Avaliação da aterosclerose na aorta de camundongos injetados com AAV8-PCSK9 por coloração Oil Red O

Resumo

Este protocolo descreve um método passo a passo para dissecar, perfundir, colorir, imaginar e quantificar lesões ateroscleróticas em aortas de camundongos usando coloração Oil Red O.

Resumo

Os modelos de camundongos têm sido ferramentas fundamentais no estudo da aterosclerose, fornecendo informações críticas sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à formação de placas, metabolismo lipídico e inflamação cardiovascular. Além dos camundongos Apoe^-/- ou Ldlr^-/-, a injeção de AAV8-PCSK9^D377Y em camundongos C57BL/6J normais com alimentação concomitante do tipo ocidental surge como um modelo comumente usado para pesquisa translacional em aterosclerose. A coloração Oil Red O é uma técnica fundamental para visualizar o acúmulo de lipídios neutros nos tecidos vasculares. Sua simplicidade, custo-efetividade e alta sensibilidade para detectar lesões carregadas de lipídios o tornam o padrão-ouro para avaliar a carga de placa aterosclerótica em estudos pré-clínicos. Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado e reprodutível para dissecção, perfusão, abertura longitudinal, coloração Oil Red O, imagem e quantificação semiautomatizada da carga aterosclerótica na aorta em face, sem a necessidade de pinos ou etapas complexas de montagem. Nossos resultados demonstram que a combinação de injeção de AAV8-PCSK9^D377Y e alimentação com dieta do tipo ocidental induz efetivamente a formação significativa de lesões ateroscleróticas em camundongos, e que a coloração com óleo vermelho O é uma técnica confiável e eficiente para avaliar a deposição de lipídios e a carga de placa. Além disso, embora este protocolo seja otimizado para o modelo induzido por AAV8-PCSK9 em camundongos C57BL / 6J, ele pode ser prontamente adaptado para uso em outros modelos e espécies, como camundongos Apoe ^{/ -}, camundongos Ldlr ^{/ -} e hamsters sírios dourados Ldlr ^{/ -}.

Introdução

A aterosclerose, marcada pela deposição de lipídios e inflamação na íntima arterial, representa a base patológica da doença arterial coronariana e de uma ampla gama de doenças cardiovasculares (DCV), incluindo infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral 1,2,3,4. As DCV continuam sendo a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, representando um fardo econômico e de saúde global significativo ^3,5. Como a principal base patológica da DCV, a aterosclerose tem atraído extensa atenção de pesquisa com o objetivo de descobrir seus mecanismos subjacentes e desenvolver estratégias terapêuticas eficazes. Os modelos de camundongos desempenham um papel central na elucidação dos mecanismos subjacentes à aterogênese e na avaliação de possíveis intervenções terapêuticas⁶. O desenvolvimento de modelos animais tem sido fundamental para o avanço de nossa compreensão da aterogênese, permitindo aos pesquisadores dissecar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos e avaliar estratégias terapêuticas emergentes ^6,7. Modelos murinos clássicos de aterosclerose, como camundongos deficientes em apolipoproteína E (Apoe^−/−) e deficientes em receptores de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr^−/−), têm sido empregados há muito tempo para induzir hiperlipidemia e formação robusta de placas. No entanto, a geração e manutenção dessas linhagens geneticamente modificadas requerem melhoramento extensivo, o que pode ser demorado e limitar a flexibilidade experimental ^8,9,10. Para superar essas limitações, uma abordagem alternativa utilizando o sorotipo 8 do vírus adeno-associado que codifica uma mutação de ganho de função na pró-proteína convertase subtilisina/kexina tipo 9 (AAV8-PCSK9^D377Y) ganhou destaque. Quando administrado a camundongos C57BL / 6J do tipo selvagem em combinação com uma dieta rica em gordura e colesterol do tipo ocidental, esse método induz eficientemente hipercolesterolemia e lesões ateroscleróticas em um período de tempo relativamente curto - sem a necessidade de cruzamentos genéticos complexos ou retrocruzamentos em fundos propensos à aterosclerose ^9,11. Apesar de suas vantagens, o modelo AAV8-PCSK9 tem certas limitações que merecem consideração. Notavelmente, a extensão da hipercolesterolemia e o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas podem ser influenciados por variáveis como dose viral e meios de administração, que podem introduzir variabilidade interanimais e afetar a reprodutibilidade dos resultados experimentais¹¹.

Para avaliar a carga de doença em tais modelos, a coloração com óleo vermelho O da aorta em face fornece uma técnica sensível e bem estabelecida para visualizar e quantificar lesões ateroscleróticas ricas em lipídios ao longo da superfície luminal da vasculatura^12,13. Essa abordagem oferece dados qualitativos e quantitativos e é amplamente utilizada em estudos pré-clínicos para avaliar os efeitos da manipulação genética, intervenção farmacológica ou modulação dietética¹⁴.

Neste estudo, apresentamos um protocolo prático e reprodutível para isolamento, perfusão, abertura longitudinal, coloração Oil Red O, imagem e quantificação semiautomatizada de lesões ateroscleróticas em aortas de camundongos de montagem total. Neste protocolo, AAV8-PCSK9^D377Y é administrado na dose de 5 × 10¹¹ genomas vetoriais (vg) por camundongo por meio de injeção na veia da cauda. Quando combinado com uma dieta do tipo ocidental (WD) contendo 40% de kcal de gordura e 1,25% de colesterol, o desenvolvimento robusto de lesões ateroscleróticas pode ser observado dentro de 12-16 semanas. O protocolo aqui agiliza cada etapa do processo, eliminando a necessidade de fixar tecidos em superfícies de cera e, em vez disso, empregando uma técnica de achatamento simplificada que reduz a variabilidade e a demanda técnica. O método não é apenas otimizado para o modelo induzido por AAV8-PCSK9^D377Y em camundongos C57BL / 6J, mas também é prontamente aplicável a outros modelos amplamente utilizados de aterosclerose, incluindo camundongos Apoe^-/- e Ldlr^-/-, bem como hamsters dourados sírios Ldlr^-/- 15,16,17,18,19, que surgiram como um modelo promissor devido ao seu metabolismo lipídico semelhante ao humano.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes descritas no NIH e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciência e Tecnologia da China (Aprovação Ética No. USTCACUC27120124102).

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo AAV8-PCSK9 devem ser conduzidos em um gabinete de segurança biológica certificado Classe II sob condições de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). O pessoal deve usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo jaleco, luvas descartáveis e óculos de segurança.

1. Indução de aterosclerose em camundongos

1. Injete um camundongo C57BL / 6J de 8 semanas de idade por via intravenosa com AAV8-PCSK9^D377Y (5 × 10¹¹ vg / camundongo via veia da cauda).
2. Coloque o mouse no WD (contendo 40% kcal de gordura e 1,25% de colesterol) imediatamente após a injeção.
3. Alimente o camundongo WD por 12-16 semanas para induzir a formação de lesões ateroscleróticas.
   NOTA: Um período de alimentação de 12 semanas é comumente usado e demonstrou induzir a formação evidente de placas ateroscleróticas, particularmente em modelos induzidos por AAV8-PCSK9. Durações mais longas (por exemplo, 16 semanas) podem resultar em lesões mais avançadas, e o ponto de tempo ideal deve ser selecionado com base nos objetivos experimentais específicos.
4. Monitore regularmente o peso corporal, a saúde geral e os níveis de lipídios plasmáticos durante todo o período de alimentação. Para o perfil lipídico, colete amostras de sangue no início e em pontos de tempo selecionados (por exemplo, a cada 4 semanas) por meio de sangramento submandibular ou da veia da cauda sob breve anestesia com isoflurano.

2. Eutanásia e perfusão

1. Administre pentobarbital sódico (200 mg / kg, injeção intraperitoneal) para eutanasiar o camundongo.
2. Abra a cavidade torácica para expor o coração.
3. Faça uma incisão no apêndice atrial direito e perfunda solução salina tamponada com fosfato frio (PBS, cerca de 10 mL) através do ventrículo esquerdo usando uma agulha 21 G para eliminar o sangue.

3. Dissecção da aorta

1. Remova o excesso de tecidos, como pulmões e timo, para expor a aorta torácica do coração ao diafragma.
2. Use tesouras de dissecação fina e pinças de precisão para remover o tecido adiposo circundante ao redor do arco aórtico. Eleve suavemente o tecido adiposo ao redor da base da aorta torácica perto do diafragma. Extirpar ao longo da raiz do tecido adiposo com uma tesoura de dissecação fina (garantindo que a estrutura vascular não seja danificada), continuando a dissecção para cima até o arco aórtico para expor totalmente o vaso aórtico.
   NOTA: A dissociação do tecido adiposo perivascular da aorta é crítica, e sugere-se que esta etapa seja realizada com a aorta in situ (antes de ser cortada do camundongo), pois a dissecção da gordura perivascular da aorta é tecnicamente difícil, uma vez que a aorta é dissecada e colocada em PBS.
3. Passe o vaso na base da aorta torácica usando uma tesoura de precisão. Eleve a extremidade cortada com uma pinça e disseque para cima ao longo do vaso em direção ao arco aórtico. Corte os três ramos primários da aorta a uma distância apropriada.
4. Transecto na raiz da aorta para separar a aorta torácica do coração, isolando o segmento completo para análise posterior.
5. Transfira o recipiente excisado para uma solução pré-resfriada de paraformaldeído (PFA) a 4% e incube a 4 °C durante a noite (12-16 h). Para padronizar o manuseio e facilitar o processamento em lote, coloque aortas individuais em poços de uma placa de 24 ou 48 poços durante a fixação.
   NOTA: Evite a fixação prolongada (mais de 24 h), pois a incubação excessiva em PFA pode causar endurecimento do vaso, dificultando o corte longitudinal e análises posteriores.
   CUIDADO: 4% de PFA é um fixador tóxico e volátil que apresenta riscos de exposição respiratória e dérmica. Todas as etapas que envolvem a fixação do PFA devem ser realizadas em um exaustor usando EPI, incluindo luvas de nitrilo, jaleco e óculos de segurança. Evite a inalação e o contato com a pele. A solução de PFA usada deve ser coletada em recipientes de resíduos de formaldeído designados, claramente rotulados e descartados como resíduos químicos perigosos por um serviço de descarte de resíduos químicos institucional ou licenciado.

4. Coloração Oil Red O

1. Lave as aortas fixas três vezes com PBS para remover o PFA residual.
2. Conforme mostrado na Figura 1, abra a aorta longitudinalmente sob um microscópio de dissecação usando uma tesoura fina, começando pela raiz da aorta ao longo da curvatura interna. Como alternativa, abra a aorta antes da fixação, o que pode facilitar o desdobramento e o alinhamento do vaso durante a montagem. Se necessário, abra longitudinalmente os principais ramos do arco aórtico, como a artéria braquiocefálica (ACC), a artéria carótida direita (CD) e a artéria subclávia esquerda, para expor regiões adicionais¹¹. Tome cuidado durante esta etapa, pois as placas nessas áreas podem se desprender ou ser danificadas.
   NOTA: Qualquer abordagem pode ser selecionada com base na preferência do operador e na condição do tecido.
3. Prepare a solução de trabalho Oil Red O diluindo o estoque de 0,5% em isopropanol com água deionizada na proporção de 3:2 (v/v, concentração final de 0,3%). Incubar em banho-maria a 37 °C durante 5 min para dissolver completamente o corante.
4. Filtre através de uma membrana de 0,22-0,45 μm para remover os precipitados. Manter a solução em banho-maria a 37 °C até à utilização.
5. Remova o PBS de cada poço. Adicione a solução de trabalho Oil Red O para mergulhar totalmente as aortas. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
6. Após a incubação, aspirar a solução e adicionar imediatamente 1 mL de isopropanol a 60% em cada poço. Coloque o prato em uma coqueteleira e agite suavemente para lavar.
7. Após aproximadamente 30 s, quando as áreas não lesionadas do vaso parecerem translúcidas, interrompa a lavagem aspirando o isopropanol. Enxágue as amostras duas vezes com PBS.
8. Após a coloração Oil Red O, apare ainda mais o tecido adiposo perivascular residual, se necessário. Nesta fase, o tecido adiposo é tipicamente bem corado e visualmente distinguível, o que permite uma identificação e remoção mais precisas sem comprometer a integridade da parede vascular.
9. Após a coloração Oil Red O, abra a aorta longitudinalmente e monte-a cuidadosamente em uma lâmina de vidro para obter imagens imediatas sob um estereomicroscópio.
10. Em alternativa, armazenar as amostras a curto prazo em PBS a 4 °C antes da obtenção de imagens. Para artérias difíceis de achatar, prenda os vasos em uma placa de cera preta usando agulhas finas para garantir o posicionamento e a clareza ideais. Para preservação a longo prazo, monte os vasos manchados em lâminas de vidro, sele-os com gelatina de glicerol e, em seguida, visualize-os diretamente.
    NOTA: Transfira as aortas manchadas para uma nova placa para lavagem para evitar a contaminação do óleo residual Red O.
    CUIDADO: O óleo Red O é um corante lipofílico normalmente preparado em isopropanol, que é inflamável e irritante. Manuseie as soluções ORO em uma capela de exaustão química para evitar a inalação de fumaça. Evite o contato com a pele e os olhos. As soluções de coloração Oil Red O devem ser coletadas separadamente em recipientes de resíduos químicos inflamáveis. Descarte de acordo com os regulamentos locais de descarte de resíduos perigosos.

5. Exames de imagem

1. Monte as aortas manchadas em um fundo branco para aumentar o contraste. Mantenha a flexibilidade da embarcação.
   NOTA: Um fundo de alto contraste facilita o reconhecimento de placas mais eficiente usando software de análise de imagem. Outras cores de fundo também podem ser usadas com base na preferência do usuário.
2. Visualize toda a aorta usando um scanner de mesa ou microscópio de dissecação com uma câmera de alta resolução.
3. Garanta iluminação uniforme e ampliação consistente entre as amostras (por exemplo, ampliação de 6 a 8 vezes). Se a aorta secar durante a imagem, reidratar usando lenços de kiwi mergulhados em solução salina ou PBS.

6. Quantificação de lesões ateroscleróticas

1. Abra a imagem no ImageJ. As etapas a seguir descrevem o procedimento de análise usando o ImageJ como exemplo.
   NOTA: Outros softwares de análise de imagem (por exemplo, Zeiss Zen, Fiji) também podem ser usados dependendo da preferência e disponibilidade do usuário.
2. Defina a escala usando uma referência conhecida (por exemplo, barra de escala ou régua). Use a ferramenta Linha reta para desenhar sobre a distância conhecida. Vá para Analisar > Definir escala, insira a distância e as unidades, selecione Global e clique em OK.
3. Use a ferramenta Polígono ou Seleção à mão livre para delinear toda a região aórtica.
4. Meça a área usando Analisar > Medir.
5. Identifique as áreas da placa aterosclerótica usando a imagem > ajustar > limite de cor. Ajuste a saturação e o brilho para isolar as regiões positivas do O-Red do óleo.
6. Clique em Selecionar para gerar a seleção binária de áreas manchadas. Meça as regiões selecionadas usando Analisar > Medir. Aplique as mesmas configurações de limite em todas as imagens em um lote.
   NOTA: Dado que a gordura residual ou artefatos podem resultar em coloração falso-positiva, os usuários podem optar por definir manualmente ou semiautomaticamente as regiões da placa com base em suas necessidades experimentais específicas e qualidade de imagem. O traçado manual da área da placa pode ser realizado usando o mesmo método para definir a área total do vaso.
7. Exporte os resultados (Arquivo > Salvar como > Resultados) conforme .csv para análise posterior.
8. Expresse a área da placa como área da placa/área total da aorta × 100%. Para obter uma avaliação mais precisa da carga de placa aterosclerótica, quantifique a área da placa por regiões anatômicas (por exemplo, arco aórtico, especialmente a curvatura menor e a aorta total) e expresse os resultados como a porcentagem da área da placa em relação à área total da superfície de cada respectiva região: área da placa (%) = (área da placa / área total da região) × 100%.
   NOTA: Para minimizar o viés potencial, recomenda-se a análise cega. Se estiver analisando um grande número de imagens, todo o fluxo de trabalho, desde o limite até a medição, pode ser automatizado usando o Gravador de Macros (Plug-ins > Macros > Registro) e processado em massa usando Processar > Lote > Macro. Isso permite uma análise eficiente e reprodutível de alto rendimento.

Resultados

Para avaliar a extensão da deposição de lipídios na parede da aorta, a coloração com óleo vermelho O foi realizada em aortas isoladas de camundongos machos C57BL / 6J injetados com AAV8-PCSK9^D377Y e alimentados com uma dieta ocidental por 12 semanas, juntamente com camundongos controle pareados por idade. Após perfusão sistêmica com PBS e dissecção cuidadosa, todas as aortas foram cuidadosamente dissecadas longitudinalmente e coradas com Oil Red O para visualizar lesões ateroscleróticas carregadas de lipídios....

Discussão

O método de coloração com óleo vermelho O em face descrito neste estudo oferece uma abordagem robusta, reprodutível e eficiente em termos de tempo para avaliar a carga de lesão aterosclerótica em toda a aorta. Neste estudo, selecionamos especificamente o arco aórtico e a aorta torácica como as regiões de interesse para a análise da placa, em vez de toda a aorta. Esta decisão foi guiada pela natureza do modelo AAV8-PCSK9^{D377Y 20}, que normalmente produz f...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57BL/6J	GemPharmatech	Nº N000013
4% de paraformaldeído	Beyotime	P0099	Para fixar tecidos
AAV8-PCSK9D377Y partículas virais	Wzbio	pAV208001	Para induzir aterosclerose
Pinça Fina	Ferramentas de Ciências Finas	No. 11254-20	Para dissecção da aorta
ImageJ	NIH	1.47
Isopropanol	Sangon biotech	A600918	Para limpar o excesso de óleo vermelho
Óleo Vermelho O 0,5% Solução em isopropanol	Poly Scientific R& D Corp	S1849-32OZ	Para coloração O vermelho óleo
Solução salina tamponada com fosfato	Servicebio	G4202	Para perfusão e limpeza de aortas Tesoura de
mola	Ferramentas de ciência fina	No. 15003-08	Para dissecção de aorta
Microscópio estereoscópico	Mshot	MZ62	Para dissecção de aorta e imagem
Dieta ocidental	Pesquisa	Dieta D12108C	Para induzir aterosclerose