA)

Summary

O Minibioreactor Array (MBRA) é um sistema de cultura de fluxo contínuo, personalizável e de alto rendimento que permite o cultivo de comunidades microbianas complexas, apoiando experimentos paralelos para estudar a dinâmica do microbioma, interações terapêuticas e respostas microbianas a fatores ambientais.

Abstract

O microbioma humano compreende comunidades microbianas diversas e dinâmicas que desempenham papéis essenciais na saúde do hospedeiro. Compreender essas comunidades e suas respostas aos fatores ambientais é fundamental para o avanço da terapêutica baseada no microbioma. Os modelos in vitro tradicionais para o cultivo de microbiota derivada do homem muitas vezes carecem de escalabilidade e exigem amplo conhecimento técnico, limitando sua acessibilidade e rendimento. Para resolver essas limitações, desenvolvemos o sistema Minibioreactor Array (MBRA) - uma plataforma modular, de estágio único e fluxo contínuo para o cultivo de alto rendimento de comunidades microbianas. Este sistema permite o cultivo paralelo de até 48 comunidades microbianas distintas, apoiando a flexibilidade experimental e mantendo o crescimento estável de ecossistemas complexos. Este protocolo fornece orientação detalhada sobre fabricação, montagem, esterilização e operação do MBRA. O design modular do sistema permite fácil integração em câmaras anaeróbicas e suporta personalização para uma ampla gama de aplicações experimentais. Ele tem sido usado para estudar respostas microbianas a antibióticos, compostos dietéticos e invasão de patógenos, e para rastrear comunidades resistentes a patógenos. Com sua acessibilidade, escalabilidade e reprodutibilidade, o MBRA representa um poderoso sistema modelo para investigar interações microbianas e avançar na pesquisa de microbiomas.

Introduction

O microbioma humano é um ecossistema complexo de microrganismos que desempenha um papel crítico em vários processos fisiológicos e impacta profundamente a saúde humana. O microbioma humano abrange muitos locais anatômicos em todo o nosso corpo, cada um contendo comunidades microbianas dinâmicas interagindo ativamente de maneiras que ainda não entendemos completamente¹. Expandir nosso conhecimento sobre o envolvimento de comunidades microbianas na saúde e na doença depende de nossa compreensão das interações microbianas que ocorrem nesses ambientes¹. Para estudar e manipular efetivamente esses sistemas intrincados para fins terapêuticos, é necessária uma abordagem reducionista. Explorar interações microbianas individuais usando sistemas de modelo simplificados facilita uma melhor compreensão de toda a complexidade do microbioma².

Uma ampla variedade de sistemas modelo está disponível para aumentar as comunidades microbianas derivadas de humanos. Esses sistemas avançaram nossa compreensão das comunidades microbianas associadas ao homem e variam de cultura em lote de estágio único a sistemas de fluxo contínuo de vários estágios mais complexos. Sistemas modelo, como o Simulador de Ecossistema Microbiano Intestinal Humano³, o sistema de Quimiostatos de Estágio Único de Vasos Gêmeos⁴ e o Sistema de Controle Ambiental para Microbiota Intestinal⁵ replicam as condições fisiológicas de locais anatômicos específicos e fornecem aproximações in vitro de ambientes microbianos. No entanto, sua adoção por microbiologistas é limitada porque são caras, exigem conhecimento técnico de alto nível para serem executadas e mantidas e têm rendimento limitado.

Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos o sistema Minibioreactor Array (MBRA) - um sistema de cultura de fluxo contínuo e estágio único projetado para facilitar o crescimento estável de comunidades microbianas de diversas fontes em um ambiente controlado ^6,7,8. O sistema MBRA se destaca de outros modelos de intestino com sua simplicidade de montagem e operação, combinada com recursos de alto rendimento que permitem o cultivo simultâneo de várias comunidades microbianas, aumentando a eficiência experimental. Além disso, a natureza simples e compacta deste sistema permite sua operação dentro de câmaras anaeróbicas e microóxicas para facilitar o crescimento de bactérias de locais anaeróbicos e hipóxicos, como o trato gastrointestinal e vaginal. A natureza versátil desse sistema tem sido aproveitada para a triagem de comunidades gastrointestinais resistentes a Clostridioides difficile ⁹, bem como para testar os efeitos de antibióticos^10,11 e substratos dietéticos¹² nas comunidades microbianas.

Os MBRAs são fabricados por impressão 3D ou manufatura aditiva, priorizando a clareza e a resistência à água em nossa escolha de materiais (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre polímeros). Cada matriz contém seis câmaras individuais, todas equipadas com portas para importação de mídia, exportação de resíduos e coleta de amostras. O meio fresco é continuamente fornecido ao sistema enquanto os resíduos são extraídos simultaneamente, com taxas de fluxo controladas com precisão por duas bombas peristálticas. O conteúdo do sistema é constantemente agitado usando barras de agitação e uma placa de agitação de 60 pontos para facilitar culturas homogêneas. O protocolo descrito aqui é otimizado para um volume de trabalho de 15 mL por câmara, embora cada biorreator possa acomodar uma faixa de 1 a 20 mL, dependendo dos requisitos experimentais. A bomba peristáltica e a tubulação da bomba podem acomodar vazões que variam de 0,016 a 2,9 mL/min, correspondendo a taxas de rotatividade de aproximadamente 15,63 a 0,09 h, respectivamente. Embora o sistema seja compatível com uma ampla gama de formulações de meios e adições dietéticas ou nutricionais, algumas considerações práticas devem ser consideradas: meios altamente viscosos podem exigir recalibração das taxas de fluxo, e a presença de partículas não dissolvidas ou componentes insolúveis pode entupir a tubulação da bomba ou conectores estreitos, particularmente em taxas de fluxo mais baixas. A modularidade do sistema permite uma adaptação rápida e fácil de experimentos, ajustando a escolha do meio, a coleta de amostras, as taxas de fluxo e o volume de trabalho. Em conjunto com quatro bombas peristálticas de 24 canais e duas placas de agitação de 60 pontos, o sistema pode executar 48 câmaras separadas por experimento em uma única câmara anaeróbica, suportando triagem anaeróbica de alto rendimento.

Este protocolo serve como um guia visual e uma versão atualizada de um método de montagem e operação MBRA publicado anteriormente desenvolvido por nosso laboratório⁴. Várias melhorias importantes foram incorporadas para melhorar a reprodutibilidade, simplificar o fluxo de trabalho e minimizar a contaminação. Primeiro, os canudos de PTFE agora são quimicamente gravados para evitar que se soltem e caiam nas câmaras do biorreator. Em segundo lugar, um canudo de mídia foi adicionado às linhas de alimentação para direcionar o fluxo de mídia para o fundo das câmaras, evitando que a mídia escorra pelas paredes da câmara. Esta era uma fonte conhecida de formação de biofilme. Em terceiro lugar, os comprimentos dos tubos C-flex foram padronizados e reduzidos, e um suporte de tubo impresso em 3D foi projetado para criar uma configuração mais compacta e organizada. Finalmente, os biorreatores não são mais totalmente desmontados entre cada uso, reduzindo significativamente o tempo e os custos de material associados a experimentos repetidos. Esses e outros refinamentos incrementais refletem a otimização iterativa com base no uso extensivo do sistema em vários projetos em nosso laboratório.

Protocol

NOTA: Este protocolo é para a preparação e montagem de uma única tira de MBRA (Figura 1). Cada MBRA consiste em um biorreator impresso em 3D, tubulação para facilitar o influxo de um meio de crescimento e tubulação para facilitar o efluxo de resíduos das câmaras do biorreator. Uma lista completa das partes que compõem um único MBRA, incluindo imagens, pode ser encontrada na Tabela 1. O equipamento adicional necessário inclui duas bombas peristálticas e uma placa de agitação (consulte a Tabela de Materiais para obter informações específicas do dispositivo).

1. Preparação da pré-montagem

1. Corrosão por politetrafluoretileno (PTFE)
   NOTA: Embora as propriedades químicas do PTFE o tornem ideal para uso neste sistema MBRA, sua lubricidade impossibilita a ligação a outras peças do biorreator usando apenas epóxi. Para fixar a tubulação de PTFE nos luers macho rosqueados, ela deve primeiro ser quimicamente gravada para permitir a ligação do epóxi. Um ácido de fluorocarbono é usado (consulte a Tabela de Materiais). A Figura 2A serve como um guia visual para a fita adesiva da tubulação de PTFE para facilitar esse processo de gravação.
   1. Corte doze comprimentos de 25 mm de tubo de PTFE. Seis deles serão cortados ao meio após a corrosão para servir como canudos para as linhas de alimentação ("canudo de mídia").
      NOTA: Apenas a seção que está sendo colada deve ser gravada. Para evitar corrosão da superfície interna e áreas indesejadas, a tubulação deve ser colada e vedada em ambas as extremidades.
   2. Usando fita de rotulagem de laboratório de uso geral (19 mm de largura), enrole a fita completamente na parte superior, cobrindo ~ 5 mm da tubulação de PTFE (Figura 2A). Aplique outra seção de fita ao redor da parte inferior, cobrindo ~ 10 mm do tubo de PTFE (Figura 2A).
   3. Aperte firmemente as extremidades da fita para evitar que a solução de condicionamento atinja o interior do PTFE (Figura 2A). Isso deve deixar ~ 10 mm de tubulação de PTFE exposta para gravação.
   4. Prepare quatro soluções: A solução de corrosão de fluorocarbono aquecida a 55 ° C (consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes da solução de corrosão de fluorocarbono), etanol 100% (EtOH), H₂O destilado aquecido a 70 ° C e H₂O destilado + ácido acético 2-5% aquecido a 70 ° C.
      CUIDADO: A solução de corrosão de fluorocarbono é altamente corrosiva. Execute todas as etapas em uma hotte com EPI. Descarte os produtos químicos de acordo com as diretrizes institucionais.
   5. Aquecer todas as soluções às temperaturas indicadas no passo 1.1.4. A solução de corrosão de fluorocarbono deve ser aquecida em banho-maria, as outras soluções podem ser aquecidas em uma placa quente. Despeje as soluções em 4 recipientes de vidro separados com profundidade suficiente para submergir completamente o tubo com fita adesiva.
   6. Mergulhe toda a tubulação de PTFE na solução de ácido fluorcarbono. Agite para garantir uma exposição uniforme da superfície. Deixe de molho por 1 min, até que a superfície gravada fique marrom.
      NOTA: Uma colher de filtro de skimmer de metal pode ser usada para transferir tubos de PTFE entre soluções.
   7. Transfira a tubulação para o banho de EtOH por 5-20 s.
   8. Transfira a tubulação para o banho de 70 °C H₂0 por 15-30 s.
   9. Transfira a tubulação para o banho de ácido acético a 70 °C_{H 2}0 + 2-5% por 1 min.
   10. Remova o tubo e coloque uma almofada absorvente dentro da hotte. Deixe o tubo gravado secar durante a noite (pelo menos 16 h). Após a secagem, remova a fita do tubo gravado.
   11. O PTFE gravado está pronto para colagem e permanecerá aderente por vários meses se armazenado em temperatura ambiente. Uma vez que a coloração marrom nas superfícies de gravação desbota, ela não pode mais ser colada.
       NOTA: Não exponha o PTFE gravado à luz UV, pois isso degradará a gravação.
   12. Corte 6 dos tubos de PTFE gravados ao meio para servir como canudos para as linhas de alimentação (Figura 2A).
2. Canudos de resíduos e mídia epóxi
   1. Insira cada um dos 6 canudos de resíduos de PTFE gravados e 6 canudos de mídia de PTFE gravados em seus respectivos luer macho rosqueado. Certifique-se de que as superfícies gravadas estejam alinhadas com a parte inferior do luer macho (Figura 2).
   2. Misture resina epóxi e endurecedor na proporção de 1:1 em um barco de pesagem ou placa de Petri. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, aplique epóxi ao redor da base do luer macho rosqueado onde ele encontra o tubo de PTFE.
   3. Posicione cada peça verticalmente e deixe o epóxi endurecer por 24 h.
      NOTA: Uma caixa de ponteira de 1 mL de pipeta vazia funciona bem para mantê-los na posição vertical.

2. Montagem MBRA

1. MBRA e preparação de peças
   1. Certifique-se de que as tiras de matriz do minibiorreator sejam impressas em 3D (consulte o Arquivo Suplementar 1) e contenham 6 câmaras de biorreator independentes. Cada câmara contém três portas de 1/4 de polegada, que devem ser rosqueadas para inserir as conexões. Faça o rosqueamento com uma torneira de fração de 1/4 de polegada-28NF com uma chave de torneira com alça em T.
      NOTA: Recomenda-se o uso de uma guia de torneira ao rosquear as portas para garantir uma rosca de prumo.
   2. Uma vez rosqueado, lave cada câmara do biorreator com água para remover qualquer resíduo de plástico. Adicione uma barra de agitação magnética de 10 x 3 mm e 1 mL de água destilada em cada câmara. A água ajudará no processo de esterilização durante a autoclavagem.
   3. Posicione uma arruela de borracha em cima de cada porta do biorreator. Para cada câmara, aparafuse 1 luer macho com rosca de palha residual, 1 luer macho com rosca de palha de mídia e 1 luer macho roscado vazio em cada uma das portas, conforme indicado na Figura 2B.
   4. Insira 6 septos de borracha em farpas luer fêmeas de 3/32 de polegada. Dobre a manga superior dos septos para baixo para cobrir o pescoço. Conecte-os às portas de cada câmara indicadas na Figura 2B.
   5. Corte tiras de tubos C-flex do seguinte comprimento: 2 3/8 polegadas, 3 11/16 polegadas, 5 1/4 polegadas, 6 1/2 polegadas, 7 13/16 polegadas e 9 polegadas e 9 polegadas (duas de cada comprimento serão necessárias para as linhas de resíduos e as linhas de alimentação). Depois de cortado, prenda uma farpa luer fêmea de 1/8 de polegada em uma extremidade e um conector de trava luer macho na extremidade oposta de cada comprimento de tubo.
      NOTA: Os comprimentos usados aqui são otimizados para reduzir a desordem e para bombas colocadas a ~ 1 polegada de distância da placa de agitação. Dependendo da configuração desejada, podem ser necessários comprimentos maiores.
   6. Insira uma farpa luer fêmea de 1/16 de polegada em cada extremidade do tubo vermelho de 2 pontos do E-lab (1.14 mm de diâmetro interno) e do tubo laranja de 2 pontos do E-lab (0.89 mm de diâmetro interno). Repita esse processo seis vezes para cada tira de MBRA.
      NOTA: Para facilitar a inserção da farpa luer fêmea de 1/16 de polegada, mergulhe brevemente as extremidades da tubulação do E-lab em água quase fervente para amolecer o plástico.
   7. Conecte a tubulação do E-lab à tubulação C-flex preparada na etapa 2.1.5. Cada um dos 6 comprimentos de tubulação C-flex deve ser conectado a uma linha E-lab vermelha e laranja por meio de luers fêmeas.
   8. Corte vinte e um pedaços de 1 polegada, um pedaço de 2 polegadas, três pedaços de 3 polegadas e um pedaço de tubo C-flex de 12 polegadas. Conecte uma farpa luer fêmea de 1/8 de polegada e um conector luer lock macho nas extremidades de uma peça de 3 polegadas e da peça de tubulação de 12 polegadas. Para a tubulação restante, conecte os conectores luer lock macho em ambas as extremidades. Essas peças compreenderão os conjuntos de linha de resíduos e árvore da linha de alimentação.
2. Montagem de árvore de linha de resíduos
   1. Siga o diagrama 3D mostrado na Figura 3B para montar a árvore da linha de resíduos.
   2. Conecte as extremidades expostas da tubulação vermelha E-lab de 2 paradas (1.14 mm de diâmetro interno) às travas luer macho do terminal na árvore da linha de resíduos montada. Conecte-os em ordem crescente com base no comprimento do tubo C-flex conectado ao tubo E-lab de 2 paradas. Conecte o tubo C-flex de 3 polegadas com a farpa luer fêmea de 1/8 de polegada e o conector luer lock macho no topo da árvore da linha de resíduos.
3. Montagem da árvore da linha de alimentação
   1. Siga o diagrama 3D mostrado na Figura 3A para montar a árvore da linha de alimentação.
      NOTA: As árvores da linha de alimentação não incorporam os conectores luer macho-macho usados na árvore da linha de resíduos. Em nossa experiência, esses conectores são propensos a vazamentos e podem se soltar facilmente, aumentando o risco de contaminação nas câmaras do biorreator e nos frascos de mídia. Para mitigar isso, a árvore da linha de alimentação é construída sem esses componentes.
   2. Conecte as extremidades expostas da tubulação laranja de 2 pontos E-lab (0.89 mm de diâmetro) às travas luer macho terminal na árvore da linha de alimentação montada. Anexe-os em ordem crescente com base no comprimento do tubo C-flex conectado ao tubo E-lab de 2 paradas. Conecte o tubo C-flex de 12 polegadas ao topo da árvore da linha de alimentação.
4. Montagem completa: Combine os componentes preparados no sistema de cultura MBRA.
   1. Conecte o tubo C-flex de comprimento variável no final da árvore da linha de alimentação ao biorreator, em ordem crescente, com a linha mais curta no lado esquerdo da faixa do biorreator e a mais longa à direita.
   2. Conecte a tubulação C-flex de comprimento variável no final da árvore da linha de resíduos à tira do biorreator em ordem decrescente, com a linha mais longa à esquerda e a mais curta à direita. A linha de resíduos mais curta está localizada no lado direito da faixa do biorreator porque está mais próxima da bomba de resíduos. Em contraste, a linha de alimentação mais longa está no lado direito porque a bomba de alimentação está localizada à esquerda (Figura 1).
5. Esterilização de matrizes montadas: Prepare o sistema montado para esterilização.
   1. Agrupe todas as linhas de alimentação C-flex no lado esquerdo do MBRA e prenda com uma braçadeira de torção. Faça o mesmo para as linhas de resíduos no lado direito da faixa.
   2. Forme um laço com a tubulação laranja de 2 paradas E-lab entre as linhas C-flex. Prenda o laço usando fita adesiva de autoclave. Faça o mesmo para a tubulação vermelha de 2 pontos do E-lab no lado residual da faixa do biorreator. Isso economizará espaço durante a autoclavagem.
   3. Cubra o luer fêmea no final da linha de resíduos e alimente a árvore da linha com um pedaço de papel alumínio para evitar a contaminação após a remoção da autoclave. Afrouxe os luers rosqueados macho com os septos em cada câmara do biorreator para permitir que o vapor escape durante a autoclavagem.
      NOTA: Esta etapa é crítica para garantir que o vapor escape do biorreator durante a autoclavagem. Se não for ventilado adequadamente, podem ocorrer rachaduras nas câmaras do biorreator.
   4. Coloque o MBRA em uma caixa de autoclave e estique a linha de alimentação e as árvores da linha de resíduos em caixas separadas adjacentes à caixa que contém os MBRAs. Se a tubulação E-lab perto da farpa luer fêmea de 1/16 de polegada ou qualquer seção da tubulação C-flex estiver dobrada durante a autoclavagem, a tubulação pode entupir, impedindo o fluxo de mídia ou resíduos.
   5. Autoclave a 121 °C, ≥ 15 psi por 25 min. Use um programa de exaustão lenta típico dos ciclos de líquidos. Deixe o biorreator esfriar à temperatura ambiente após o ciclo de autoclave. Depois que o MBRA esfriar o suficiente, reaperte os luers macho rosqueados com os septos.
      NOTA: As tiras de biorreatores autoclavadas tornam-se maleáveis e propensas a rachaduras se comprimidas. Deixe esfriar antes de apertar as conexões.
      NOTA: A tubulação laranja de 2 paradas E-lab é propensa a rachaduras durante o processo de autoclave e pode se separar da farpa luer fêmea de 1/16 de polegada. Se ocorrer rachadura, borrife ambas as extremidades com etanol a 70%, corte a extremidade rachada com uma navalha estéril e recoloque o tubo na farpa luer. Alternativamente, tubos E-lab adicionais com luers fêmeas de 1/16 de polegada acoplados podem ser esterilizados separadamente em uma bolsa de autoclave, e todo o tubo pode ser trocado.

3. Montagem de mídia e frasco de resíduos

1. Montagem de garrafa de mídia
   NOTA: No presente exemplo, todo o sistema é alimentado com uma única garrafa de 2L. Consulte a Figura 4A para obter uma imagem do conjunto da tampa do frasco de mídia.
   1. Aparafuse os adaptadores Dibafit (adaptadores de tampa de garrafa) nas duas portas rosqueadas na parte superior da tampa de garrafa da série Q. Adicione uma seção de 3 polegadas de tubo C-flex a um dos adaptadores e uma seção de 12 polegadas de tubo C-flex ao outro. No final de cada seção de tubulação, adicione um conector luer lock macho.
      NOTA: O comprimento da tubulação necessária para alcançar a árvore da linha de alimentação do MBRA pode variar e pode ser ajustado de acordo.
   2. Corte um pedaço de tubo de PTFE de 12 polegadas para servir como canudo para extrair a mídia. Corte a extremidade em um ângulo de 45° usando uma lâmina de barbear para evitar entupimento na parede lateral da garrafa. Insira o PTFE no pequeno orifício na parte inferior da tampa da garrafa conectado à seção de 12 polegadas da tubulação C-flex.
   3. Corte um pedaço de tubo C-flex de 2 polegadas e prenda uma farpa luer fêmea em uma extremidade e um conector luer lock macho na outra. Conecte esta tubulação à seção de 12 polegadas da tubulação que eventualmente se conectará à árvore da linha de alimentação. Prenda a peça de 2 polegadas com um Pinchcock. Coloque o laço do Pinchcock ao redor do tubo de 3 polegadas da tampa da garrafa. Isso servirá como uma rolha temporária para evitar vazamento de mídia durante e após a autoclavagem.
   4. Prepare a mídia desejada. Instale a tampa do frasco totalmente montada no frasco de mídia. Enrole o tubo C-flex de 12 polegadas ao redor da garrafa e prenda a extremidade com o Pinchcock no tubo de 2 polegadas, conforme descrito acima. Não aperte bem a tampa, mas afrouxe-a ligeiramente para evitar o acúmulo de pressão durante a autoclavagem.
   5. Use papel alumínio para cobrir a extremidade do tubo de 3 polegadas proveniente da tampa da garrafa. Autoclave por um tempo adequado ao protocolo da mídia. Após a esterilização, remova a película do tubo de 3 polegadas e aparafuse um filtro de seringa de 0.22 μm no conector luer lock macho. Isso permitirá o fluxo de ar para o frasco de mídia durante o bombeamento, mas evitará a contaminação.
      NOTA: Antes de usar, certifique-se de que as tampas das garrafas da série Q estejam bem fechadas nas garrafas, pois uma vedação inadequada pode impedir o fluxo adequado.
2. Montagem de garrafas de resíduos: Para evitar a troca de garrafas de resíduos todos os dias, o laboratório criou um sistema de coleta de resíduos em camadas (Figura 4B) que permite que várias garrafas de 2L sejam preenchidas com resíduos durante o experimento. A configuração deste sistema de resíduos em camadas é a seguinte:
   1. Aparafuse os adaptadores da tampa da garrafa nas duas portas rosqueadas na parte superior de uma tampa de garrafa da série Q. Repita para 2-4 tampas de garrafa, dependendo do número de garrafas de armazenamento de resíduos necessárias.
   2. Corte um pedaço de PTFE de 2 polegadas para cada tampa de garrafa. Insira esta peça dentro da tampa da garrafa no orifício designado para remover os resíduos para a próxima garrafa no sistema.
   3. Corte um pedaço de tubo C-flex longo o suficiente para esticar entre a árvore da linha de resíduos que sai da bomba até o local do sistema de garrafas de resíduos. Encaixe um conector luer lock macho na extremidade adjacente à árvore da linha de resíduos e conecte a outra extremidade ao adaptador da tampa da garrafa sem a tubulação de PTFE na tampa da garrafa.
   4. Corte um segundo pedaço de tubo C-flex para conectar as tampas das garrafas no primeiro e no segundo frascos de resíduos. Conecte o tubo no adaptador da tampa da garrafa com o canudo de PTFE na primeira garrafa e no adaptador da tampa da garrafa sem o canudo de PTFE na segunda garrafa.
      NOTA: Cada garrafa na cascata de garrafas de resíduos em camadas deve ser posicionada acima da primeira para permitir que a gravidade auxilie o fluxo de uma garrafa para a próxima (Figura 4B). Recomenda-se colocar todas as garrafas em um recipiente secundário (por exemplo, uma caixa de armazenamento de plástico aberta) e organizá-las em ordem decrescente usando risers, como recipientes de objetos cortantes invertidos.
   5. Continue esta cadeia para quantas garrafas desejar. Na garrafa final, conecte um segmento de tubulação C-flex de 3 polegadas com um conector luer lock macho ao adaptador de tampa de garrafa livre. Em seguida, conecte uma seringa de 20 mL para aplicar um vácuo e facilitar a cascata de resíduos.

4. Conexão, operação e desmontagem de MBRA

1. Fixação em bombas
   1. Remova a fita de autoclave que prende a tubulação do E-lab para as linhas de resíduos e alimentação. Desamarre os feixes de tubos C-flex.
   2. Posicione o MBRA entre as duas bombas na parte superior da placa de agitação. Ele pode ser fixado na placa usando os suportes impressos em 3D (consulte o Arquivo Suplementar 2). Certifique-se de que está alinhado com as posições de agitação indicadas na placa de agitação.
   3. Conecte a tubulação E-lab da linha de alimentação aos cartuchos da bomba peristáltica. Posicione os batentes da tubulação do E-lab nos slots dos cartuchos. Faça o mesmo para a tubulação E-lab da linha de resíduos na bomba à direita da placa de agitação.
   4. Trave os cartuchos da bomba peristáltica na bomba. Certifique-se de que os cartuchos estejam totalmente encaixados contra a bomba e que a tubulação esteja dentro do canal dos cartuchos.
      NOTA: Bloqueie os cartuchos nas bombas apenas se pretender iniciar o fluxo dentro de 24 h. Se deixados clamped sem fluxo de mídia por mais de 24 h, os tubos podem ficar comprimidos e entupidos. Se isso acontecer, basta remover a braçadeira e massagear suavemente a tubulação no ponto de compressão.
   5. Arrume a tubulação C-flex usando os suportes de tubo impressos em 3D (Arquivo Suplementar 3).
   6. Prenda a extremidade da árvore da linha de resíduos ao tubo que leva às garrafas de resíduos.
      NOTA: Ao executar vários MBRAs, as árvores da linha de resíduos precisarão ser bifurcadas antes de serem conectadas à tubulação que leva às garrafas de resíduos. Isso pode ser feito criando uma árvore de ramificação simples para cada MBRA adicional.
   7. Conecte o luer fêmea na tubulação de entrada da linha de alimentação ao conector macho no tubo de 12 polegadas da tampa do frasco de mídia.
      NOTA: Ambas as extremidades devem estar estéreis neste momento. Evite tocá-los com qualquer fonte potencial de contaminação. Se houver suspeita de contaminação, mergulhe cada extremidade em alvejante a 10% por 10 minutos antes de conectar.
   8. Ligue ambas as bombas para iniciar o fluxo de mídia. Certifique-se de que as bombas estejam fluindo na direção correta (ambas ajustadas no sentido horário ("CW") se o desperdício estiver à direita das bombas).
   9. Observe o tamanho e a cadência das gotículas de mídia que caem em cada câmara do biorreator; Quaisquer grandes diferenças nisso podem indicar variabilidade da taxa de fluxo. Se for observada variabilidade, recomenda-se trocar qualquer tubo de alimentação laranja de 2 pontos do E-lab conectado à câmara do biorreator agressor. Isso ajudará a limitar a variabilidade da taxa de fluxo na execução experimental.
      NOTA: Este é o momento de diagnosticar e corrigir quaisquer vazamentos no sistema, portanto, monitore de perto o processo de enchimento inicial.
   10. Quando as câmaras do biorreator atingirem a capacidade máxima, desligue ambas as bombas e deixe os biorreatores parados por 24-48 h. Esta etapa é essencial para verificar se há qualquer contaminação potencial nas câmaras antes do início do experimento.
2. Inoculação MBRA
   NOTA: Aqui descrevemos o protocolo básico para esterilizar os septos e injetar um inóculo.
   1. Preparar o inóculo de acordo com as especificações pretendidas.
   2. Aplique uma solução de alvejante a 10% recém-feita na parte superior dos septos em cada câmara do biorreator usando um conta-gotas de plástico. Deposite alvejante suficiente para cobrir completamente a parte superior dos septos. Deixe descansar por 10 min. Seque os septos usando um lenço estéril.
   3. Usando uma agulha 22 G de 3 polegadas de comprimento e uma seringa contendo a amostra, perfure o centro dos septos. Certifique-se de que a agulha toque o meio dentro da câmara e, em seguida, injete o inóculo na câmara do biorreator. Lave a seringa removendo o meio e reinjetando-o de volta na câmara. Remova as agulhas dos septos e descarte-as em um recipiente para objetos cortantes.
   4. Deixar o inóculo crescer durante um período adequado, com base na concepção experimental, antes de iniciar o fluxo. Por exemplo, as comunidades bacterianas fecais requerem um crescimento inicial em lote de 4-16 h para aumentar a biomassa suficiente⁸.
   5. Ligue ambas as bombas para a vazão desejada, dependendo do tempo de rotação necessário. Consulte o manual da bomba peristáltica para obter mais informações sobre vazões.
      NOTA: Independentemente da vazão desejada, a bomba de resíduos deve sempre funcionar a uma velocidade mais alta do que a bomba de mídia para garantir que as câmaras do biorreator não transbordem. Para o cultivo da nossa comunidade bacteriana gastrointestinal, usamos uma taxa de rotatividade de 1,92 mL/h, obtida ajustando a bomba de mídia para 1,0 rpm e a bomba de resíduos para 2,0 rpm.
   6. Novamente, observe o tamanho e a cadência das gotículas de mídia caindo em cada câmara do biorreator, quaisquer grandes diferenças nisso podem indicar variabilidade da taxa de fluxo. Se for observada variabilidade, recomenda-se trocar qualquer tubo de alimentação laranja de 2 pontos do E-lab conectado à câmara do biorreator agressor. Isso ajudará a limitar a variabilidade da taxa de fluxo em execuções experimentais.
3. Amostragem MBRA
   1. Aplique uma solução de alvejante a 10% no topo dos septos em cada câmara do biorreator, o suficiente para revestir completamente a superfície. Deixe descansar por 10 min. Após 10 min, seque os septos usando um lenço estéril.
   2. Usando uma agulha e seringa de calibre 22 de 3 polegadas de comprimento, perfure o centro dos septos e insira a agulha totalmente na câmara do biorreator. Enquanto segura a seringa, puxe o êmbolo para remover a amostra da câmara.
      NOTA: Evite remover mais de 20% do volume total da câmara do biorreator de uma só vez. A remoção de mais do que isso pode perturbar a comunidade microbiana, pois o efluxo de resíduos é interrompido até que o meio fresco reabasteça a câmara até o nível de palha de resíduos de PTFE.
   3. Retire a agulha e distribua a amostra para um recipiente apropriado. Descarte a agulha em um recipiente para objetos cortantes.
4. Desmontagem e reforma de MBRA
   NOTA: Após os experimentos, o MBRA precisará ser esterilizado e preparado para experimentos futuros.
   1. Troque a entrada do meio com 1 L de alvejante a 10% em água deionizada (DI). Aumente a vazão em ambas as bombas ao máximo para deslocar o conteúdo das câmaras do biorreator com a solução de alvejante.
   2. Assim que as câmaras ficarem claras (todos os meios foram substituídos por alvejante), inverta o MBRA para desinfetar acima da linha de enchimento por 5 min. Após 5 min, endireite a tira e aguarde mais 5 min para esterilização.
      NOTA: Não permita que o alvejante fique além dos 10 minutos descritos acima, pois isso causará descoloração do plástico e enfraquecimento da mídia e dos tubos residuais.
   3. Substitua a solução de alvejante a 10% por 1 L de água DI. Lave o sistema com água DI até que toda a água tenha passado. Desconecte a tubulação do biorreator E-lab das bombas e remova os MBRAs.
   4. Para reformar, remova os septos usados e tudo, exceto 1mL de água de cada câmara.
   5. Substitua os septos e a tubulação laranja de 2 pontos do E-lab e siga as etapas anteriores para se preparar para a autoclavagem (etapas 2.5.1 a 2.5.5) até 3 vezes. Após a terceira reutilização, o MBRA deve ser completamente desmontado, o tubo C-flex substituído e cada peça individual esterilizada com EtOH 70% ou substituída se quebrada. O epóxi que contém os resíduos e o PTFE de alimentação se tornará quebradiço após vários ciclos de autoclave e precisará ser reaplicado.
      NOTA: A tubulação laranja de 2 paradas E-lab é substituída entre cada corrida para limitar a variabilidade da taxa de fluxo causada pelo desgaste e ciclos repetidos de autoclave.

Results

Para facilitar o crescimento de bactérias anaeróbicas, como as encontradas no trato gastrointestinal, o MBRA pode ser configurado e operado dentro de câmaras anaeróbicas. Para demonstrar a capacidade de cultivar comunidades bacterianas complexas diretamente de locais relevantes no corpo humano, uma amostra fecal humana foi preparada e cultivada neste sistema. Todo o trabalho foi realizado em câmara anaeróbia regulada para 37°C, e as culturas foram cultivadas em nosso meio biorreator, BRM3⁷.

A pasta fecal foi preparada descongelando as fezes humanas anaerobicamente e, em seguida, misturando-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 25% p / v. Após a confirmação da esterilidade, nove câmaras de biorreatores foram inoculadas, cada uma com 3 mL da mesma pasta fecal. As comunidades microbianas foram cultivadas durante a noite sem entrada de meios ou remoção de resíduos, resultando em culturas de lotes separadas durante um período de 16 horas. Em seguida, as bombas de alimentação foram ligadas e ajustadas para uma vazão de 1,92 mL por h. Após quatro dias de fluxo contínuo, as amostras foram coletadas dos biorreatores e analisadas quanto à composição da comunidade microbiana usando sequenciamento do gene 16S rRNA seguido de denoising com Deblur e classificação taxonômica com o banco de dados SILVA 138 SSU no QIIME 2¹³. Um total de 65 gêneros foram detectados em todas as nove réplicas, mas os biorreatores foram dominados por apenas 18 gêneros, cada um compreendendo pelo menos 2% de abundância em qualquer uma das nove réplicas (Figura 5). Os biorreatores apresentaram alta reprodutibilidade, de modo que 22 dos 65 gêneros foram detectados em todas as nove repetições, e 17 gêneros adicionais foram detectados em pelo menos metade das repetições. A maioria dos gêneros ausentes de pelo menos um reator (37 de 43 gêneros) eram espécies raras, cada uma com abundância relativa abaixo de 2% em biorreatores. Em resumo, as culturas de MBRA de fluxo contínuo suportaram comunidades microbianas complexas e reprodutíveis derivadas da mesma amostra de fezes, mesmo após culturas de lote separadas por 16 h dentro de cada câmara do biorreator.

Figura 1: O Minibioreactor Array (MBRA). MBRA totalmente montado, incluindo etiquetas para a árvore de tubulação da linha de alimentação e resíduos, as câmaras do biorreator e a faixa do biorreator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Guia de gravação de PTFE e layout da porta MBRA. (A) Fluxograma a seguir para a gravação dos canudos de PTFE de mídia e resíduos. (B) Cada câmara do biorreator contém uma porta para um canudo de meio + luer macho rosqueado, um canudo residual + luer macho rosqueado e um septo + luer macho rosqueado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Árvores de alimentação e linha de resíduos do MBRA. Imagens representativas a seguir na montagem de (A) árvore da linha de alimentação e (B) árvore da linha de resíduos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Tampa de garrafa de mídia e sistema de camada de resíduos. (A) Um exemplo de uma tampa de garrafa da série Q montada usada para puxar a mídia para os MBRAs. (B) Uma imagem do sistema de coleta de lixo em camadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Abundância relativa de gêneros bacterianos. (A) O gráfico de barras empilhadas mostra a abundância relativa de todos os gêneros que compreendem pelo menos 2% de abundância em qualquer uma das amostras exibidas. (B) Métricas de diversidade alfa de OTUs observadas e diversidade de Shannon entre todas as nove câmaras de biorreatores. Todas as nove câmaras do biorreator foram inoculadas com a mesma pasta fecal preparada a partir de fezes humanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Componentes do MBRA. Imagens e descrições de todas as peças individuais necessárias para montar totalmente o MBRA, juntamente com a quantidade necessária para cada componente. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Guia de solução de problemas. Problemas comuns encontrados na execução do MBRA, juntamente com suas possíveis causas e soluções recomendadas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo suplementar 1: Stl para impressão 3D das tiras do Minibioreactor Array. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Stl para impressão 3D dos suportes de biorreatores usados para ancorar os biorreatores nas placas de agitação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3.: Stl para impressão 3D dos suportes de tubos usados para organizar os resíduos C-flex e tubos de alimentação que se estendem dos MBRAs. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este protocolo descreve a montagem completa e a operação básica de um Minibioreactor Array (MBRA) para o cultivo de comunidades bacterianas de alto rendimento, incorporando vários refinamentos importantes ao método publicado anteriormente. O sistema MBRA continua sendo uma ferramenta versátil e econômica que permite aos pesquisadores cultivar ecossistemas microbianos complexos enquanto suporta inúmeras réplicas experimentais em paralelo. Nesta versão atualizada, introduzimos melhorias que melhoram a reprodutibilidade, simplificam o fluxo de trabalho e reduzem o risco de contaminação. Isso inclui canudos de PTFE quimicamente gravados (Figura 2) para evitar o desprendimento, um canudo de alimentação na linha de mídia (Figura 2) para minimizar a formação de biofilme, comprimentos de tubos padronizados com um suporte de tubo impresso em 3D (Arquivo Suplementar 3) para uma configuração mais compacta e organizada e um protocolo de reutilização otimizado que elimina a necessidade de desmontagem total entre os experimentos. Juntos, esses refinamentos representam melhorias iterativas desenvolvidas por meio do uso extensivo do sistema MBRA em diversas aplicações experimentais em nosso laboratório. Ao abordar as etapas críticas de montagem e os aprimoramentos práticos, esta discussão ressalta a utilidade do MBRA como um sistema modelo em constante evolução para a pesquisa de microbioma.

O sucesso do sistema MBRA depende muito da montagem e esterilização precisas dos componentes para garantir uma operação livre de contaminação. As principais etapas incluem o encaixe adequado das tampas, tubos e conectores da série Q, que facilitam a montagem modular e permitem a entrada de mídia e a coleta de resíduos. Garantir uma vedação hermética entre frascos de mídia, reservatórios de resíduos e câmaras de biorreatores é essencial para evitar vazamentos e manter condições estéreis. Outra etapa crítica é a verificação das taxas de fluxo da bomba peristáltica antes da experimentação, pois as inconsistências podem levar à entrega desigual do meio e afetar a dinâmica do crescimento microbiano. A maioria das bombas peristálticas multicanal que utilizam inclui um mecanismo de ajuste de oclusão, que deve ser usado para ajustar a vazão de cada canal. Mesmo com a calibração adequada, a tubulação do E-lab continua sendo a principal fonte de variabilidade. Para mitigar isso, é importante monitorar visualmente a frequência e o tamanho das gotículas de mídia que entram em cada câmara do biorreator durante o enchimento inicial e durante o início dos experimentos. Essas verificações visuais permitem a detecção precoce de inconsistências na taxa de fluxo que, de outra forma, poderiam comprometer a reprodutibilidade experimental. A Tabela 2 fornece estratégias de solução de problemas para problemas comuns encontrados durante a montagem e o uso de MBRAs. Essas etapas de solução de problemas garantem a reprodutibilidade entre os experimentos e evitam interrupções durante o cultivo de longo prazo.

Apesar de seus pontos fortes, o sistema MBRA tem certas limitações que devem ser consideradas ao projetar experimentos. Ao contrário dos sistemas mais avançados, o MBRA não possui recursos de monitoramento ativo, como medições de densidade óptica (OD) em tempo real, controle de pH e regulação de temperatura. Essa ausência de medição ativa restringe a capacidade do sistema de monitorar mudanças dinâmicas no crescimento microbiano e na atividade metabólica em tempo real. Além disso, embora o sistema suporte o cultivo anaeróbico dentro das câmaras, ele não inclui controle integrado de gás, o que pode limitar as aplicações que exigem ambientes microaerofílicos precisos ou enriquecidos com CO₂. Para estudos que requerem tal controle, sistemas alternativos com regulação de gás embutida podem ser mais adequados.

O sistema MBRA oferece vantagens importantes sobre os modelos de biorreatores existentes, incluindo alto rendimento, escalabilidade e custo-benefício, mantendo a capacidade de cultivar comunidades bacterianas complexas sob fluxo contínuo para imitar ambientes dinâmicos como o trato gastrointestinal humano ^6,8,10. Seu design compacto e modular permite a operação simultânea de vários biorreatores, tornando-o ideal para estudos de alto rendimento, como triagem de comunidades derivadas de fezes quanto à resistência à invasão de patógenos⁹. Este design modular oferece ampla flexibilidade experimental: cada tira pode ser fornecida por uma única garrafa de mídia, conforme demonstrado neste protocolo, ou por até seis fontes de mídia distintas, uma para cada câmara do biorreator. O volume de trabalho é governado pelo comprimento de um canudo fino de PTFE inserido na porta de resíduos de cada câmara, que define a altura do líquido; neste protocolo, canudos de 25 mm mantêm um volume de trabalho de 15 mL, mas volumes entre 1-20 mL podem ser alcançados aparando ou estendendo o canudo. Além disso, canudos de alimentação mais curtos são inseridos na entrada do meio para direcionar o fluxo em direção à base da câmara, evitando que o meio escorra pelas paredes da câmara e reduzindo a formação de biofilme acima da linha de enchimento. As velocidades da bomba ou o diâmetro da tubulação da bomba também podem ser ajustados para alterar a taxa de rotatividade do sistema. Até o momento, o sistema MBRA tem sido amplamente utilizado para estudar as mudanças funcionais e composicionais das comunidades microbianas em resposta a uma variedade de fatores, incluindo antibióticos¹⁰, medicamentos contra o câncer¹⁴ e vários compostos dietéticos 12,15,16,17. O design simples e modular o torna ideal para adaptação a várias necessidades experimentais. Por exemplo, o MBRA foi modificado para estudar biofilmes em condições semelhantes a quimiostatos¹⁸, demonstrando sua versatilidade para estudos de ecologia microbiana além das culturas planctônicas.

As iterações futuras do sistema MBRA podem se beneficiar de atualizações de engenharia adicionais que expandem sua funcionalidade, precisão e potencial de rendimento. Um desses aprimoramentos é a incorporação de portas adicionais em cada câmara do biorreator. Essas portas podem ser usadas para oferecer suporte ao monitoramento ativo de parâmetros ambientais, como pH, temperatura, gás ou densidade óptica. Isso resolveria uma das limitações mais significativas do modelo, permitindo feedback e monitoramento em tempo real. Melhorias na geometria da câmara ou da porta podem facilitar uma limpeza mais completa e acessível, reduzindo o acúmulo de resíduos e a descoloração e melhorando a reutilização a longo prazo. A integração de bombas peristálticas adicionais com temporizadores programáveis permitiria entradas de meios pulsados ou diurnos, simulando melhor ambientes associados ao hospedeiro, como ciclos de alimentação no intestino humano. Finalmente, a impressão 3D com materiais alternativos, como polímeros autoclaváveis quimicamente resistentes, pode permitir maior durabilidade e compatibilidade com uma gama mais ampla de reagentes. Juntas, essas melhorias podem expandir significativamente o escopo experimental e a fidelidade da plataforma MBRA.

Em conclusão, o MBRA fornece uma plataforma poderosa e de alto rendimento para cultivar e estudar comunidades microbianas sob condições controladas. Embora tenha limitações no monitoramento ativo e controle de pH, sua flexibilidade, escalabilidade e custo-benefício o tornam uma ferramenta inestimável para uma ampla gama de estudos microbiológicos, particularmente aqueles que exigem alta replicabilidade e rendimento experimental. É importante ressaltar que o design modular do sistema e a abordagem de fabricação o tornam inerentemente adaptável; os pesquisadores têm e podem continuar a adaptar o MBRA para atender a uma ampla gama de objetivos experimentais. Essa adaptabilidade garante que o MBRA possa continuar a evoluir junto com questões e tecnologias científicas emergentes, mantendo sua relevância como uma plataforma versátil para pesquisa de microbioma.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guia V-Tap, tamanhos padrão 0-80 a 5/8"	Ferramentas Big Gator	STD500NP
0,22 μ Filtro de seringa M	Pescador	SLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Acionamento de agitação (somente acionamento)	2MAG	MF 41060
Agulhas hipodérmicas Air-tite, 22G x3"	VWR	89219-274
BD 1mL Seringas Estéreis de Ponta Deslizante Estéreis	Pescador	14-823-434
Biorreator	Proto-Laboratórios	NA	Impresso em 3D a partir do DMS Somos Watershed Plastic. Veja o arquivo suplementar 1 para o modelo
Suportes de biorreatores	Proto-Laboratórios	NA	Impresso em 3D em PA 12 Black. Consulte o arquivo suplementar 2 para o modelo.
Tampa de Garrafa de Solvente Diba Omnifit Q-Series, GL38/38-430 (vidro), 2 Portas UNF(F) sem Válvulas, Azul	Cole Parmer	EW-21942-86
Tubo Diba Omnifit, PTFE, 1/8" (3,2 mm) OD x 1,5 mm ID	Cole Parmer	EW-21942-76
Adaptador Dibafit, fundo plano de 1/4"-28 UNF(M) para 3,2 mm de diâmetro, PEEK	Cole Parmer	EW-21941-49
Chave de torneira IRWIN 12001ZR #0-1/4" T-Handle	Amazona	B00004YOB0
Torneira de Fração SAE de Aço de Alto Carbono Irwin Hanson 1/4 pol. 1 peça	Zoro	G7695682
Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set 8-Fluid Ounce Bottle	Amazona	B0044F59N0
Conector Luer Lock macho para macho	Darwin Microfluídica	DM-MM-LUER-PP	Alternativa: Conector Luer Macho para Macho da Strategic Applications Inc - 10/pk - Fisher - NC9876577
Adaptadores Masterflex, Luer para Luer, Nylon, Avantor	VWR	MFLX45502-56
Conexão Masterflex, Nylon, Reta, Fêmea Luer para Adaptador de Mangueira Barb, 1/16" ID	VWR	MFLX45502-00
Adaptador de Encaixe Masterflex, Nylon, Reto, Fêmea Luer para Mangueira Barb, 3/32" ID	VWR	MFLX45502-02
Conexão Masterflex, Nylon, Reta, Fêmea Luer para Adaptadores de Barb de Mangueira, 1/8"	VWR	MFLX45502-04
Adaptador de Trava Luer para Mangueira Masterflex, Nylon, Reto, 1/8	VWR	MFLX45505-04
Conexão Masterflex, Nylon, Reta, Luer Macho x 1/4-28 UNF	VWR	MFLX45505-82
Conexão Masterflex, Polipropileno, Cotovelo, Adaptador Luer Fêmea para Luer Fêmea	VWR	MFLX45508-26
Tubulação de bomba Masterflex Ismatec, 2 paradas, Tygon S3 E-Lab, 0,89 mm de diâmetro interno	VWR	MFLX96460-26
Tubulação de bomba Masterflex Ismatec, 2 paradas, Tygon S3 E-Lab, 1,14 mm de diâmetro interno	VWR	MFLX96460-30
Masterflex® Tubo de Transferência, C-Flex, Branco Opaco, 1/8" ID x 1/4" OD; 25 pés	VWR	MFLX06424-67
Mohr' s Pinchcock para Tubulação	VWR	470201-374
Arruelas de Borracha de Neoprene ½ ” OD x ¼ ” ID x 1/16" Espessura	Amazona	B01A29F1R0
Septos de borracha de vedação de precisão	Sigma Aldrich	Z553905
Barras de agitação micro Spinbar	VWR	58948-375
Tetra-Etch	R.S. Hughest Company	TE-500
Suporte de tubulação	Proto-Laboratórios	NA	Impresso em 3D em PA 12 Black. Consulte o arquivo suplementar 3 para o modelo.
Bomba de cartucho multicanal Watson-Marlow 205S	Watson-Marlow	020.3724.00A	Com desconto, alternativa: Bombas peristálticas digitais Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 ou bomba peristáltica Masterflex Ismatec IPC, 0,1 a 11,25 rpm, 24 canais, 115/230 VCA, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH